T-DC)。检测试验中，第五天加入10%或40% T细胞上清诱导，获得的DCl细胞经过SCD4化激活的之后与T细胞共培养。ELIspot试验 (图6)显示IFNy表达阳性的T细胞的数量高于普通DC细胞诱导的数量。
[0035]DCl细胞培养至第六天，将试剂盒中的肿瘤抗原肤段粉剂离屯、后（300g，IOmin)， 每支分别溶于200ulDMEM/F12培养基中（每个肤化g/ml)，充分混匀后加入到DCl中，解 育化。收集的DCl细胞分为两份，每份至少IO6个细胞，可W用于直接与肤混合回输病人 体内，或用于体外诱导CTL细胞。DCl细胞体外诱导肿瘤抗原特异性CTL细胞时，如上述方 法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细胞。悬浮细胞按密度 S.OXloVml接种培养。每隔两天倍比添加RPMI1640培养基。至培养第五天和第六天，分 别加入添加激活试剂IFN-丫、CD3和ILl-Q混合液各1ml。将获得的抗原肤负载DCl与T 细胞混合培养。每隔两天倍比添加RPMI1640培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿 瘤特异性抗原肤。将试剂盒中的肿瘤抗原肤粉剂离屯、后（300g，IOmin)，每管分别加入Iml 的GG巧51培养基，充分溶解混匀后，添加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体 外培养时间不应超过18天。
[0036] 本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）诱导的DCl细胞的临床应用：
[0037] 应用上述描述的方法，本发明针对黑色素瘤病人采用了DCl介导免疫疗法进行治 疗方法简述如下：符合入选标准的患者（III或IV级）在进行化疗之前，取外周血150ml， 按上述的方法进行制备DClW及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。
[0038] 第六天在病人的淋己结注射抗原负载的5-10XIO6个DCl细胞（重悬于Iml生理 盐水），培养第十六，十屯，十八天每天收集IO9个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重 悬之后，静脉回输。目前已完成6例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法 安全可靠。
[0039] 实施例二（细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清）
[0040] 外周血单个核细胞分离参照根据化nuleit等（GeneTher. 200310(3))所述的方 法。首先用通过Ficoll-Hypaque密度梯度离屯、分离外周血单个核细胞，并收集血浆用于后 续的培养。加入比-2(2000U/ml)W及IL15(2ng/ml)。每两至S天倍比加入培养基，并等量 补加因子。至第十二天收集。诱导完成之后，NK细胞按1-3XlOVml接种至培养基RPMI1640 中，加入IFNa(lOOOUI/ml)并W0. 5-1. 5XlOVml密度接种K562细胞（可替换为K562-NK 细胞）混合培养，收集激活24-48小时过程中的培养基上清，过滤之后-80度冻存或直接用 于DCl细胞的制备。外周血单个核细胞按密度3.OXlOVml，将细胞接种至T75培养瓶中， 并在含lOOOU/mlIL-2扩增培养基中加入10%血浆，置于37. 0°C、饱和湿度、5%C02环境中 培养。培养化后，洗去悬浮的淋己细胞，加入含GM-CSF和IL-4lOOOU/mlW及10%血浆的 培养基。贴壁细胞培养第3天，第5天更换一半量的培养基。培养第六天，更换含5%血浆 培养基并加入NK细胞上清10 %，并按照终浓度lOOOUI/ml加入IFN丫，培养二十小时之后 再加入20ug/ml的POly-I:C。培养至第屯天收集细胞即为DCl细胞。DCls细胞培养至第六 天，将Cll-TP试剂盒中的肿瘤抗原肤段粉剂离屯、后（300g，IOmin)，每支分别溶于200ul培 养基中（每个肤化g/ml)，充分混匀后加入到DCl中，解育化。收集的DCl细胞分为两份， 每份至少IO6个细胞，可W用于直接与肤混合回输病人体内，或用于体外诱导CTL细胞。
[0041] 如上述方法分离外周血单核细胞，在贴壁培养皿中短暂培养，分离能够贴壁的细 胞。悬浮细胞按密度3.OXlOVml接种培养。每隔两天倍比添加含lOOOU/ml比-2的扩增 培养基。至培养第五天添加IFN-丫，第六天加入IL-Ia与CD3。
[0042] 将上述获得的抗原肤负载DCl与T细胞混合培养。每隔两天倍比添加含lOOOU/ml 的扩增培养基。混合培养开始后第四天，再次负载肿瘤特异性抗原肤。将CTkTP试剂盒中 的肿瘤抗原肤粉剂离屯、后（300g，IOmin)，每管分别加入Iml的培养基，充分溶解混匀后，添 加到培养体系中。之后，继续培养至回输，T细胞体外培养时间不应超过20天。
[0043] 如图1所示，经过诱导，本发明试剂盒制备的DCl细胞与常规方案制备的成熟DC 细胞相比，CCR7,CD70,HLA-DR，CD83,CD86等DC细胞与免疫激活相关的标志物的多个表面 标志物成阳性。通过图3也可W看出，本发明制备而得的细胞产物IL12p70表达量大大高 于目前常用的方案，本发明诱导的DCl细胞所分泌的IL-12几乎是常规方案制备的成熟DC 细胞分泌量的10倍。检测试验中，体外诱导实验显示经本试剂盒制备的DCl诱导之后，活 化的T细胞即IFN丫表达阳性的T细胞显著性升高（图5)。
[0044] 本发明试剂盒（细胞培养上清为T细胞培养上清）诱导的DCl细胞的临床应用：
[0045] 应用上述描述的方法，本发明针对黑色素瘤病人采用了DCl介导免疫疗法进行治 疗方法简述如下：符合入选标准的患者（III或IV级）在进行化疗之前，取外周血150ml， 按上述的方法进行制备DClW及肿瘤抗原特异性的CTL细胞。
