蒸馏水，调整pH为7.2?7.6，定容至100mL ;封闭缓冲液:0.3g~0.7g脱脂奶粉溶于1mL PBST缓冲液；底物液A =Na2HPO4 14.60g、柠檬酸9.33 g、过氧化氢脲0.52 g，溶于三蒸水，并定容至I 000 mL,调至P H 5.0?5.4 ;底物液B:TMB 20mg、无水乙醇10 mL,加双蒸水至1000 mL，过滤除菌，无菌分装；终止液:0.2 %?0.3% HF溶液；
如图1所示意，本发明的间接ELISA试剂盒的制备方法为:
第一，原核表达系统表达融合蛋白pET-28a-Hsp70，并经镍柱法纯化得到融合蛋白浓度为0.23 mg/mLo应用SDS-PAGE和Western-blotting分析其纯化效果及反应原性；
第二，步骤一的纯化融合蛋白pET-28a-Hsp70作为包被抗原间接ELISA的条件优化为:间接ELISA方法最佳反应条件为:抗原包被液浓度1.0 μ g/100 μ L ;血清稀释度1:5 ;抗原包被条件37°C Ih再室温12h ;封闭液5%脱脂奶粉，封闭时间1.5h ;酶标二抗稀释浓度1:2000 ;显色反应时间15min ；
第三，取80份已知Mo抗体阴性的猪血清，按步骤二确定的最佳反应条件，进行间接ELISA反应。样本OD63tl值> 阴性样本OD63tl值的平均值(X) +3 (SD) = 0.588，可在99%的水平上判为阳性。因此当样本OD63tl值彡0.588时，判为阳性；当样本(?63。值< 0.588时，判为阴性；
第四，基于重组Mo Hsp70蛋白间接ELISA试剂盒的最佳使用步骤与方法确定①以1.0 μ g/100 μ L重组Mo Hsp70蛋白包被ELISA反应板，室温过夜后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；②以0.5mg/100yL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37 °C，封闭lh-3h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次将待检血清用PBST做1: 5倍稀释，按100 μ L加入ELISA反应板，37°C作用Ih后，应用PBS洗涤ELISA反应板5次；@将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100 μ L加入ELISA反应板，37°C作用Ih后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；⑤将底物液A和B各50 μ L加入ELISA反应板，避光室温显色15min，加入50 μ L终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值。⑥试验结果判定标准为样本OD63tl值(样本OD ■值>阴性样本OD 63Q值的平均值(X) +3标准差(SD) ) ^ 0.588为阳性，00630值< 0.588为阴性；
第五，应用步骤三建立的间接ELISA方法，检测Mo标准阳性血清的OD63tl值为1.403 ；而检测丝状支原体山羊亚种、弓形虫、口蹄疫、山羊痘、蓝舌病等标准阳性血清的OD63tl值在
0.055-0.251，说明建立的间接ELISA特异性良好；
第六，应用步骤三建立的间接ELISA方法，批内及批间重复性试验变异系数为均(15.0%，确定该间接ELISA批内重复性及批间重复性良好；
第七，应用步骤三建立的间接ELISA方法，检测92份临床羊血清样本，阳性率为40.22%(37/92)，确定其临床适用性良好；
第八，步骤五、步骤六和步骤七合格即制得基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒。
[0019]以上第一至第七步骤中按照原料配比进行。
【主权项】
1.一种基于绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于:包被酶标板2个，Mo标准阳性血清ImL、Mo标准阴性血清ImL、酶标二抗300-500 μ L、50 X PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL_15mL、底物液B10mL_15mL和终止液10mL_15mL ;所述的包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为Mo Hsp70基因通过大肠杆菌Rosseta (DE3)表达系统获得Hsp70重组蛋白，并通过镍柱法进行重组蛋白纯化,使用包被缓冲液稀释为1.0 μ g/100 μ L~2.5 μ g /100 μ L。
2.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP,按1:2000稀释使用。
3.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述50X PBST缓冲液的制备是:NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2PO4 10.0 g、Na2HPO4.12H20 145 g, Tween-20 25 mL 溶于400 mL蒸馏水，调整pH为7.2?7.6，定容至1000 mL。
4.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:Mo标准阳性血清为自制高免血清，使用时按1:5稀释；所述的Mo标准阴性血清自制，使用时按1:5稀释。
5.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述封闭缓冲液为:脱脂奶粉0.3?0.7 g溶于100 mL PBST缓冲液。
6.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述底物液A的制备是:将磷酸氢钠14.60 g、朽1檬酸9.33 g及过氧化氢脲0.52 g,溶于三蒸水中，并定容至1000 mL,调至P H 5.0?5.4。
7.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述底物液B的制备是:将TMB 20mg中加入无水乙醇10 mL,再加双蒸水至1000 mL,过滤除菌,无菌分装。
8.如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒，其特征在于:所述终止液为0.2 %?0.3%HF溶液。
9.一种如权利要求1所述的间接ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于:它包括以下使用步骤: 1)以l.0yg/100 yL?2.5yg /100 μ L重组Mo Hsp70蛋白包被酶标板，室温过夜后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次； 2)以0.3g/100mL?0.7g/100mL的脱脂奶粉溶液封闭ELISA反应板，37°C，封闭lh_3h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；4°C保存备用； 3)将阴、阳性对照血清及待检血清做1: 5倍稀释，按100 μ L加入酶标板反应孔中，37°C孵育Ih后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次； 4)将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μ L加入酶标板反应孔，37°C作用Ih后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次； 5)将底物液A和B各50μ L加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50 μ L终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值； 6)试验成立条件为阳性血清0D630平均值>1.25，阴性血清0D630平均值< 0.35 ;试验结果判定标准为待检样本OD63tl值> 0.588为阳性，待检样本OD 63(|值< 0.588为阴性。
【专利摘要】本发明公开了一种基于Mo Hsp70 蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法。基于Mo Hsp70蛋白的间接ELISA试剂盒原料及配方为：包被Mo Hsp70 蛋白的酶标板、Mo标准阳性和标准阴性血清、酶标二抗、50×PBST缓冲液、封闭缓冲液、底物液A、底物液B和终止液。本发明能检测羊血清Mo Hsp70蛋白抗体，将为Mo引起的山羊和绵羊间质性肺炎的早期监测、疫苗免疫效果评价及相关研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。
【IPC分类】G01N33-68
【公开号】CN104597249
【申请号】CN201510019996
【发明人】程振涛, 王慧, 王开功, 周碧君, 文明, 岳筠
【申请人】贵州大学
【公开日】2015年5月6日
【申请日】2015年1月15日