一种可视化微区多色显影塑料基生物芯片的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物芯片领域，具体地涉及一种制备可视化微区多色显影塑料基生物 芯片的方法。
【背景技术】
[0002] 生物芯片（Biochips)是一种功能强大的微型生化分析系统，它以集成了探针分 子阵列的固体基片为核心元件，采用光学或电学手段实现对DNA、蛋白质以及其它靶标物 的准确、快速、高通量检测；在临床诊断、生物医学、食品工业、环境监测等领域有着广泛的 应用价值。生物芯片的定性和定量分析通常是建立在荧光表征技术的基础之上，即需要对 靶标物进行荧光标记，并需采用专业的激光共聚焦扫描仪来获取目标信号。因此，常规生 物芯片的制造和检测成本高昂，严重限制了它的广泛应用。
[0003] 近年来发展起来了一种新型生物芯片一可视化芯片技术，该型芯片利用酶或纳米 粒子催化沉积等显色反应来"显影放大"探针与靶标物间的特异作用，进而可利用照相机、 扫描仪甚至肉眼来观测和定量芯片实验结果。该型芯片既不需要标记靶标物，又不需要使 用昂贵的激光共聚焦扫描仪，完全克服了常规生物芯片在制造和应用方面的局限；此外，该 型芯片操作简单、使用方便，可"原位现场"实施检测与分析，具有广阔的应用前景。目前， 这种可视化芯片主要采用单显色技术，即经显色反应后芯片上所有信号只呈现一种颜色。 因此，当需要对多个靶标物进行检测时，这种单显色技术会带来一系列问题；例如所有靶标 物信号将只呈现一种颜色，易引起混淆；尤其不利的是由于不同靶标物（样品）显色动力学 不同，经常出现一些靶标物尚未显色而另一些靶标物已达到显色饱和。显然，采用多色显影 技术可以很好地解决上述难题，是可视化芯片未来的发展方向。
[0004] 目前不同色彩的单显色技术在生物体组织染色、免疫印迹、酶联免疫等实验中都 已采用；但同时将不同色彩的显色技术应用于同一块基片上，特别是同时作用于一个微小 (平方毫米甚至亚平方毫米）的区域，实现微区多色彩催化显影具有极大的挑战性。这一 挑战性首先源于不同色彩的催化显色反应间常存在较强的相互干扰，在一个微小区域进行 分区染色必然会导致不同亚区域间显色的互相污染（即"窜色"）。其次，如何在一个几平 方毫米（甚至亚平方毫米）的微小区域实现分区可控染色，在实验技术上也存在较大挑 战。这是因为利用现有常规技术很难在一个微小区域既能方便地实现靶标物全区域输送又 能方便地实现显色催化剂分区/分段定位可控输送；特别是要能够保证在一个微通道进行 分段输送的多个催化剂不能发生相互污染。再次，在进行分区催化显色操作时，必须要确保 各个亚区所采用的显影、封闭以及清洗条件不会对其它亚区的显色造成干扰。
[0005] 因此，只有巧妙地设计样品及试剂的输运方案，合理选取专一高效的多色显色系 统（酶/纳米粒子与底物），通过反复尝试建立各亚区优化的封闭、清洗及显色工艺，才有可 能实现可视化生物芯片的微区选择性多色彩催化显影。
【发明内容】
[0006] 因此，本发明的目的是提供一种制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方 法。
[0007] 根据本发明的制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法包括以下步骤：
[0008] 1)塑料基片表面活化处理：将塑料基片放入紫外臭氧或氧等离子体系统中辐射， 使其表面产生高密度活性基团，然后浸入活化溶液中活化处理，冲洗基片表面，并用将基片 吹干待用；
[0009] 2)探针分子的分区固定：利用内嵌多条微通道的PDMS模板或通过喷墨打印方式 将含有不同探针分子的缓冲溶液定位引入到芯片表面的不同区域从而形成多个不同的"识 别区"，然后温育，从而将探针分子固定在芯片表面形成分区阵列，再用清洗溶液冲洗基片 表面；
[0010] 3)基片的首次封闭：掀掉PDMS模板，根据探针分子和革E标物或信号分子的类型， 将基片表面浸入封闭型溶液，并温育，钝化和封闭基片表面以避免靶标物在基片表面的非 特异性吸附，然后用去离子水冲洗基片表面，并将基片吹干待用；
