一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种增强抗癌免疫的试剂盒，尤其设及一种用于激活黑色素瘤特异性 免疫反应的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 黑色素瘤是由异常黑素细胞过度增生引发的常见的皮肤肿瘤，恶性程度极高，占 皮肤肿瘤死亡病例的极大部分，多发生于皮肤或接近皮肤的黏膜，也见于软脑膜和脉络膜， 其发病率随人种、地域、种族的不同而存有所差异，但近年来发病率却呈不断上升趋势，每 年美国有25000个恶性黑素瘤新增病例，死亡约6000人，发病率在急速上升。
[0003] 自进入二十一世纪W来，分子生物学与免疫学的长足进步为临床肿瘤治疗提供了 新的策略。通过分子生物学的手段已鉴定出大量的肿瘤细胞特异性的抗原，并通过生物信 息学的手段分析出其被免疫细胞识别的位点，运为重建患者的肿瘤特异性免疫反应带来的 可能。但是最近十年W来的一系列临床试验结果显示，W肿瘤特异性抗原肤为基础的肿瘤 疫苗的临床效果令人失望，其中一个重要的原因是抗原提呈过程的缺陷。
[0004] XiZhao等人用慢病毒感染的DC细胞使其持续性高表达外源性IL12,发现 DC.IL12细胞能够高效的诱导抗原特异性CTL细胞的产生，将DC.IL12与肿瘤抗原肤回输至 小鼠体内可显著性的缩小肿瘤肿块。感染空载病毒的DC细胞并不能有效的激发相应的免 疫反应，回输后对小鼠的肿瘤大小无显著性的影响。该研究提示了高表达IL12的DC细胞 对于肿瘤疫苗发挥其抗癌临床作用的重要性。 阳0化]DC细胞是哺乳类动物体内具有抗原提呈能力的一类细胞，其主要功能是摄取、加 工处理和递呈抗原，激活或调节适应性免疫应答。T细胞因此被激活而生成MHC-I类限制性 CD8阳性细胞毒性T细胞（切totoxicTIympho巧te，CTL)和MHC-II类限制性的CD4阳性的 一型T辅助细胞（typelThelper,Thl)。一型极化树突状细胞（Typel化IarizedDen^itic cell,DC1)是成熟DC细胞的一类亚群，具有强有力的免疫激活能力。DCl细胞的重要的特 征是高表达IL12P70W及免疫激活共刺激分子，可高效的激活抗原特异性的CD8+T细胞和 CD4+Thl细胞相关的免疫反应。Ro化ieB.Mailliard等证实了DCl体外诱导黑色素瘤抗原 特异性的CTL细胞的能力可达到正常的成熟DC细胞的40倍W上。A化ianaTLarregina 等人还发现DCl细胞诱导B16黑色素瘤抗原特异性CD4+辅助性T细胞，并且促进CD4+辅 助性T细胞对肿瘤组织的浸润。因此，高表达IL12的DCl细胞负载肿瘤特异性抗原肤可W 为增强抗原肤为基础的肿瘤治疗疗效提供了一种策略，但现有技术中还没有能够相应的、 成熟的并适用于激活肿瘤特异性免疫反应的试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明为解决现有技术中的上述问题提出一种试剂盒用于黑色素瘤的临床治疗。 体外诱导肿瘤患者自体的DC细胞，获得富集DCl细胞的产物；DCl细胞负载肿瘤特异性肤 段组合，可W用于体外或体内的肿瘤抗原特异性的细胞毒性T细胞的诱导。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明所提供的技术措施为：
[0008] 本发明提供了一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，包括有 RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W及黑色素瘤特异性抗原多肤 组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清； 所述黑色素瘤特异性抗原多肤组合为MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、 GP100-A3、MART-1-A2W及TRP-2-A2,其多肤序列分别如沈QIDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈Q IDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6 及沈QIDNo. 7 所示。
[0009] 为了进一步优化上述技术方案，本发明所采取的技术措施还包括：
[0010] 优选地，NK细胞与K562细胞共培养上清通过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10 比例共培养并加入IFNa，24小时后收集培养基上清而获得。
[0011] 优选地，所述T细胞培养上清的制备过程中，首先分离外周血单核细胞，淋己细胞 分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8巧细胞后，接种至培养基中，CD3CD28Beads， 24h后加入等量培养基，4化后收集T细胞培养上清。
[0012] 优选地，利用试剂盒激活黑色素瘤病人肿瘤特异性免疫反应包括W下步骤：
[0013] 步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞， 加入诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入黑 色素瘤特异性抗原多肤组合，获得负载有黑色素瘤特异性抗原多肤组合的成熟DC细胞；
[0014] 步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INF丫W及所述的NK细胞与K562 细胞共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞；
[0015] 步骤=，利用步骤二所获得的DCl细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。
[0016] 优选地，所述NK细胞来源于人类厮带血。
[0017] 优选地，所述T细胞培养上清为利用自体或异体T细胞获得。
[0018] 优选地，所述步骤=中的体内主动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞回 输到病人体内。
[0019] 优选地，所述步骤=中的体外被动诱导过程为将所述步骤二所获得的DCl细胞与 T细胞混合培养，并再次负载黑色素瘤特异性抗原多肤，然后收集细胞，回输到病人体内。
[0020] 优选地，试剂盒还可W包括GG巧51培养基、DMEM/F12培养基或DMEM培养基。
[0021] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，本发明的技术效果体现在W下几个 方面：
