，配制成包被液，并以IOOyL/孔将其吸附于微孔板上。所述 pH值为9. 6的碳酸盐包被缓冲液的配方为： 去离子水 IL Na2CO3 0.636g NaHCO3 I. 172g 溶解混匀后，调pH至9. 6 ; 3) 封闭保护：用固体洗液稀释液洗板两次，以150 μ L/孔加封闭液于洗涤后的微孔板 上，在21°C ~25°C封闭3h，甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24h封袋。然后贴 签置2°C ~8°C保存备用。封闭液的配方为： 去离子水 IL Na2CO3 I. 59g NaHCO3 2.93g NaCl 8g BSA IOg 0. 1%叠氮钠 ImL 鹿糖 25g。
[0032] 三、HRP标记胃蛋白酶原I抗体的制备： 用过碘酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，酶标抗体稀释液的配方为： 去离子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 25%BSA IOg 酶稳定剂 Ig 0. 1%叠氮钠 ImL。
[0033] 四、酶标抗体浓度的选定： 经试验证明，胃蛋白酶原I酶标抗体的工作浓度范围为50ng/mL以上。
[0034] 五、校准品的制备： 将人工合成的胃蛋白酶原I用校准品稀释液稀释成含量分别为5 μ g/mL、20 μ g/mL、 50 μ g/mL、100 μ g/mL、200 μ g/mL的系列浓度，建立定量校准品。校准品稀释液的配方为： 去离子水 IL Na2HPO4 2.9g NaH2PO4 0. 2g NaCl 8. 2g 复合蛋白保护剂PHD 0. 5g 5%酪蛋白 IOg Tween-20 10mT, 0. 1%叠氮钠 ImL 调节胃蛋白酶原I校准品的稀释液pH为7. 4。
[0035] 六、发光底物A、发光底物B的制备 所述制备发光底物A的步骤为：IOmg鲁米诺加入IOOOmL去离子水，再用氢氧化钠调pH 至 8.6〇
[0036] 所述制备发光底物B的步骤为：在去离子水中加入过氧化氢和对碘苯酚，使溶液 中过氧化氢终浓度为3mmol/L，对碘苯酷终浓度为5mg/mL。
[0037] 七、半成品及成品的组装 上述步骤所得产品分装即为半成品，随机抽取三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定 性检测合格后组装成试剂盒。
[0038] 实施例2应用磷酸盐包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原I化学发光定量检测 试剂盒 包被：用0. 2mol/L的pH值为6. 5的磷酸盐包被缓冲液将胃蛋白酶原I单克隆抗体稀 释至浓度为3 μ g/mL，配制成包被液，并以100 μ L/孔将其吸附于微孔板上，于37°C条件下 包被4h。具体地，所述pH值为6. 5的磷酸盐包被缓冲液的制备方法为：68. 5mL的0. 2mol/ L的NaH2PO4溶液和31. 5mL的0· 2mol/L的Na 2ΗΡ04溶液混合即可。
[0039] 抗体选用兔源人胃蛋白酶原I单克隆抗体，其他试剂与组分的配制方法与实施例 1的方法一致。
[0040] 实施例3应用Tris-HCl包被缓冲液制备本发明的胃蛋白酶原I化学发光定量检 测试剂盒 包被：用〇. 〇5mol/L的pH值为7. 4的Tris-HCl包被缓冲液将胃蛋白酶原I单克隆抗 体稀释至浓度为1 μ g/mL，配制成包被液，并以100 μ L/孔将其吸附于微孔板上，于37°C条 件下包被4h。具体地，所述pH值为7. 4的Tris-HCl包被缓冲液的制备方法为：50. OmL的 0. lmol/L的Tris碱溶液和42. OmL的0. lmol/L的HCl溶液混合后，加水定容至100mL。
[0041] 其他试剂与组分的配制方法与实施例1的方法一致。
[0042] 本发明所述试剂盒的使用方法 一、实验前准备： 1) 将试剂盒从冷藏环境中取出，放置室温18°c ~25°C平衡至少30min ; 2) 将恒温箱或水浴锅调到37°C，待温度稳定后使用； 3) 取固体洗液5g用500mL去离子水溶解后备用。
[0043] 二、样本的要求： 1) 采用正确医用技术收集血清样本； 2) 样本中的沉淀物可能会影响试验结果，应离心除去，并确定样本未变质方可使用； 3) 严重溶血或脂血的样本不能用于测定； 4) 样本在24h内测定，则应存放于2°C ~8°C冰箱中，如果长期使用，则应冻存于_20°C 以下，避免反复冻融；使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。
[0044] 三、检测方法： 使用实施例1所制胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒进行检测的具体操作步骤 如下： 1) 取出一定量的包被孔，每孔分别加入2〇μ?校准品或血清样品； 2) 每孔分别加入酶结合物5〇μ? ; 3) 在微型振荡器上振荡30s使孔内液体混合均匀，置37°C温育60min ; 4) 用固体洗液稀释液洗板5次，最后在吸水纸上拍干； 5) 每孔分别加入发光底物A和B各5〇μ?，室温（18°C ~25°C )避光反应5min ; 6) 化学发光检测仪检测发光强度； 7) 结果计算：选择适当的曲线拟合方式，本试剂盒推荐使用线性回归拟和方程建立标 准曲线，但也可根据不同情况采用其他拟和方式。以系列校准品浓度的对数值为横坐标（X 轴)，以系列校准品发光强度值的对数值为纵坐标（Y轴)建立标准曲线（log-log)(图1)，将 测得的血清样品的发光强度值代入标准曲线（log-log)中，计算得出血清样品中的胃蛋白 酶原I含量。
