专利名称：：一种降解黄曲霉毒素的方法
技术领域：
：本发明涉及一种降解黄曲霉毒素的方法。
背景技术：
：黄曲霉毒素(Aflatoxin,AF)，是对人类和动物危害大的真菌毒素之一。大量资料证实，黄曲霉毒素对人及动物的肝脏组织有很强的毒害作用，严重时可导致肝癌，甚至死亡。黄曲霉毒素污染食品比较严重，尤其是对花生、核桃、玉米及其制品的污染最为严重和普遍。此外，在大豆、稻谷、通心粉、牛奶及其制品、食用油等食品中也经常发现黄曲霉毒素。黄曲霉毒素不仅降低农产品和饲料品质，使经济遭受巨大损失，而且还可以通过污染或残留黄曲霉毒素的肉、乳等动物源性食品进入人体，给人的健康造成威胁。其中毒性最强的是黄曲霉毒素Bi(CnHu06，分子量312),为氰化钾的10倍，其化学结构式见式I(高桥治男.花生曲霉毒素污染途径与防除.花生科技.2000.1:37)。目前，物理化学去毒法对食品的色、香、味及营养成分如维生素、蛋白质等均有不同程度破坏和不良影响。生物化学去毒法成本较高，很难在工业化水平制备高活性黄曲霉毒素解毒活性物质。本发明的目的是提供一种降解黄曲霉毒素的方法。本发明所提供的降解黄曲霉毒素的方法，是用电子束辐照含有黄曲霉毒素的样品得到黄曲霉毒素含量降低的样品。所述方法中，所述辐照剂量为2-10kGy，优选为6-10kGy，最优选为8-lOkGy。所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素Bp所述含有黄曲霉毒素的样品为含有黄曲霉毒素的农产品或农产品加工得到的制
发明内容3品，如食品、饲料等成品。本发明的方法用电子束直接对农产品，食品，饲料等成品进行辐照，方法操作简单，效果明显，可使黄曲霉毒素Bi降解率达到71.51%。图1为黄曲霉毒素B标准品的选择离子色谱图图2为黄曲霉毒素Bi的标准曲线具体实施例方式下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例用的试剂和仪器1)所用试剂甲醇(色谱纯Fisher);甲酸(分析纯)；正己烷(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；氯化钠；超纯水。2)所用仪器Agilentll00液相系统(美国Agilent公司)；API3000三级四极杆质谱系统(美国应用生物系统)；FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；LD4-2低速离心机(北京医用离心机厂)；固相萃取装置(美国Supelco公司)；OasisHLB固相萃取柱(3cc/60mg，Waters公司)。实施例l、降低染菌花生中黄曲霉毒素B,的方法1、染菌花生中黄曲霉毒素B,检测方法的确定现已报道的对于黄曲霉毒素B,的检测方法多为高效液相色谱-荧光检测器检测方法，有诸多干扰因素，且衍生易造成实验误差。本实验用高效液相色谱-串联质谱方法(即HPLC-MS/MS检测)测定黄曲霉毒素B1，并进行方法学验证该方法的有效性。1)定性定量测定仪器和条件的选择本实验选择色谱(保留时间定性)及质谱(待测物质特征离子定性)双重检测(即HPLC-MS/MS检测)，可完全排除干扰，定性结果准确可靠。经过色谱条件的优化，选用保留时间为3.30min(如图1所示。在质谱检测时，采用ESI正离子源，选择稳定性较好和丰度大的离子(313.0/241.1、269.1)作为检测例子，使用MRM扫描方式，外标法定量。2)流动相的选择在液质联用技术中，流动相的选择除了考虑色谱系统分离效果外，必须关注分离个组分进入质谱千离子化的效率，以便获得最佳的分辨率和最高的灵敏度。由于大多数真菌毒素易溶于甲醇或乙腈，本实验分别选择甲醇和乙腈作为流动相。实验证明，选择乙腈作流动相时，色谱系统分离效果比甲醇好，但是其离子化程度受到明显抑制，离子丰度下降，导致灵敏度下降，而甲醇的离子化程度高于乙腈，且离子丰度也较高，本实验采用甲醇作为流动相。3)HPLC-MS/MS检测色谱和质谱条件如下所述质谱条件的选择本实验为获得高灵敏度的检测，分别采用ESI+和ESI-两种不同的电离方式对黄曲霉毒素B!进行检测，发现ESI+条件下，黄曲霉毒素BJ勺离子化效率明显高于ESI-条件，因此采用ESI+电离方式。对AFB,在ESI+电离方式下进行全离子扫描，获得母离子(M+H)+为313.0，并确定其二级离子，丰度最高的碎片离子为241.1、269.1。因此本实验选择ESI源，正离子反应检测模式。前级离子m/z=313.0，二级离子m/z二241.1、269.1。