[0011] 4)目标分子的分区捕获：利用特殊设计、既可全通道又可分段输送样品的PDMS模 板（该模板一面内嵌多条数百微米宽、数厘米长的微通道，另一面沿通道间隔分布数个惯 穿孔道作为液体进出模板的通道；具体尺寸参数见附图2)将含有多种靶标分子的样品溶 液同时引入到基片表面固定有不同探针分子的"识别区"，其引入方向垂直于探针分子阵列 以形成交叉的点阵型反应区域，然后将基片温育，使靶标分子或信号分子与探针分子充分 结合，再用同样的缓冲溶液冲洗基片；
[0012] 5)信号触发单元一催化剂的引入：继续利用上述特殊设计的既可全通道又可分 段输送样品的PDMS模板把不同信号触发单元一催化剂定向、分段、可控地引入到芯片表面 指定的反应区域，并充分结合，然后再定向清洗相应的通道，去掉PDMS模板，最后用缓冲液 彻底冲洗整个基片；
[0013] 6)基片二次封闭：在芯片显影处理之前，根据不同显影反应的特点，将其浸入或 分区域滴加封闭型溶液，然后用清洗型溶液和去离子水彻底冲洗芯片，最后将芯片吹干待 用；
[0014] 7)芯片分区多色显影处理：根据靶标物数量以及"识别区"在芯片表面的分布，通 过将芯片交替浸入几种不同显影液或将不同显影液滴加到基片表面各个识别区，选择并搭 配合适的显色系统以实现选区多色彩催化显影。
[0015] 根据本发明的【具体实施方式】，制备可视化微区多色显影塑料基生物芯片的方法， 包括以下步骤：
[0016] 1)塑料基片表面活化处理：将塑料基片放入紫外臭氧或氧等离子体系统中辐射 10?30分钟，使其表面产生高密度羧基活性基团，根据需要可将羧基进一步转化成不同的 活性基团（例如硫醇、醛基、氨基等）；然后将表面带有羧基的塑料基片浸入特定活化溶液 中（例如 EDC 浓度为 0· 02 ?0· lg/mL、NHS 浓度为 0· 0025 ?0· 01g/mL、pH = 6. 0 ?7. 0 的 IOOmM磷酸盐PBS或吗啉乙磺酸MES缓冲溶液）活化处理1?5小时，后用清洗溶液（例如 20mM Tris缓冲溶液）冲洗基片表面，并用将基片吹干待用。
[0017] 2)探针分子的分区固定：利用内嵌多条微通道的PDMS模板（可分条进行全通道 输运）或通过喷墨打印方式将含有不同探针分子的缓冲溶液定位引入到芯片表面的不同 区域从而形成多个不同的"识别区"，然后将基片转移到湿盒中温育4?6小时，通过多种共 价键合方式将探针分子固定在芯片表面形成分区阵列；然后用特定的清洗溶液（例如20mM Tris或PBS缓冲溶液）冲洗基片表面。固定不同探针分子需使用不同的缓冲溶液，例如固 定检测铅离子的DNA探针链缓冲液为20mM Tris+ΙΟ?IOOmM MgCl2, PH = 7. 4,固定检测汞 离子的 DNA 探针链缓冲液为 20mM PBS+50 ?250mM NaCl+ΙΟ ?IOOmM MgCl2, PH = 7. 4 ;固 定检测毒品吗啡、安他非命和可卡因的探针分子缓冲液为20mM PBS+50?250mM NaCl，PH =7.4)需要说明的是，如果芯片是采用的非夹心式或非竞争式的检测方式，探针分子应保 留信号链接基团（例如生物素、链霉素等）
[0018] 3)基片的首次封闭：掀掉PDMS模板，根据探针和靶标物类型，将基片表面浸入特 定的封闭型溶液（例如针对DNA类系统可使用10?20mM Tris/PBS+Ο?200mM NaCl+Ι? 6 % BSA，pH = 4 ;针对抗体/抗原类系统则使用10?20mM Tris/PBS+Ο?200mM NaCl+1?5% BSA(IgG-free)+l?8%糖原，pH = 7· 4)并在湿盒中保持0· 5?I. 0小时， 来钝化和封闭基片表面以避免靶标物在基片表面的非特异性吸附。然后用去离子水冲洗 基片表面，并将基片吹干待用。需要特别指出的是，当样品中包含多种不同类型靶标物时， 由于样品溶液要穿越基片表面各个测试区，此时宜采用混合型封闭溶液进行封闭（例如采 用10?20mM Tris/PBS缓冲溶+0?5% BSA+0?5%糖原，pH = 7. 4)，并需针对具体体系 优化封闭液配方。
[0019] 4)目标分子的分区捕获：利用