一种基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其是一种基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。
【背景技术】
[0002]绵羊肺炎支原体ovipneumoniae, Mo)是引起山羊和绵羊间质性肺炎(非典型肺炎)的病原体，可致山羊及绵羊发生咳嗽、流鼻涕、渐进性消瘦和增生性间质性肺炎症状(张双翔等，2013 ;冉双存，2010 ;韩笑，2013)。Mo于1963年首次由Mackay等从苏格兰发病绵羊病肺组织中分离到病原后(Mackay等，1963)，西班牙、澳大利亚、新西兰、匈牙利、冰岛、英国、非洲许多国家相继报道Mo引起绵羊和山羊疾病的发生(许健等，2012)。我国自1978年从新西兰引进种羊中首次发现该病原后(胡景邵等，1982)，又相继在甘肃、宁夏、云南、贵州等多个省份有相关报道(张双翔等，2013 ;陆承平，2008 ；Falah M等，1997 ；Yang F等，2011)，对养羊业的危害日趋严重。
[0003]对绵羊肺炎支原体的防控，目前主要依靠药物预防，尚缺乏可靠的疫苗，究其原因与Mo分离培养费时费力及基因组研究缓慢有关(候相山等，2006 ;赵萍等，2008)。且目前缺乏疫病检测与防控所需的快速血清学检测手段，尤其可高通量检测、敏感性高的ELISA方法。Hsp70是支原体中具有高度保守性的生物大分子，由于它的免疫原性以及免疫佐剂效应而受到广泛关注(Falah M等，1997 ;张建华等，2011 ;李嫒等，2008 ；Li M等，2011)。研究发现，Hsp70 一般结构包含两个区域，分别是主要作用在于分子伴侣作用的N端，以及主要表现为免疫原和免疫佐剂作用的C端，可选择作为核酸疫苗研究及检测技术建立的目标蛋白(乔祖建等，2008 ;刘茂军等，2011)。而Hsp70蛋白较大(65~70Ku)，全基因表达易形成包涵体，影响表达效率，选用其相对稳定C末端基因可有效检测该蛋白的抗原性等特征(刘茂军等，2011 ;孙悦等，2013)。基于上述问题，本研究构建包含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体，并建立基于表达产物Mo Hsp70蛋白的间接ELISA方法。为本病的早期检测、疫苗免疫效果评价及相关研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是:提供一种基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒及其使用方法，它为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。
[0005]本发明是这样实现的:基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒,包被酶标板2个，Mo标准阳性血清ImL、Mo标准阴性血清lmL、酶标二抗300-500 μ L、50 X PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL_15mL、底物液B10mL_15mL和终止液10mL_15mL ;所述的包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为Mo Hsp70基因通过大肠杆菌Rosseta (DE3)表达系统获得Hsp70重组蛋白，并通过镍柱法进行重组蛋白纯化，使用包被缓冲液稀释为1.0μ g/100μ L ~2.5 μ g /100 μ L。
[0006]所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。
[0007]所述50XPBST 缓冲液的制备是:NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2PO4 10.0 g、Na2HPO4.12H20 145 g, Tween-20 25 mL 溶于 400 mL 蒸馏水，调整 pH 为 7.2 ?7.6，定容至1000 mL。
[0008]Mo标准阳性血清为自制高免血清，使用时按1:5稀释；所述的Mo标准阴性血清自制，使用时按1:5稀释。
[0009]所述封闭缓冲液为:脱脂奶粉0.3?0.7 g溶于100 mL PBST缓冲液。
[0010]所述底物液A的制备是:将磷酸氢钠14.60 g、柠檬酸9.33 g及过氧化氢脲0.52g，溶于三蒸水中，并定容至1000 mL,调至P H 5.0?5.4。
[0011]所述底物液B的制备是:将TMB 20mg中加入无水乙醇10 mL，再加双蒸水至1000mL,过滤除菌,无菌分装。
[0012]所述终止液为0.2 %?0.3% HF溶液。
[0013]所述的间接ELISA试剂盒的使用方法，它包括以下使用步骤:
1)以l.0yg/100 yL?2.5yg /100 μ L重组Mo Hsp70蛋白包被酶标板，室温过夜后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；
2)以0.3g/100mL?0.7g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37°C，封闭lh_3h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；4°C保存备用；
3)将阴、阳性对照血清及待检血清做1: 5倍稀释，按100 μ L加入酶标板反应孔中，37°C孵育Ih后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；
4)将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μ L加入酶标板反应孔，37°C作用Ih后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；
5)将底物液A和B各50μ L加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50 μ L终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值。
[0014]6)试验成立条件为阳性血清0D630平均值彡1.25，阴性血清0D630平均值< 0.35 ;试验结果判定标准为待检样本OD63tl值> 0.588为阳性，待检样本OD 63(|值< 0.588为阴性。
[0015]本发明选取核苷酸同源性较高的Mo贵州分离株株，通过Mo Hsp70基因原核表达载体的构建与表达，建立基于表达产物Mo Hsp70蛋白的间接ELISA方法，并进行条件优化，以便制备成商品化间接ELISA试剂盒。本发明适用于检测羊血清Mo Hsp70蛋白抗体,能够体现机体内Mo感染水平或疫苗免疫水平，将为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎疫病的早期监测、免疫效果评价及后续研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义，改变本病防控监测缺乏商品化ELISA试剂盒的局面。本发明与现有技术相t匕，具有以下的技术优势和积极效果:
(I)效果好:Hsp70抗体水平能够较好的体现机体Mo感染水平或疫苗免疫水平；本试剂盒相对于全菌蛋白包被其敏感性、特异性更高，为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎的早期监测、疫苗免疫效果评价具有重要意义。
[0016](2)制备简单:本试剂盒相对于全菌蛋白包被，解决了 Mo培养困难、培养周期长等问题，仅需对构建原核表达重组蛋白进行大批量生产、纯化，具有产量高、制备简单的优点。
【附图说明】
[0017]图1为本发明的Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒制备生产流程图。
【具体实施方式】
[0018]本发明的实施例:
基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒原料及配方为:
Mo标准阳性和标准阴性血清；重组蛋白为Mo Hsp70基因通过大肠杆菌Rosseta(DE3)表达系统获得Hsp70蛋白，并通过镍柱法进行重组蛋白纯化，经SDS-PAGE分析后得到纯化目的蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.0μ g /100 μ L ;包被缓冲液=Na2CO3 1.59g、NaHCO3
2.93g溶于去离子水中，定容至100mL,调至p H 9.5?9.8 ;酶标二抗:兔抗羊IgG-HRP ；IXPBST缓冲液:NaCl 8.0g,KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4.12H20 2.9g,Tween-20 0.5mL溶于800mL