具体色谱和质谱条件如下所述①色谱条件Agilentll00液相系统，G1312A二元泵系统，G1367A型自动进样器。色谱柱AgelaTechnologiesInc.VenusilASB-Cl8，柱内径x柱长2.1xl50mm，填料直径5pm。流速200^1/min;流动相甲醇水(0.1%甲酸)(此处是体积百分含量为0.1%的甲酸溶液)=7:3;进样体积50|ll。②质谱条件API3000三级四极杆质谱系统；扫描方式多反应监测(MRM)，正离子分析模式；离子源TurboSpray离子源；前级离子313.0;二级离子241.1、269.1。质谱参数设置雾化气(NebulizerGas，NEB):氮气，10ml/min;窗帘气(CurtainGas，CUR):氮气，12ml/min;电离电压(IonsprayVoltage,IS):5500V;加热温度(Temperature,TEM):500°C;碰撞气(CollisionGas，CAD):氮气，8ml/min;去集簇电压(DeclusteringPotential,DP)70V;聚焦电压(FocusingPotential,FP):300V;入口电压(EntrancePotential,EP):10V;碰撞能(CollisionEnergy,CE):45V;碰撞池出口电压(CollisionCellExitPotential,CXP):9V。4)样品定容液的选择样品定溶液组分直接影响黄曲霉毒素在色谱柱中的分离程度和离子化效率，即质谱的灵敏度。通过实验证实，甲醇、乙腈作为定容液，均会干扰黄曲霉毒素Bi的出峰信号，分离度差；而甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为5:5)作为定容液可使黄曲霉毒素B,的丰度较其他定容液均有不同程度的增高，且峰形变好，分离度提高。因此，选用甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为5:5)作为定容液。5)标准曲线黄曲霉毒素BJ示准储备液的配制用甲醇将黄曲霉毒素BJ示准品(购于美国Sigma-Aldrich公司，纯度>97%)配制成100mg/L标准储备液，4'C避光保存。黄曲霉毒素B,标准工作液的配制用甲醇与水的混合液(甲醇与水的体积比为5:5)稀释标准储备液配制成O.l、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50吗/L黄曲霉毒素Bl标准工作溶液。准确吸取O.l、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50pg/L黄曲霉毒素Bl标准工作溶液50^1，HPLC-MS/MS分析，得到黄曲霉毒素B,峰面积对浓度进行线性回归，即得标准曲线，如图2所示。6)检测限和定量限按3倍信噪比计算，当样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度即可作为最低检测限。当样品组分的响应值等于基线噪声的10倍时，该样品的浓度即可作为最低定量限。当黄曲霉毒素B!浓度为0.03^ig/kg时，S/N=3.2，故方法的最低检测限约为0.03pg/kg;当黄曲霉毒素Br浓度为0.1pg/kg时，S/N=10.2，故方法的最低定量限约为0.1pg/kg。7)回收率及精密度评价取同一未染菌花生样品为本底，添加lpg/kg、25pg/kg、50(Hig/kg黄曲霉毒素B,(AFB。后，HPLC-MS/MS分析测定其回收率，并计算精密度，结果如表1所示。表l.黄曲霉毒素Bi添加回收率和精密度6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、电子束辐照降低黄曲霉毒素B!及其效果验证将黄曲霉菌(^s;"g/〃^/7av^)ATCC11498(购自美国菌种保藏中心ATCC，11498号菌株)接种于察氏培养基((硝酸钠2g，磷酸氰二钾lg，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁O.Olg，蔗糖30g，琼脂15-20g，水1000ml)斜面，温度28°C，湿度50%，培养7天，待斜面长满黄绿色菌丝，菌丝上略生孢子时，用无菌水制成孢子悬浮液(107cfii/ml)。将5g花生在紫外灯下照射30min灭菌后，加入5ml无菌水(121°C，20min)，然后加入孢子悬浮液lml混匀，在温度28。