用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原 刺激物及其应用、及含有该抗原刺激物的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌引起的一类严重危害人类健康的传染病。虽然结核分枝 杆菌最初感染人体的呼吸系统，但是它能扩散至人体几乎所有的器官并且导致相应的疾病 发生。据估计，全球大约有1/3的人口感染了结核分枝杆菌，并且每年有800万新发感染病 例，每年有200万人死于结核病。我国的结核疫情和结核分枝杆菌感染情况都相当严重，是 全球22个结核病高负担国家之一，结核病人数位居世界第二。
[0003] 所述的结核分枝杆菌感染，通常是指患有活动性结核或潜伏性结核感染的人群， 也可以是健康接触者。机体在感染结核分枝杆菌后，有少数发展为活动性结核，表现出相应 的临床症状，如发热、咳嗽、咳痰、胸片异常等。大多数人感染后无相应的临床症状，但是机 体无法清除全部的结核分枝杆菌，即为潜伏性结核感染。潜伏性结核感染者在免疫力低下 等情况下可发展为活动性结核病。
[0004] 结核病的早期诊断对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传播具有重要 意义。目前诊断结核感染的方法有限，主要包括结核分枝杆菌素皮肤实验（TST)、痰涂片、 痰细菌培养、放射性X光片、血清学抗体抗原免疫检测以及PCR和核酸杂交法等。结核分 枝杆菌感染引起的T细胞γ-干扰素（IFN-γ)释放试验（interferon-gamma release assay，IGRA)是近年发展起来的新方法，可用于诊断活动性结核病和结核潜伏感染。已经得 到美国 FDA 批准上市的 T-SP0T· TB 试剂盒（Oxford Immunotec Limited, Aingdon, United Kingdom)和QuantiFERON-TB Gold试剂盒都是基于IGRA原理，以RDl区基因编码的结核 抗原特异性蛋白-6KD早期分泌靶向抗原（ESAT-6)和10KD培养滤过蛋白（CFP-10)为刺激 源，通过检测外周血中结核特异性释放IFN- γ的T淋巴细胞来诊断结核感染，敏感度和特 异性都较高。
[0005] 目前诊断结核感染的传统方法存在较多缺点和不足，结核分枝杆菌素皮肤实验 (TST)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物（pro)中含有许多分枝杆菌种类（包括致病性 分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此pro诊断结核病的特异性差，不能 准确区分pro实验结果阳性宄竟是因为BCG接种、接触环境中多种非结核分枝杆菌后的致 敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。痰涂片方法虽然简单易行，但是很大一部分结核病 人痰里面并不一定有结核分枝杆菌（所谓的"痰阴"结核）。所以，痰涂片培养办法具有诊 断阳性率低、易漏检、痰细菌培养周期长、培养成功率低（只有80%左右）等缺点。痰标本 的核酸成分检测不仅面临"痰阴结核"的诊断困境而且程序复杂、容易出现假阳性。因此， 免疫学技术就成了结核分枝杆菌感染诊断的重要方法。
[0006] T-SP0T. TB试剂盒和QuantiFERON-TB Gold试剂盒成份复杂、价格昂贵、成本极 高，严重制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以亿计的结核潜伏感染人群进 行大规模结核筛查与诊断。另外，这些试剂盒中包含的抗原肽极为复杂而且并非主要根据 中国人的主要组织相容性抗原进行抗原肽的设计、筛查与验证，所以适用性与使用效果需 要更进一步提升。公开号为CN 102516356 A的中国专利申请从抗原Rv3615c筛选出8-11 个连续的多肽片段作为刺激源，采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT)诊断结核感染，但是其 灵敏度只有64%，远远达不到商品化试剂盒的要求。