石墨烯/类过氧化物酶双信号放大检测白血病的生物传感方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器的医学基础应用领域，涉及一种石墨烯/类过氧化物酶双 信号放大检测白血病的生物传感方法。
【背景技术】
[0002] 白血病是一类常见和多发的造血干细胞克隆性恶性疾病，是我国十大高发恶性肿 瘤之一，居35岁以下人群恶性肿瘤死亡率的首位，其发病率有逐年增高的趋势。其诊断分 型最初是1976年由法（F)、美（A)、英⑶协作组提出的FAB分类，它是诊断白血病的传统 方法。随着细胞遗传学和免疫分型在白血病诊断中的应用，又提出了白血病的细胞形态学 (Morphoiogic)、免疫学（Immunologic)、细胞遗传学（Cytogentic)MIC 分型。20 世纪 80 年 代以来，由于MIC亚型特征性染色体异常受累基因的克隆及对这些基因功能的不断剖析， 又逐渐形成了基于细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学（Molecular)的MIC-M分 型。近年来，随着细胞遗传学、分子生物学技术的飞速发展，染色体分析、Southern-Blot、 RT-PCR及FISH等技术被用于白血病的临床诊断。然而这些方法仍存在较多缺点，如检测 方法复杂、放射性污染、灵敏度低、测试费用昂贵等，因此，在临床诊断中，形态学检测及抗 原-抗体特异性识别的免疫学表型检测仍是白血病诊断的基础。但单纯依靠形态学检查很 难进行准确的分型诊断，而免疫学表型检测需要相应的抗体，并且操作繁琐，价格昂贵，因 此，发展新的快速、灵敏、经济的白血病检测新方法具有非常重要的临床意义。
[0003] 近年来，纳米技术迅速发展并渗透于医学领域，为肿瘤的早期诊断带来曙光。美国 国立卫生研宄院于2005年启动了"癌症纳米技术计划"，旨在将纳米技术、癌症研宄与分子 生物医学相互结合，实现减轻癌症病人痛苦和降低死亡率的目标。石墨烯（graphene)是一 种通过sp2杂化组成的碳二维纳米结构，是所有其他维度（如零维富勒烯、一维碳纳米管、 三维石墨等）碳质材料的基本构造单元。它具有独特的纳米结构和热、机械及电学属性，如 比表面积大、表面反应活性高、催化效率高、吸附能力强等优点，特别适用于敏感分子的固 定、信号的传感和放大。血红素是一种铁卟啉配合物，为人体内血红蛋白的核心，由于其价 格低廉，性质稳定以及可以催化氧气、过氧化氢等的还原而被广泛应用，但其催化活性和电 化学稳定性并不令人满意。通过Hemin与石墨稀之间JT-JT相互作用制备的Hemin功能化 石墨烯纳米杂化材料（HGNs)在水溶液中具有很好的稳定性，石墨烯表面附着的血红素使 得HGNs具有过氧化氢酶的性质，而石墨稀能提高Hemin的催化活性及稳定性。因此，HGNs 可作为一种具有过氧化物酶催化活性的纳米材料应用于生物传感器的制备中，而将HGNs 应用于肿瘤细胞的检测尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种用于白血病细胞检测的试剂盒。
[0005] 本发明所提供的用于白血病细胞检测的试剂盒，含有如下（a)和（b):
[0006] (a)磁珠捕获探针；
[0007] 所述磁珠捕获探针由磁珠和固定于所述磁珠上的捕获探针组成；所述捕获探针为 序列表中序列1所示的单链DNA分子；
[0008] (b)适配体功能化Hemin-石墨稀复合纳米材料；
[0009] 所述适配体功能化Hemin-石墨稀复合纳米材料由经氯化高铁血红素（Hemin)修 饰的石墨烯和固定于所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯上的适配体探针组成；所述适配 体探针为序列表中序列2所示的单链DNA分子。
[0010] 在所述试剂盒中，所述适配体功能化Hemin-石墨稀复合纳米材料具体可按照包 括如下步骤的方法制备得到：按照所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯与所述适配体探针 的配比为0. 5mg :4-40nmol (如Img :8nmol)的比例，将所述经氯化高铁血红素修饰的石墨 烯的悬浊液与所述适配体探针的溶液混合，20-25°C (如25°C )避光孵育16-24h (如24h)， 得到所述适配体功能化Hemin-石墨稀复合纳米材料。
