酸盐缓冲液，混匀后用50K超滤管在3000r/min，4°C条件下离心1min ;重复以上步骤三次，使最后一次CRP和PCT抗体溶液总体积不超过50 μ I。用微量PH计检测最终pH并调节pH值至8.5。将步骤3处理的量子点和抗体分别混合，混匀后在摇床上反应6h，反应温度23?25°C。反应结束后用superdex 200分离量子点-CRP复合物并用100K超滤管将复合物浓缩到200 μ I以内，测蛋白浓度后加入总浓度为lmg/ml的Gly后放于4°C保存。
[0051]4.样品的检测:
[0052]I)准备好血清及二抗后，取出抗原片，平衡至室温。
[0053]2)用PBS洗3次(放入PBS溶液中均匀缓慢晃动)，每次3分钟，每孔滴加15ul血清(阳性质控孔中加入甲型流感病毒血凝素抗体)，37°C温育60min。
[0054]3)用PBS清洗3次(放入PBS溶液中均匀缓慢晃动)，每次5分钟，用纯化水缓慢水流冲洗玻片(注意不要冲入玻片孔中)。
[0055]4)待瞭干后，每孔滴加量子点标记抗人IgM抗体15ul (阳性质控孔中加入甲型流感病毒血凝素抗体-抗抗体)，37°C温育30分钟。
[0056]5)孵育完成用PBS清洗3次(放入PBS溶液中均匀缓慢晃动)，每次5分钟，用纯化水缓慢水流冲洗玻片(注意不要冲入玻片孔中)。
[0057]6)待晾干后盖上盖玻片，封片镜检。
[0058]7)利用计算机对扫描图片进行镜检和分析:首先扫描抗原片上行，对时间进行记录，逐个玻片孔进行扫描检测，待上行扫描完毕再对下行玻片孔进行扫描。
[0059]结果分析:
[0060]有效性判断:阳性质控孔中出现红色荧光，表明抗原片并未失效，无红色荧光则可能试剂盒失去效力或者有人为操作失误出现。
[0061]阴性质控孔中无明显荧光出现，表明病人血清没有特异性与细胞结合；若有绿色荧光出现，可能病人血清中含有与细胞特异性结合的成分，结果可能不可取。
[0062]结果判断:阳性结果:可观察到呼吸道合胞病毒、肺炎支原体孔中出现红色荧光；腺病毒、肺炎衣原体孔中出现蓝色荧光；人感病毒、嗜肺军团菌中出现黄色荧光、副流感病毒、柯萨奇病毒中出现深红色荧光；埃可病毒中出现绿色荧光。
[0063]阴性结果:玻片孔中无荧光出现。
[0064]其中，所述包被优选方法为:1.用质量体积比5%的磷壁酸水溶液处理玻片1min,处理完毕倒出剩余液体。2.将细胞悬液滴加在拨片孔中，细胞悬液滴加前置超声波震荡10s-20s。3.紫外照射10min-15min，冷丙酮固定lOmin。4.50%甘油水溶液浸润5min。5.吹干后冷冻保存待用。
[0065]其中，所述的化学交联法优选为，使用EDC/NHS交联法对蛋白质进行量子点的修饰。修饰方案为优化过的方案，其中关键步骤包括:
[0066]I)用新的磷酸盐缓冲液清洗量子点，充分去除量子点原保存缓冲液，使量子点达到指定pH值，并用超滤法浓缩到指定浓度。
[0067]所述磷酸盐缓冲液浓度为10mmol/L，pH = 7.2?7.5，不含其它任何成分；量子点最终所达到的pH在7.2?7.5之间。所述超滤法指用10K超滤管在5000r/min，25°C条件下离心6min。
[0068]2)用EDC和NHS活化量子点表面羧基，严格控制EDC、NHS与量子点的摩尔比、反应时间和温度；
[0069]所述需严格控制的条件是:EDC、NHS与量子点的摩尔比应为25000: 5000: 1，温度为23?25°C，反应时间为60min。所述EDC和NHS不能配制成溶液使用，用分析天平称量后应迅速加入反应液中，注意EDC和NHS在低温干燥条件下称量。
[0070]3)用硼酸盐缓冲液再次清洗活化后的量子点，以充分去除EDC和NHS，用超滤管超滤浓缩后将活化后的量子点保存于新的PH环境中；
[0071]所述硼酸盐缓冲液浓度为50mmol/l，pH = 8.5，量子点和免疫球蛋白最终所达到的pH为8.5 ;所述超滤法指用10K超滤管在5000r/min, 25°C条件下离心6min。所述新的pH环境指浓度为50mmol/L，pH = 8.5硼酸盐缓冲液环境。
[0072]4)用硼酸盐缓冲液充分清洗待用免疫球蛋白，并用超滤管多次低速超滤浓缩以去除蛋白原保存液中的NaN3，并使免疫球蛋白处于指定的pH环境中。
[0073]所述硼酸盐缓冲液浓度为50mmol/L，pH = 8.5，量子点和免疫球蛋白最终所达到的pH为8.5 ;所述超滤法指用50K超滤管在3000r/min, 4°C条件下离心1min ;指定的pH环境浓度为50mmol/L，pH = 8.5硼酸盐缓冲液环境。