[0045] 四、参考值(参考范围）： 用本试剂盒测定1000份正常人空腹血清样本，得到正常人空腹状态参考范围为大于 65 μ g/L。与胃蛋白酶原II联合检测，正常人样本胃蛋白酶原I与胃蛋白酶原II比值的参考 值大于7. 5。各实验室应根据自己实际条件及接触人群建立正常参考值范围。本试剂盒仅 作诊断的辅助手段之一，供临床医生参考。
[0046] 本发明的胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒在方法学上的鉴定 按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制造的试剂盒进行鉴定，经过大量 的实验证明，本发明的试剂盒在用于胃蛋白酶原I浓度水平测定时，该方法学指标如下： 1)准确度：将胃蛋白酶原I高值样本A加入到低值样本B中，所加入样本A与样本B之 间的体积比为1:9,根据下面公式计算回收率（R)。回收率为99%，在85%~115%范围内。
【主权项】
1. 一种胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒，包括：1)胃蛋白酶原I抗体包被微孔 板；2)HRP标记胃蛋白酶原I抗体；3)校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原I校准品；4) 发光底物A ;5)发光底物B ;6)固体洗液； 所述胃蛋白酶原I抗体为鼠源或兔源人胃蛋白酶原I单克隆抗体； 所述包被的微孔板为48孔或96孔的微孔板条； 所述校准品稀释液的配方为： 去离子水 1L Na2HP04 2.9g NaH2P04 0. 2g NaCl 8. 2g 复合蛋白保护剂PHD 0. 5g 5%酪蛋白 lOg Tween-20 lOmL 0. 1%叠氮钠 lmL 调节胃蛋白酶原I校准品的稀释液pH为7. 4 ; 所述发光底物A为鲁米诺和氢氧化钠溶液； 所述发光底物B为过氧化氢和对碘苯酚溶液； 所述固体洗液为磷酸盐吐温缓冲液（PBST)，PBST固体洗液配方为 KH2P04 4. 8g Na2HP04*12H20 28.8g NaCl 155g Tween-20 10mL。
2. 权利要求1所述胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步 骤：1)配制PBST固体洗液及其稀释液；2)胃蛋白酶原I抗体包被微孔板的制备；3) HRP标 记胃蛋白酶原I抗体的制备；4)胃蛋白酶原I校准品的制备；5)配制发光底物A、发光底物 B ;6)分装固体洗液、酶标抗体、校准品、发光底物A和发光底物B并组装为成品； 其中： 1) 所述配制PBST固体洗液及其稀释液的步骤为：混合均匀后的PBST固体洗液在气压 500Pa、温度10°C、湿度30%状态下减压低温干燥，lh后用铝箔袋分装，使用时每5g的PBST 固体洗液溶解在500mL去离子水中混匀； 2) 所述制备胃蛋白酶原I抗体包被微孔板的步骤为：采用包被缓冲液将胃蛋白酶原 I单克隆抗体稀释至浓度为1~5 y g/mL，将其吸附于微孔板上，再用固体洗液稀释液洗板两 次，采用封闭液对包被后的微孔板进行封闭和保护； 3) 所述HRP标记的胃蛋白酶原I抗体的制备的步骤为：配制酶标抗体稀释液，用过碘 酸盐法将HRP标记在单克隆抗体上，经试验证明，胃蛋白酶原I酶标抗体的工作浓度范围 为50ng/mL以上； 4) 所述胃蛋白酶原I校准品的制备的步骤为：配制胃蛋白酶原I校准品稀释液，将人 工合成的胃蛋白酶原I用校准品稀释液稀释成含量分别为5yg/mL、20yg/mL、50yg/mL、 100 y g/mL、200 y g/mL的系列浓度，建立定量校准品。
3. 权利要求2所述胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所 述HRP标记胃蛋白酶原I抗体所用的酶标抗体稀释液的配方为： 去离子水 1L Na2HP04 2.9g NaH2P04 0. 2g NaCl 8. 2g 25%BSA lOg 酶稳定剂 ig 0. 1%叠氮钠 lmL。
4. 权利要求2所述胃蛋白酶原I化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于所 述包被缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
【专利摘要】本发明涉及免疫检测领域，具体地涉及一种胃蛋白酶原Ⅰ化学发光定量检测试剂盒及其方法。本发明所述胃蛋白酶原Ⅰ化学发光定量检测试剂盒，包括：1）胃蛋白酶原Ⅰ抗体包被微孔板；2）HRP标记胃蛋白酶原Ⅰ抗体；3）校准品稀释液稀释后的系列胃蛋白酶原Ⅰ校准品；4）发光底物A；5）发光底物B；6）固体洗液。本发明的试剂盒可以检测出血清中胃蛋白酶原Ⅰ的含量，血清中胃蛋白酶原Ⅰ水平与萎缩性胃炎、消化性溃疡呈正相关；在幽门螺杆菌的治疗中，通过监测除菌后的胃蛋白酶原变化能够判定治疗效果。它具有无创、检测方法简单快速、灵敏度高、检测范围宽等优点。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104597251
【申请号】CN201510034183
【发明人】赵焕朝, 俞宁, 胡锰鸽, 翟秋菊, 张喜娟
【申请人】河南美凯生物科技有限公司
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月23日