C，湿度50%，培养7天得到感染黄曲霉菌的花生。取6份上述获得的感染黄曲霉菌的花生样品，分别置于一个100ml聚丙烯离心管(材质为99.9%生物级聚丙烯，耐辐射)中密封，放入电子束辐射场(清华大学SML5520型电子直线加速器)内进行辐照处理，辐照剂量分别设定为OkGy(不辐射对照)，2kGy，4kGy，6kGy，8kGy，10kGy。加速器产生的电子束能量为4.5MeV，束流功率为2.5kW。剂量率为0.1kGy/s。上述实验重复三次。4、黄曲霉毒素Bi的含量的检测将经步骤3处理后的花生样品检测黄曲霉毒素B,的含量，具体方法如下所述1)提取分别在装有上述辐照后的花生样品和装有未辐照花生样品置于100ml离心管，加入50ml体积百分含量为60X的甲醇的水溶液，5gNaCl，10ml正己烷，摇匀，放入离心机中离心提取30min。提取后，用定量滤纸过滤，入分液漏斗静置分层，取5ml下层溶液进行如下净化。2)净化将OASISHLB固相萃取柱(购自Waters,货号WAT094226)置于真空固相萃取装置(购自AgelaTechnologies,货号M0401001)上，加2ml甲醇活化，待甲醇至OASIS小柱吸附剂(此吸附剂是属于固相萃取柱自带)上层时，再加2ml纯水平衡小柱，然后加上述得到的下层溶液5ml过柱，流速为lml/min，加入3ml纯水淋洗OASIS小柱两次，后用2ml体积百分含量为30%的甲醇的水溶液，淋洗OASIS小柱以除去杂质，用真空泵抽干。最后以lml甲醇洗脱，洗脱液用纯水定容至2ml，待分析。3)LC-MS检湖!)LC-MS分析分别注入50pL适当浓度的黄曲霉毒素Bi标准溶液及步骤2)定容得到的样品分别于高效液相色谱串联质谱仪(LC-MS)中，按步骤l所述分析条件进行分析，记录峰面积。根据标准样品的保留时间定性，外标法定量。经过2kGy，4kGy，6kGy，8kGy或10kGy吸收剂量辐照的染菌花生样品，经提取、净化、进LC-MS分析后样品中的黄曲霉毒素Bi的峰面积，结合标准曲线换算成样品溶液的浓度，计算出溶质的质量，然后除以称取的花生的质量，得到降解后的折合浓度。降解率由不同吸收剂量下的折合浓度与未辐照时的折合浓度相比得出。己计算的未辐照的染菌花生中黄曲霉毒素B,的污染浓度为64吗/kg。上述计算数据为三次重复的平均值。结果如表2所示，结果表明，经电子束辐照后，黄曲霉毒素Bi降解率可达71.51%。我国GB2761-2005《食品中真菌毒素限量》规定黄曲霉毒素B,的限量为<20pg/kg;而国际上关于总黄曲霉毒素的含量一般都小于15^ig/kg，对黄曲霉毒素B,的限量要求更低。花生黄曲霉毒素B,污染水平一般为6-400^ig/kg，因此，利用电子束辐照处理8kGy就能够有效减低花生黄曲霉毒素B,54%左右，10kGy的能够有效减低花生黄曲霉毒素B口1.5P/。左右，对出口贸易具有现实的应用价值。表2.染菌花生中黄曲霉毒素B,的辐照降解<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种降解黄曲霉毒素的方法，是用电子束辐照含有黄曲霉毒素的样品得到黄曲霉毒素含量降低的样品。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述辐照剂量为2-10kGy。3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述辐照剂量为6-10kGy。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述辐照剂量为8-10kGy。5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B,。6、根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述含有黄曲霉毒素的样品为含有黄曲霉毒素的农产品和/或农产品加工得到的制品。全文摘要本发明公开了一种降解黄曲霉毒素的方法。该方法，是用电子束辐照含有黄曲霉毒素的样品得到黄曲霉毒素含量降低的样品。本发明的方法可以直接对农产品，食品，饲料等成品进行辐照，方法操作简单，效果明显，可使黄曲霉毒素B<sub>1</sub>降解率达到71.51％。文档编号A23L1/015GK101485408SQ20091007870公开日2009年7月22日申请日期2009年3月2日优先权日2009年3月2日发明者哈益明,尹青岗,安李,静杨,锋王,王志东申请人:中国农业科学院农产品加工研究所