[0011] 其中，所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯的悬浊液中，所述经氯化高铁血红 素修饰的石墨烯的含量为lmg/ml。所述适配体探针的溶液中，所述适配体探针的浓度为 8 μΜ〇
[0012] 在进行所述20-25°C避光孵育16-24h(如24h)的期间，还包括向孵育体系中加入 NaCl，至所述NaCl的终浓度为IOmM的步骤。
[0013] 其中，所述向孵育体系中加入NaCl为向所述孵育体系中逐次加入NaCl ;具体为： 每次0. 5 μ L NaCl溶液（浓度为1M)，每5个小时加一次。
[0014] 在所述试剂盒中，所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯是将氧化石墨烯和氯化高 铁血红素按照质量比为1 :(1?10)(如1:1)的比例制备得到的。
[0015] 所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯具体是按照包括如下步骤的方法制备得到 的：将氧化石墨烯和氯化高铁血红素按照质量比为1 :(1?10)(如1:1)的比例混合后，加 入氨水和水合肼，60°c孵育2-6h (如4h)，得到所述经氯化高铁血红素修饰的石墨烯。
[0016] 其中，所述加入氨水和水合肼具体为：加入的所述氨水（质量分数为25-28% )与 氯化高铁血红素的比例为10 yL :lmg，加入的所述水合肼（质量分数为80% )与氧化石墨 稀的比例3 μ L :lmg。
[0017] 在所述试剂盒中，所述磁珠捕获探针按照包括如下步骤的方法制备得到：将经生 物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠共同孵育，获得所述磁珠捕获探 针。
[0018] 在本发明中，所述生物素具体标记于所述捕获探针的3'端。
[0019] 进行所述孵育时，经生物素标记的所述捕获探针与经链霉亲和素标记的所述磁珠 的配比具体为IOOpmol : Img ;
[0020] 进一步，所述孵育具体为20-30°C (如25°C )80-150rpm(如IOOrpm)震荡孵育 10-30min (如15min)。所述孵育的液体环境为结合缓冲液；所述结合缓冲液的溶剂为水，溶 质及浓度如下：Tris 0· 605g/L，EDTA 0· 185g/L，NaCl 58. 45g/L，HCl 调节 pH 至 7. 5。
[0021] 更加具体的，在本发明的一个实施例中，所述磁珠捕获探针的制备方法包括如下 步骤：分别取浓度为500nM(以DNA计量）的经生物素标记的所述捕获探针的溶液（溶剂 为所述结合缓冲液）和浓度为l〇mg/ml (以磁珠计量）的经链霉亲和素标记的所述磁珠 溶液（溶剂为所述结合缓冲液），按照体积比2:1的配比混合，20-301(如25°〇80? 150rpm(如IOOrpm)震荡孵育10-30min (如15min)，即获得所述磁珠捕获探针。
[0022] 在所述试剂盒中，还可含有记载有如下（A)和/或（B)的可读载体（如说明书）：
[0023] ㈧检测或辅助检测待测细胞是否为白血病细胞的方法，包括如下步骤：
[0024] (al)将所述适配体功能化Hemin-石墨稀复合纳米材料、待测细胞和所述磁珠捕 获探针按照25 μ g :105个：25 μ g的配比混合，37°C避光孵育30min ;所述磁珠捕获探针的量 以磁珠量计；
[0025] 根据需要，在所述孵育之后还可包括采用清洗缓冲液对产物进行清洗的步骤； 所述清洗缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，CaCl2O. 14g/L， Na2HPO4 · H2O 0· lg/L，MgCl2 · 6H20 I. 42g/L，NaHCO3O. 35g/L，KH2PO4O. 2g/L，葡萄糖 4. 5g/L。
[0026] (a2)对步骤（al)孵育后的体系进行磁富集，去除上清，向富集产物中加入TMB显 色液和过氧化氢，37°C避光孵育30min ;
[0027] (a3)按照如下方法确定待测细胞是否为白血病细胞：若步骤（a2)孵育后的体系 较孵育前相比发生了显色反应（