[0046] 第屯天在病人的淋己结注射抗原负载的5-10XIO6个DCl细胞（重悬于Iml生理 盐水），培养第十六，十屯，十八天每天收集IO9个DC与T细胞共培养产物，在生理盐水中重 悬之后，静脉回输。目前已完成5例，正在随访观察中，尚未发现明显的并发症，证实本方法 安全可靠。
[0047] 本发明的一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，相对于现有技术具有 如下优点：
[0048] 首先，本发明提供了一组用于黑色素瘤免疫治疗的特异性抗原多肤组合，该组合 包含了多种黑色素肿瘤细胞的特异性表达抗原的肤段。运些肤段包括了HLA-A2与A3呈递 的序列区域，覆盖了 80%W上的已报道的黑色素瘤细胞特异性抗原。因此，我们提供了一种 新的黑色素瘤特异性抗原多肤组合，有利于激活罹患黑色素肿瘤病人的针对肿瘤细胞的获 得性免疫反应。
[0049] 其次，本发明还提供了一种利用本发明的试剂盒体外制备成熟DCl细胞，用于负 载黑色素瘤细胞特异性抗原组合的方法。与常用诱导方案相比，利用本发明试剂盒所制备 的产物中拥有成熟表型的DC细胞含量显著性提高（如CD80,CD86,CD4化等表面抗原高表 达）；经过sCD4化刺激之后，DCl细胞IL12P70表达量大大高于通用方案制备细胞的表达 量。由此可见，本发明提供了一个更有效成熟DCl细胞制备方案，所得细胞产物可W用于黑 色素瘤细胞特异性抗原负载。
[0050] 最后，本发明提供了一种用于肿瘤治疗的DCl负载抗原肤的临床应用方案。DCl细 胞负载肿瘤特异性抗原之后，一部分细胞回输至患者体内，另一部分用于体外肿瘤抗原特 异性的诱导细胞毒性T细胞（CTL)，通过体内/体外，主动诱导/被动诱导相结合的方式激 活肿瘤特异性的免疫反应。
[0051] W上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限 制于W上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和 替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和 修改，都应涵盖在本发明的范围内。
【主权项】
1. 一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，其特征在于，包括有RPMI-1640 培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFy以及黑色素瘤特异性抗原多肽组合；其中，所 述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述黑色素瘤特 异性抗原多肽组合为序列如SEQIDNo. 1，SEQIDNo. 2,SEQIDNo. 3,SEQIDNo. 4,SEQ IDNo. 5,SEQIDNo. 6 及SEQIDNo. 7 的多肽组合。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞与K562细胞共培养上清通 过将K562细胞与NK细胞按1:2至1:10比例共培养并加入IFNa，24小时后收集培养基上 清而获得。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清的制备过程中，首 先分离外周血单核细胞，淋巴细胞分离液分理单个核细胞，用CD8磁珠分选出CD8+T细胞 后，接种至培养基中，加入⑶3⑶28Beads，24h后加入等量培养基，48h后收集T细胞培养上 清。4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，利用试剂盒激活黑色素瘤病人肿瘤特 异性免疫反应包括以下步骤： 步骤一，分离病人外周血中的单核细胞，细胞短暂贴壁培养之后，移除悬浮细胞，加入 诱导剂GM-CSF和IL-4培养两天，培养第3天，第5天更换一半量的培养基，并加入黑色素 瘤特异性抗原多肽组合，获得负载有黑色素瘤特异性抗原多肽组合的成熟DC细胞； 步骤二，将所述步骤一中制得的成熟DC细胞用INFy以及所述的NK细胞与K562细胞 共培养上清进一步培养诱导两天，使所述的成熟DC细胞分化为DCl细胞； 步骤三，利用步骤二所获得的DCl细胞进行体内主动诱导和/或体外被动诱导。5. 根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述NK细胞来源于人类脐带血。6. 根据权利要求1或3所述的试剂盒，其特征在于，所述T细胞培养上清为利用自体或 异体T细胞获得。7. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体内主动诱导过程为 将所述步骤二所获得的DCl细胞回输到病人体内。8. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述步骤三中的体外被动诱导过程为 将所述步骤二所获得的DCl细胞与T细胞混合培养，并再次负载黑色素瘤特异性抗原多肽， 然后收集细胞，回输到病人体内。9. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括有GGT551培养基、DMEM/F12培 养基。
【专利摘要】本发明提供了一种用于激活黑色素瘤特异性免疫反应的试剂盒，包括有RPMI-1640培养基、细胞培养上清、GM-CSF、IL-4、INFγ以及黑色素瘤特异性抗原多肽组合；其中，所述细胞培养上清为NK细胞与K562细胞共培养上清或者T细胞培养上清；所述黑色素瘤特异性抗原多肽组合包括MAGE-A1-A2、MAGE-A1-A3、MAGE-A3-A2、GP100-A2、GP100-A3、MART-1-A2以及TRP-2-A2抗原多肽；应用本发明的试剂盒可以高效地以主动诱导/被动诱导相结合的方式激活肿瘤特异性的免疫反应。
【IPC分类】A61K39/00, C12N5/0784, A61P35/00, C12N5/0783
【公开号】CN105219724
【申请号】CN201510685069
【发明人】李伟, 叶圣勤, 汪鑫, 瞿苏
【申请人】上海隆耀生物科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年10月20日