一种运用免疫层析技术一步检测唾液中毒品四项的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用免疫层技术一步检测唾液中的毒品四项(MET/C0C/M0P/KET)的方法。
【背景技术】
[0002]本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种运用免疫层析运用技术一步检测唾液中毒品四项的方法。
[0003]甲基安非他明(甲基苯丙胺，又称去氧麻黄素，俗称“冰毒”)是一种拟交感胺药，具有典型的精神兴奋作用，通常用来口服、静脉注射或鼻吸。服用后可增加心率、血压并抑制胃口，造成易激动性和焦虑，长期或大量服用甲基安非他命者会产生耐受性及躯体依赖，还会导致滥用。服用甲基安非他命(甲基苯丙胺)后，主要以未变的原药在尿液中被排泄出来(44%)，少量(6%)变成苯丙胺。
[0004]吗啡(Morphine)是由阿片提炼的一种阿片生物碱，为纯粹的阿片受体激动剂，故在医学上，吗啡为麻醉性镇痛药。该类物质过量使用造成急性中毒，极易产生耐受性和成瘾。吗啡主要经肾脏以尿液形式排泄，吗啡原型占2-12%，大部分(占60-80%)为吗啡-葡萄糖酸甙。阿片类毒物(包括阿片、海洛因、吗啡、可待因)进入体内后主要经肝脏代谢并快速去酰化成06-单乙酰吗啡，进一步分解为吗啡。
[0005]可卡因，又称古柯碱，是一种中枢神经兴奋剂，具有典型的神经兴奋作用，通常的使用方式是以香烟吸服、放在锡箔上“嘬”或者静脉注射等。服用可卡因只有1%以原药形式在尿液中被排泄出来，其中25%-40%代谢成为苯甲酰爱康宁，18-22%成为爱康宁甲酯，2%-3%代谢成为爱康宁从尿液中排出体外。本试剂操作简单，不需任何仪器，能快速、灵敏地检测吸食可卡因后唾液中可卡因，其灵敏度为300ng / ml，特别适用于戒毒所、医院、部队征兵和单位招工体检、滥用毒品普查、娱乐场所检查等。
[0006]氯胺酮(Ketamine,KET)是苯环己哌唳(N-l-phenycyclohexy-piperidine, PCP)的衍生物，医学上作为外科手术麻醉剂，黑市上俗称“K粉”、“K仔”。近年来在娱乐场所滥用日趋严重，严重威胁健康。氯胺酮通常的使用方式以香烟吸服、鼻吸、静脉注射或将粉末溶入饮料中进行饮用。人体服用的氯胺酮有70%—90%在肝内代谢并经尿液排出，其在体内的代谢较快，清除半衰期约为2.5小时，一般在吸食后2 - 4小时内即可被检出。
[0007]本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测唾液中冰毒、可卡因、吗啡、K粉四项联检的方法，灵敏度分别能够达到100ng/ml、300ng/ml、300ng/ml、100ng/ml,不仅能够节约成本还能提示更多的样本信息。
【发明内容】
[0008]本发明目的:开发简单、快速一步检测吸毒者唾液中毒品四项(MET/C0C/M0P/KET)残留的方法，具有更好的经济价值和社会价值。本发明公开了一种采用胶体金免疫层析法，快速检测口腔中毒品残留物的方法。
[0009]本发明是通过以下技术方案实现的:采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，分别标记MET抗体、COC抗体、MOP抗体、KET抗体后混合，稀释混匀并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，四个不同浓度的BSA-MET偶联物、BSA-COC偶联物、BSA-MOP偶联物、BSA-KET偶联物固定于四个检测线(即Tl、T2、T3、T4线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、样品处理垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断检测结果。
[0010]本发明方法包括如下步骤:
一、胶体金溶液配制
1.配制2.5%氯金酸溶液；
2.配制2.5%柠檬酸三钠溶液；
3.将0.025%的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2.5%的柠檬酸三钠ImL ；
4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸10min；
停止加热，继续搅拌至室温。
[0011]二、胶体金标记物的制备
1.取八个1.5 mL试管，分别加入I mL胶体金溶液；
2.加入适量K2COjEpH调整为8.0 ;
3.其中两个管各加入5μ g/mL MOP抗体、两个管各加入12 μ g/mL MET抗体、两个管各加入8 μ g/mL KET抗体、两个管各加入9 μ g/mLCOC抗体抗体混勻,振荡30 min ；
4.加入20μ L的10%BSA，混匀，振荡30 min ；
5.8000 rpm离心5 min,轻轻吸除上清；
6.用10mL胶体金复溶液重悬浮胶体金沉淀制成浓缩液；
7.用复溶液将上述浓缩液稀释到适当的比例；
8.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。
[0012]三、在硝酸纤维素膜上划线
1、Tl线用浓度为0.5mg/mL的MET-BSA偶联物划线，用于检出1000ng/ml的的甲基安非他明(冰毒)；
2、T2线用浓度为0.8mg/mL的COC-BSA偶联物划线，用于检出300ng/mL的可卡因；
3、T3线用浓度为0.75mg/mL的的M0P-BSA偶联物划线，用于检出300ng/mL的吗啡；
4、T4线用浓度为0.5mg/mL的的KET-BSA偶联物划线，用于检出1000ng/mL的氯胺酮(K 粉)；
5、C线用2.0 mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；
4.将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥4h。
[0013]四、样品垫的处理制备
1、配制PH8的硼酸盐冲液；
2、在硼砂硼酸缓冲液中加入NAC1、Tween20,tritonX-100、酪蛋白钠、使其终浓度分别为 0.9%、0.2%、0.2%、0.2% ；
3、将上述溶液按照一定比例铺在样品垫上，40°C烘箱干燥8h。
[0014]五、胶体金试纸条的组装 1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1);
