一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医学免疫体外诊断试剂领域，涉及一种检测人复制蛋白变体含量的胶 乳增强免疫比浊试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人复制蛋白 CIZl $ipl interacting zinc finger protein 1)是参与 DNA 复 制的一种核蛋白，它与包括多种癌症在内的很多人类疾病相关。有研究表明，第14、15 号外显子发生突变的CIZl突变体（CIZl-V)是一个早期肺癌和多种肿瘤生物标记物，以 它作为肿瘤特异性检测单标记物，能够不依靠传统医学的侵入性检测手段从风险人群中 诊断鉴定出患有早期肺癌的患者。由于目前CIZl突变体（CIZl-V)的突变片段多肽序列 ⑶EDEEEIEVRSRDISR很短，一般的检测需要基因测序或侵入性检测手段才能通过PCR等技 术进行检测。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种检测人复制蛋白变体含量的 胶乳增强免疫比浊试剂盒。
[0004] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0005] -种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括试剂R1、试剂R2 和复制蛋白变体标准品溶液，其中：
[0006] 所述试剂Rl包含电解质、促凝剂、防腐剂及缓冲液；
[0007] 所述试剂R2包含抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定 齐U、防腐剂及缓冲液；
[0008] 所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的缓冲液。
[0009] 优选的，所述的反应缓冲液为PBS缓冲液、Ifepes缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓 冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液或DIPSO缓冲液中的一种或几种，缓冲液浓度在20-200mM 之间。
[0010] 优选的，所述Rl中防腐剂优选叠氮钠（NaN3)，促凝剂选自roG6000、PEG8000和 PEG12000,优选PEG6000或不同PEG的混合体，在试剂R2中的浓度为2. 0% -3. 5%。
[0011] 优选的，所述的胶乳颗粒为直径范围〇. 05-0. 20 μ m的聚苯乙烯胶乳颗粒，试剂R2 中胶乳颗粒浓度为〇. 1% -〇. 8%。
[0012] 进一步优选的，所述的胶乳颗粒为直径0. 13 μ m的聚苯乙烯胶乳颗粒，试剂R2中 胶乳颗粒浓度为0.2%。
[0013] 所述的抗人复制蛋白变体的多克隆抗体选自兔、羊、鸡的免疫球蛋白，优选兔抗， 经人复制蛋白变体免疫、亲和层析纯化获得的免疫球蛋白；进一步优选合成CIZl-V第14、 15号外显子基因表达的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR(SEQ ID NO. 1)，将合成的多 肽序列偶联至血蓝蛋白载体蛋白上制备抗原并免疫兔、羊、鸡、再经亲和层析纯化获得的免 疫球蛋白。
[0014] 抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被胶乳颗粒是通过化学交联剂在交联缓冲液 中进行的，所用化学交联剂为碳化二亚胺（EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)，交联缓冲液 选自PBS缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液 或DIPSO缓冲液，pH在6. 0-8. 0之间。
[0015] 优选的，所述抗人复制蛋白变体的多克隆抗体利用化学交联剂碳化二亚胺（EDAC) 和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)定向固定在苯乙烯胶乳颗粒上的途径为：取20 μ g胶乳微球 于1.5mL EP管中，加入ImL MES缓冲液（pH6. 0)，枪头混勻；HOOOrpm离心30min，去上清， 加入 0· 5mL EDAC 溶液（0· 2-2. Omg/mL)，22°C 16rpm 旋转 IOmin ;再加入 50μ L NHS 溶液 (0· 2-2. Omg/mL)，22°C 16rpm 旋转 30min，胶乳颗粒得到活化，之后 HOOOrpm 离心 30min， 去上清，加入ImL 50mM PBS缓冲液（pH7. 4)，枪头混勻；HOOOrpm离心30min，去上清，加入 ImL 50mM PBS 缓冲液（pH7. 4)，超声 15s，加入 20yg CIZl-V抗体，37°C16rpm旋转 2h;加入 1(^1^终止液（11?甘氨酸+10%854)，371：16印111旋转111。14000印111离心251^11，去上清， 加入ImL贮存液（30mM pH7. 4的H印es或DIPSO缓冲液，防腐剂0. 1 % NaN3，电解质0. 01 % NaCl，稳定剂 0· 01% EDTANajP 0· 09% BSA)，超声 20s ; HOOOrpm 离心 20min，去上清，加入 ImL贮存液，超声20s，4°C保存。
[0016] 所述的复制蛋白变体标准品通过以下方法制备：合成CIZl-V第14、15号外显子基 因表达的突变片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR，将合成的多肽偶联至卵白蛋白（OVA)载 体蛋白得到复制蛋白变体标准品。
[0017] 优选的，所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的适 当缓冲液，其中复制蛋白变体含量分别为0 μ g/mL、0. 50 μ g/mL、I. 00 μ g/mL、2. 00 μ g/mL、 4· 00 μ g/mL、8. 00 μ g/mL或类似比例浓度，缓冲液为PBS缓冲液、！fepes缓冲液或Tris-HCl 缓冲液中的一种或几种。