[0074]5)将活化的量子点和免疫球蛋白按照特定比例混合，同时不断晃动，在指定温度下反应特定时间；
[0075]所述量子点于免疫球蛋白的摩尔比为1:10，反应时间为6h。I微摩尔量子点所对应的免疫球蛋白偶联反应总体系为1.25微升，此体系根据需要可等比例放大。
[0076]反应结束后用排阻层析分离量子点免疫球蛋白复合物和过量的免疫球蛋白。量子点免疫球蛋白复合物用超滤管浓缩到指定浓度并加入硼酸盐配制的Gly封闭液，4°C度保存，严禁冻存。所述排阻层析柱填料为superdex200或Sephacryl 300，流速为1.5ml/min。Gly封闭液达到的终浓度为lmg/ml。若长期保存需加入0.0 lmg/ml的NaN3。
[0077]本发明的优点有:可以同时检测九种呼吸道病原体，呼吸道病原体检测操作简便，样本和量子点标记二抗的孵育在25°C _37°C下即可完成，无需其他额外设备，2小时便可完成整个检测。利用量子点的多色性，实现电脑自动识别区分病原体，可以更好、更准确的检测不同病原体。选用的五种波长的量子点，每种颜色波长之间相距30nm以上，可以清晰的分辩出五种颜色，更有利于计算机的自动判读。
[0078]上述内容，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限制本发明的实施方案，本领域普通技术人员根据本发明的主要构思和精神，可以十分方便地进行相应的变通或修改，故本发明的保护范围应以权利要求书所要求的保护范围为准。
【主权项】
1.一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 第一步，对病原体进行包被，并进行增殖培养； 第二步，设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴极质控孔中，做阴极对照，将吸附有病毒的MDCK细胞包被在玻片阳极质控孔中，做阳极对照； 第三步，用化学交联法将量子点与抗人IgM的特异性抗体连接，得到量子点修饰抗体； 第四步，利用计算机对扫描图片进行镜检和分析。
2.如权利要求1所述的基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，所述的第一步中病原体增殖培养，培养至病原体细胞长至80%单层。
3.如权利要求1所述的基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，所述的玻片上设有凹槽，所述凹槽底部设有纵横分布的条纹。
4.如权利要求1所述的基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，所述的病原体包被包括以下步骤: 第一步，用体积比5%的磷壁酸溶液处理玻片； 第二步，将病原体细胞悬浮液用超声波震荡10至20秒，然后将细胞悬浮液滴加在玻片孔中； 第三步，将细胞悬浮液用紫外线照射10至15分钟，然后用冷丙酮固定10分钟； 第四步，用体积比为50%的甘油溶液浸润5分钟； 第五步，吹干后冷冻保存待用。
5.如权利要求1所述的基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，所述的量子点包括单一化合物的量子点和核壳型量子点。
6.如权利要求1所述的基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其特征在于，所述的化学交联法为EDC/NHS交联法。
【专利摘要】一种基于量子点间接免疫荧光的病原体检测方法，其包括如下步骤：第一步，对病原体进行包被，并进行增殖培养；第二步，设置质控孔，将无吸附病毒的MDCK细胞包被在玻片阴极质控孔中，做阴极对照，将吸附有病毒的MDCK细胞包被在玻片阳极质控孔中，做阳极对照；第三步，用化学交联法将量子点与抗人IgM的特异性抗体连接，得到量子点修饰抗体；第四步，利用计算机对扫描图片进行镜检和分析。本发明的一种基于量子点间接免疫荧光标记方法，其灵敏度高、自动化强、细胞固定稳固等优点。
【IPC分类】G01N33-569, G01N33-542
【公开号】CN104634969
【申请号】CN201510081033
【发明人】张二盈
【申请人】深圳市金准生物医学工程有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年2月13日