专利名称：一种人心肌肌钙蛋白i适配子及筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种人心肌肌钙蛋白I适配子，尤其是一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用。
背景技术：
急性心肌梗死(AMI)是我国病死率很高的心血管疾病之一，其早期诊断和及时治疗是降低死亡率的关键。心肌肌钙蛋白I以其高度的灵敏性和组织器官特异性及较长的诊断窗口期在AMI和其他心脏疾病的诊断中显示出其特殊的优越性，并将其作为急性心肌梗死检测的“金标准”。核酸适配子是一类近年来出现的生物分子人工配体，通过体外筛选技术从大容量 的单链寡核苷酸文库中筛选出高亲和力及特异性的心肌肌钙蛋白I适配子，将其与电化学技术相结合，构建心肌肌钙蛋白I适配子传感器，为急性心肌梗死的早期诊断奠定基础。因此，急需大量能与心肌肌钙蛋白I特异性结合且具有高亲和力及特异性的心肌肌钙蛋白I适配子。目前，SELEX技术是一种新的组合化学技术，虽然也可以通过该技术进行筛选获得心肌肌钙蛋白I适配子，但是目前一般SELEX筛选循环数为8-15轮，轮数太少，得不到高亲和力的适配子，轮数太多，浪费人力、物力及时间。通过检索，发现一篇与本发明申请相关的如下专利公开文献人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子及应用(CN1974594A)，该发明公开了具有三种核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，该种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子可以在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上应用或用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化，本发明人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，成本低；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感，因此，具有良好的应用前景。通过对比，本发明申请与上述专利公开文献有本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用，该心肌肌钙蛋白I适配子能与心肌肌钙蛋白I特异性结合，具有高亲和力及特异性强的特点，该心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法进行12轮筛选即可得到足量和高纯度的ssDNA文库，得到高亲和力的适配子，轮数较少、节约了人力、物力及时间。本发明实现目的的技术方案是一种人心肌肌钙蛋白I适配子，具有序列表中SEQ ID No. I所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 4所述的核苷酸序列。
而且，所述SEQ ID No. I所述的核苷酸序列具有下述结构
权利要求
1.一种人心肌肌钙蛋白I适配子，其特征在于具有序列表中SEQ ID No. I所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No. 4所述的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的人心肌肌钙蛋白I适配子，其特征在于所述SEQID No. I所述的核苷酸序列具有下述结构
3.—种如权利要求I所述的人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法，其特征在于步骤如下 ⑴合成随机ssDNA文库 合成长度为81bp的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列；P81 库5，-CGG GAA TTCTAT GGC GGA TGG GAG CGAN19GCC GCA AGA AAAAGT TTG AGAGCAAGC TTC CG-3'。
其中上游引物为序列5 ;下游引物为序列6 ； ⑵人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选 将人心肌肌钙蛋白I按照表I中的量包被，包被液为pH9. 6,0. 05mol/LNaHC03,于4°C过夜，同时设空白对照孔，其样品孔和空白对照孔均加入50ii L3%BSA封闭2h，4°C过夜；将合成的随机ssDNA文库配制成浓度为100 u mol/L的溶液；将200 u L结合缓冲液与随机ssDNA文库按照表I中的文库量进行混合，在90°C下加热变性5min后，迅速置于冰上lOmin，然后室温变性15min ；再将已变性的ssDNA先与由3%BSA封闭的空白对照孔结合，37°C孵育，然后转移到人心肌肌钙蛋白I包被孔与人心肌肌钙蛋白I结合，37°C孵育40min，反筛除去与BSA结合ssDNA ； 用洗涤缓冲液洗涤，洗去未结合心肌肌钙蛋白I的ssDNA ； 在人心肌肌钙蛋白I与ssDNA结合的孔中加入洗脱缓冲液，80°C下培养lOmin，洗脱下与人心肌肌钙蛋白I结合的ssDNA ； 向洗脱液中加入等体积的酹氯仿抽提，震荡混勻后4°C、IOOOOrpm离心5min,吸上清，向上清中加入2倍上清液体积的无水乙醇沉淀ssDNA, 4°C、IOOOOrpm离心5min,弃去上清，用lmL70%乙醇洗涤沉淀，37°C倒置烘干； 将沉淀溶解于20 y L TE缓冲液中，贮存于_20°C，作为PCR反应的模板； ⑶PCR扩增单链DNA过程 PCR扩增引物上游引物序列5 ;下游引物序列6 ； 扩增模板为步骤⑵中洗脱纯化的ssDNA，其扩增的反应条件为94°C预变性3min ;然后，94°C变性45s，60°C退火30s，72。。延伸40s，12个循环;最后，72°C延伸7min ；反应体系 25 ii L ssDNA 模板 I ii L, IOXPCR Buffer2. 5 u L, MgCl2L 5 u L, IOmM 的dNTPs2. 5 u L, IOpmo I的上、下游引物各2 y L，，Taq酶0. 2 y L，灭菌双蒸水13. 3u L ； ⑷不对称PCR制备ssDNA次级文库 上游引物序列7 ;下游引物序列8 ;上游引物:下游引物的比例为80 1 ； 扩增模板为步骤⑶中的PCR扩增产物，其扩增的反应条件为94°C预变性3min ;然后，94°〇变性458，601退火30s，72。。延伸40s, 40个循环；最后，72°C延伸7min ；反应体系 25 ii L ssD NA 模板 I ii L, IOXPCR Buffer2. 5 u L, MgCl2L 5 u L, IOmM 的dNTPs2. 5 u L，IOpmol的上游引物和下游引物的量共为4 y L，Taq酶0. 2 y L，灭菌双蒸水13. 3u L ； 表I心肌肌钙蛋白I蛋白适配子的12轮筛选的参数
4.权利要求I或2所述的人心肌肌钙蛋白I适配子在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化。
全文摘要
本发明涉及一种人心肌肌钙蛋白I适配子，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。本发明的人心肌肌钙蛋白I(心肌肌钙蛋白I)适配子与cTn I结合的亲和力高、特异性强，提高了在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化的灵敏性。
文档编号C07K14/47GK102703455SQ20121022778
公开日2012年10月3日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者刘珺, 张娟琨, 徐锦锋, 蒋树海 申请人:天津科技大学