公开号为CN 102297968 A的中国专利 申请采用的抗原刺激物是结核分枝杆菌ESAT-6抗原和CFP-10抗原的9条多肽的组合，并 且使用了 IFN-γ、TNF-a、IL-2、MIG和IP-10五种抗体包裹的磁珠，同时检测细胞培养上清 的五种细胞因子，这就造成了其检测方法和结果分析的复杂性，并且需要使用流式细胞仪， 增加了检测的成本，限制了其推广使用。公开号为CN 103604933 A的中国专利申请是基于 TNF- a细胞因子ELISA检测活动性结核病的试剂盒，该试剂盒使用的抗原刺激物是ESAT-6 和CFP-10整条蛋白，然而由于整条蛋白的空间构象可能会阻碍有效的抗原表位与T淋巴细 胞表面的识别分子结合，并且其含有其他的抗原表位可能会产生负向调节，影响细胞因子 的分泌，造成该试剂盒对潜伏感染结核的诊断效果较差。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种用于结核分枝杆菌感染检测的抗原刺激物、及含有该 抗原刺激物的试剂盒。本发明所提供的抗原刺激物能够有效刺激结核感染患者的外周血T 淋巴细胞产生IFN-γ，从而能够高灵敏和高特异的诊断结核感染，并且不受BCG接种或者 其他基础性疾病的影响。
[0008] 本发明为达到其目的，采用的技术方案如下：
[0009] 本发明第一方面提供一种用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物，其包含如序 列表中序列1?11所示的多肽中的至少一种多肽或其类似物。氨基酸序列如序列1?11 所示的多肽，序列如下：
[0010] SEQ ID NO. I ：AGIEAAASAIQGNVTSI
[0011] SEQ ID NO. 2 ：YQGVQQKffDATATELNNALQNL
[0012] SEQ ID NO. 3 ：RTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
[0013] SEQ ID NO. 4 ：MAEMKTDAATLAQEAGNF
[0014] SEQ ID NO. 5 ：GAAGTAAQAAVVRFQEAA
[0015] SEQ ID NO. 6 ：VVRFQEAANKQKQELDEI
[0016] SEQ ID NO. 7 ：YQGVQQKffDATATELNNALQ
[0017] SEQ ID NO. 8 ：ISEAGQAMASTEGNVTGMFA
[0018] SEQ ID NO. 9 ：MAEMKTDAATLAQEA
[0019] SEQ ID NO. 10 ：AAGTAAQAAVVRFQE
[0020] SEQ ID NO. 11 ：VRFQEAANKQKQELD
[0021] 其中，SEQ ID NO. I?3、及SEQ ID NO. 7?8来源于结核特异性抗原多肽ESAT-6， SEQ ID NO. 4?6及SEQ ID NO. 9?11来源于结核特异性抗原多肽CFP-10。
[0022] 优选的，所述抗原刺激物由序列表中序列1及序列7?8所示的多肽或其类似物 组成；或者，所示抗原刺激物由序列表中序列9?11所示的多肽或其类似物组成。
[0023] 最为优选的，所述抗原刺激物由序列表中序列1?3所示的多肽或其类似物组成； 或者，所述抗原刺激物由序列表中序列4?6所示的多肽或其类似物组成。采用这种优选方 式，其检测效果最佳，检测灵敏度最佳，对结核感染疑似标本的检测阳性符合率高达89%， 阴性符合率高达100%。采用优选的抗原刺激物，对大范围志愿者的标本进行测试，可以有 效避免其他非结核分枝杆菌导致的肺部感染对结果的干扰，从而有效识别结核分枝杆菌感 染，因此具有高度的灵敏性与特异性。另外，我们的试剂盒阳性符合率（灵敏性与特异性） 明显高过现有专利技术，现有的一些专利技术的灵敏度大致是60%左右（这样的灵敏度在 临床上难正常使用）。另外，本专利试剂盒可以对大规模未知人群进行结核筛查，从实施例 4(图5、图6)可以看出，可以从37个未知人中筛查出1个结核患者，排除肿瘤、其他肺部感 染、流感等疾病的干扰，具有高度的特异性与灵敏性，从而可以适用于大规模人群普查，该 特点对于在中国进行结核患者筛查显得尤为重要，且其诊断灵敏性与特异性显著优于现有 专利技术。
[0024] 所述类似物，是指其特性与所述多肽相同，包括其同样可以与抗体特异性地结合， 这种同源肽通常具有至少70%的同源性，优选至少90%、95%的