[0018] 优选的，检测时R1、R2分别加取112. 5 μ L和37. 5 μ L，样品加样量为2-8 μ L，或类 似比例整体增减。
[0019] 最优选的，检测人血清中复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒组成如 下：
[0020] 试剂 Rl :50mM PBS 缓冲液（ρΗ7· 4)，2· 5% PEG8000,0. 015% NaCl, 0· 5% NaN3;
[0021] 试剂1?2:0.2%兔抗人复制蛋白变体抗体包被胶乳颗粒（粒径0.1311111)，3〇1111 ρΗ7· 4 的！fepes 或 DIPSO 缓冲液，0· 1% NaN3,0. 01% NaCl，0. 01% EDTANaJP 0· 09% BSA ;
[0022] 复制蛋白变体标准品溶液：合成的CIZl-V第14、15号外显子基因表达的多肽序 列CDEDEEEIEVRSRDISR偶联卵白蛋白（OVA)载体蛋白作为抗原标准品，50mM PBS缓冲液 (ρΗ7· 4)。
[0023] 在本发明中，复制蛋白变体与胶乳颗粒包被的兔抗人复制蛋白变体多克隆抗体发 生抗原抗体反应，形成抗原一抗体一胶乳颗粒复合物，导致浊度上升，优选的，测定此浊度 在500-600nm(最优选的，600nm)波长处的吸光度，对照标准曲线即可计算样本中复制蛋白 变体含量。
[0024] 有益效果：
[0025] 目前关于CIZl-V的报道还非常少，也没有相关试剂盒技术及产品面世。由于目前 CIZl突变体（CIZl-V)的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR很短，一般的检测需要基因 测序或侵入性检测手段才能通过PCR等技术进行检测。本发明将CIZl-V第14、15号外显子 基因表达的突变片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR偶联至血蓝蛋白载体蛋白上制备抗原， 并免疫兔、羊、鸡、再经亲和层析纯化获得的免疫球蛋白。合成CIZl-V第14、15号外显子基 因表达的突变片段多肽序列⑶EDEEEIEVRSRDISR，将合成的多肽偶联至卵白蛋白（OVA)载 体蛋白得到复制蛋白变体标准品，使得突变小片段也能用常规的胶乳增强免疫比浊试剂盒 通过优化条件，能够在全自动生化检测仪上进行检测，达到成本低、方便、快速、正确进行临 床检测。
[0026] 本发明用化学偶联法将特异性兔抗人复制蛋白变体抗体包被到活化后得胶乳颗 粒表面，并通过添加特定的稳定剂、防腐剂和促凝剂使胶乳颗粒形成均一稳定的悬浊液。使 用时操作简便快捷，适应临床快速高通量筛查的要求。特异性抗体免疫球蛋白的使用保证 了试剂盒较高的特异性，有效避免了其它物质的干扰。
[0027] 本发明的性能鉴定选择了灵敏性、准确性、精密性、特异性这几个参数，并与Elisa 方法进行了检测结果的比较。此试剂盒标准曲线的相关系数R2达到0.9988,线性较好， 检测限达到〇. 2 μ g/mL，对表达纯化所得目的蛋白的回收率比较高，而变异系数较低，批间 及批内变异系数均小于10%，说明此试剂盒有较好的准确性和精密性。通过对此试剂盒 以及Elisa方法检测结果的比较分析，显示两种方法对于同一浓度的表达纯化所得目的蛋 白的回收率无显著差异（P3 0.05)。用两者进行蛋白表达量检测时，结果也无显著差异 (P > 0.05)，但是比Elisa方法操作时间短、简单方便、成本低。此试剂盒能从多种蛋白中 特异且准确地检测出目的蛋白的含量，说明其具有较高的特异性，便于方便快速检测。
【附图说明】
[0028] 图1复制蛋白变体胶乳增强免疫比浊试剂盒检测浓度标准曲线
[0029] 图2 CIZl-V融合蛋白表达纯化结果SDS-PAGE鉴定
[0030] 其中，M :蛋白Marker ; 1 :过柱如上清；2 :过柱后上清；3 :目的蛋白
[0031] 图3不同胶乳微球粒径制备的R2与Rl及标准品反应后的检测结果比较
[0032] 图4 0. 13 μ m的胶乳制备的R2在不同胶乳浓度检测结果比较
[0033] 图5 0. 13 μ m的0. 2%浓度的胶乳配制成R2在不同波长检测结果比较
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于了解，下面结合具体实 施例进一步阐述本发明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0035] 实施例1复制蛋白变体胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备
[0036] 试剂 Rl :试剂 Rl :50mM PBS 缓冲液（pH7. 4)，2. 5% PEG8000,0. 015% NaCl, 0· 5% NaN3，该试剂为无色透明溶液。
[0037] 试剂卩2:0.2%兔抗人复制蛋白变体抗体包被胶乳颗粒（粒径0.1311111)，3〇1111 ρΗ7· 4 的！fepes 或 DIPSO 缓冲液，0· 1 % NaN3,0· 01 % EDTANaJP 0· 09% BSA ;
[0038] 制备方法：
[0039] (1)分别取 0· 2mg 粒径 0· 099 μ m, 0· 13 μ m, 0· 189 μ m, 0· 20 μ m 的胶乳微球于 50mL 离心管中，加入IOmL MES缓冲液（pH6. 0)，枪头混匀，HOOOrpm离心30min，去上清；
[0040] (2)称取 2mg EDAC 粉末溶于 IOmL MES 缓冲液（ρΗ6· 0)中配制 0· 2mg/mL EDAC 溶 液，加入5mL于上述离心管，22°C 16rpm旋转IOmin ;
[0041] (3)称取8mg NHS粉末溶于ImL MES缓冲液（ρΗ6· 0)中配制8mg/mLNHS溶液， 取0. 5mL加入上述离心管，溶解混匀后22°C 16rpm旋转30min，胶乳颗粒得到活化，之后 HOOOrpm离心30min，去上清；
[0042] (4)在上述离心管中加入IOmL 50mM PBS缓冲液（ρΗ7· 4)，枪头混匀；HOOOrpm离 心30min，去上清；
[0043] (5)在上