[0022] 首先，本发明提供了一组用于黑色素瘤免疫治疗的特异性抗原多肤组合，该组合 包含了多种黑色素肿瘤细胞的特异性表达抗原的肤段。运些肤段包括了HLA-A2与A3呈递 的序列区域，覆盖了 80%W上的已报道的黑色素瘤细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种 新的黑色素瘤特异性抗原多肤组合，有利于激活罹患黑色素肿瘤病人的针对肿瘤细胞的获 得性免疫反应。
[0023] 其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒，体外制备成熟DCl细胞，用于负 载黑色素瘤细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备 的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高（如CD80,CD86,CD4化等表面抗原高表 达）；经过SCD4化刺激之后，DCl细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达 量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DCl细胞制备方案，所得细胞产物可W用于黑 色素瘤细胞特异性抗原负载。
[0024] 最后，本发明提供了一种用于肿瘤治疗的DCl负载抗原肤的临床应用方案。DCl细 胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特 异性的诱导细胞毒性T细胞（CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激 活肿瘤特异性的免疫反应。
【附图说明】 阳0巧]图1为利用本发明的试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清） 制备的DCl细胞与常规方案制备的成熟DC细胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC 细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；
[0026] 图2为本发明的试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）制备的DCl细胞（10% 和40%比例的T细胞培养上清）与常规方案制备的对照DC细胞相比，CDl1C，CD70,HLA-DR， CD83,CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物表达量情况；
[0027] 图3为经过SCD40L激活之后，本发明试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细 胞共培养上清）制备的DCl细胞所分泌的IL-12与常规方案制备的成熟DC细胞分泌量之 对比；
[0028] 图4为经过SCD4化激活之后，本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清） 制备的DCl细胞（10%和40%比例的T细胞培养上清）所分泌的IL-12与常规方案制备的 成熟DC细胞分泌量之对比；
[0029] 图5为本发明试剂盒（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清）制备的 DCl细胞诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFN丫分泌水平与常见方案制备的DC细胞诱导 之对比；
[0030] 图6为本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）制备的DCl细胞（10% 和40%比例的T细胞上清）诱导T细胞之后，ELIspot试验中IFN丫分泌水平与常见方案 制备的DC细胞诱导之对比。
【具体实施方式】
[0031] 本发明提供了一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，包括有 RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INF丫W及黑色素瘤特异性抗原多肤 组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清； 所述黑色素瘤特异性抗原多肤组合为MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、 GP100-A3、MART-1-A2W及TRP-2-A2,其多肤序列分别如沈QIDNo. 1，沈QIDNo. 2,沈Q IDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQIDNo. 5,SEQIDNo. 6 及沈QIDNo. 7 所示。
[0032] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，W使更好的理解本发明， 但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0033] 实施例一（细胞培养上清为T细胞培养上清）
[0034] 在利用本发明的试剂盒激活黑色素瘤病人特异性免疫反应时，首先进行成人外周 血来源的一型极化树突状细胞的制备（typeIpolarizedden化iticcell,DC1)。外周血 单个核细胞分离参照根据化nuleit等（GeneTher. 200310(3))所述的方法。首先用通过 Ficoll-Hypaque密度梯度离屯、分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后续的培养。按密 度3.OXlOVml，将细胞接种至T75培养瓶中，并在GG巧51培养基中加入10 %血浆，置于 37. (TC、饱和湿度、5%C〇2环境中培养。培养化后，洗去悬浮的淋己细胞，加入含GM-CSF和 IL-4 1000IU/mlW及10%血浆的DMEM/F12培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一 半量的培养基。培养第五天，更换含5 %血浆培养基并加入T细胞上清10%，并按照终浓度 加入加入IFNa，培养二十小时之后再加入20ug/ml的poly-I:C。如图2所示，经过6天的 诱导，制备产物显示出了明显的DC细胞的表型，流式细胞术检测结果显示CD83,CD86等与 免疫激活相关的标志物达到了 95%W上，说明制备产物中DC细胞纯度极高。通过图4也 可W看出，DCl细胞经过SCD4化刺激之后，高表达IL12,由本发明试剂盒制备的DC细胞表 达的IL12量大约是常规方案的10倍（10%