2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。
[0015]六、检测
试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后,根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与Tl、T2、T3、T4线均出现红色指示线表明唾液样本中冰毒、可卡因、吗啡、和K粉水平均小于其对应的最低检出量(见附图2);(:线出现红色指示线，11、了2、了3、丁4线不显色表明唾液样本中冰毒、可卡因、吗啡、和K粉水平均高于其对应的最低检出量(见附图3);C线出现红色指示线，Tl线均不显色，T2、T3、T4线出现红色指示线，表明样本中的冰毒大于最低检出量1000ng/mL，而可卡因、吗啡、K粉均小于其对应的最低检出量(见附图4)；C线出现红色指示线，Tl、T2线均不显色，T3、T4线出现红色指示线，表明样本中的冰毒大于最低检出量1000ng/mL，样本中可卡因大于最低检出量300 ng/mL，而吗啡、K粉均小于其对应的最低检出量(见附图5) ;C线出现红色指示线，Tl、T2、T3线均不显色，T4线出现红色指示线，表明样本中的冰毒大于最低检出量1000ng/mL，样本中可卡因大于最低检出量300 ng/mL，样本中吗啡大于最低检出量300 ng/mL，而K粉均小于其对应的最低检出量(见附图6) ;C线、Tl线出现红色指示线，T2、T3、T4线均不显色，表明样本中的冰毒低于最低检出量1000ng/mL，样本中可卡因低于最低检出量300 ng/mL，而样本中吗啡大于最低检出量300 ng/mL，而K粉均大于其对应的最低检出量1000ng/ml (见附图7) ;C线、Tl、T2、T3、T4线均不显色或者仅C线不显色、仅T线出线，表明试纸无效(见附图8、附图9)。
[0016]本发明有益效果是:提供一种运用免疫层析技术一步检测唾液中毒品四项(MET/C0C/M0P/KET)新型试纸。检测速度快，所需时间短，只需5min —次检测唾液样本中的冰毒、可卡因、吗啡、K粉四个指标，给出样本更多的信息，灵敏度更高。不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测，满足医院、公安或戒毒机构的检测要求，并且便于基层推广和运用。
【附图说明】
图1是本发明实施例试纸条的图
图2是本发明实施例试纸条的全部阴性结果(MET/C0C/M0P/KET水平均小于最低检出量)图
图3是本发明实施例试纸条的阳性结果(MET/C0C/M0P/KET水平均大于最低检出量)
图
图4是本发明实施例试纸条的Tl阳性，T2、T3、T4阴性(MET大于最低检出量，C0C/M0P/KET水平均小于最低检出量)结果图
图5是本发明实施例试纸条的T1、T2阳性，Τ3、Τ4阴性(MET、C0C大于最低检出量，MOP/KET水平均小于最低检出量)结果图
图6是本发明实施例试纸条的Tl、T2、T3阳性，T4阴性(MET、C0C、MOP大于最低检出量，KET水平均小于最低检出量)结果图
图7是本发明实施例试纸条的T2、T3、T4阳性，Tl阴性(MET、C0C、MOP大于最低检出量，KET水平均小于最低检出量)结果图图8是本发明实施例试纸条的无效(C线不出线)结果图图9是本发明实施例试纸条的无效(C线不出线)结果图。
【主权项】
1.一种运用免疫层析技术一步检测唾液中毒品四项的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记冰毒抗体、可卡因抗体、吗啡抗体、K粉抗体并均匀涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物；在硝酸纤维素膜上，分别将特定浓度的MET-BSA、COC-BSA,MOP-BSA、KET-BSA偶联物固定于四个检测线(即Tl、T2、T3、T4线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线);依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中；金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种运用免疫层析技术一步检测唾液中毒品四项的方法，其特征在于，抗体划线浓度为: Tl线用浓度为0.5mg/mL的MET-BSA偶联物划线，用于检出1000ng/ml的冰毒； T2线用浓度为0.8mg/mL的COC-BSA偶联物划线，用于检出300ng/mL的可卡因； T3线用浓度为0.75mg/mL的的M0P-BSA偶联物划线，用于检出300ng/mL的吗啡； T4线用浓度为0.5mg/mL的的KET-BSA偶联物划线，用于检出1000ng/mL的K粉； C线用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线； 将硝酸纤维素膜置于40°C烘箱干燥4h。
3.根据权利要求1所述的一种运用免疫层析技术一步检测唾液中毒品四项的方法，其特征在于，运用特定浓度的抗原溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测唾液中毒品四项的方法。
【专利摘要】本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是运用免疫层析技术一步检测唾液中四种毒品的方法。甲基安非他明是一种拟交感胺药，吗啡是一种阿片生物碱，可卡因是一种中枢神经兴奋剂，氯胺酮是苯环己哌啶的衍生物，这四类物质具有典型的神经兴奋作用，通常以香烟吸服、鼻吸、静脉注射或将粉末溶入饮料中饮用等方式摄入，过量食用会造成急性中毒，产生耐受性及躯体依赖，导致滥用，严重威胁健康。本发明采用胶体金免疫层析法，可快速检测唾液中冰毒、可卡因、吗啡、K粉四项毒品。灵敏度分别可达到1000ng/ml、300ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml。不仅能够节约成本，而且便于检测，还能提示更多的样本信息。
【IPC分类】G01N33-94, G01N33-558
【公开号】CN104634967
【申请号】CN201410704207
【发明人】司英杰, 李梅, 刘寅, 向荣, 王昊, 张贤强, 张贤刚, 朱正宇, 李亚峰
【申请人】德康润生物科技（天津）有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年11月30日