一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒，所述试剂盒包括：A试剂：制法为：第一适配体的5′端依次连接有6个(CH2)和氨基后，与羧基化荧光磁性编码微球在TE缓冲液中，通过氨基-羧基进行偶联得到捕获探针液体；B试剂：制法为：用磷酸盐缓冲液稀释5′端生物素化的第二适配体至1μM；C系列试剂：浓度为0、1、1.75、3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450和900nM的凝血酶水溶液；D试剂：制法为磷酸盐缓冲液配制链霉亲和素-藻红蛋白溶液。本发明的试剂盒能对凝血酶快速、准确、高效的定量检测，为临床提供早期诊断治疗的依据，并可发展应用于临床上大规模血清样本的检测。
【专利说明】一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测凝血酶的试剂盒。
【背景技术】
[0002]凝血酶是人体凝血系统中衡量凝血功能的重要指标,也是一些肿瘤患者血凝机制改变、脑出血等重大疾病诊断、治疗的生物标志物，它的浓度及活性是衡量人体凝血机制功能正常与否的重要指标，对早期诊断、疗效监测及预后判断具有重要意义。
[0003]核酸适配体，即寡核苷酸适配体，能够与转移配体特异结合的单链寡核苷酸序列，。通常是有20-60nt核苷酸组成的RNA或单链DNA。适配体与靶标物的特异结合是由于单链核酸空间构象的多样性。靶标物存在时，单链核酸由于静电作用、氢键作用、某些碱基配对等，自身发生折叠，形成稳定的三维空间结构，如假结、发卡、G-四分体和凸环等。现在已经筛选出用于识别蛋白质、重金属离子、氨基酸和小分子毒素等的适配体。核酸适配体被人们比喻为“化学抗体”。核酸适配体易于制备和成本较抗体低的优势越来越成为一种理想的抗体替代物。研究表明，核酸适配体与靶标物的靶点之间亲和力比抗体更高，而且核酸适配体主要通过PCR技术筛选和合成，生产成本较抗体大大降低，也因此具有不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并易于长期保存和室温运输等优点；核酸适配体良好的特异性，可以很好解决多种抗原抗体之间存在交叉反应干扰的难题。
[0004]悬浮芯片技术整合了流式细胞技术与荧光微球技术的优势，将有色微球、激光技术、应用流体学、高速数字信号技术和计算机运算法则相结合，提高了检测特异性和灵敏度，具有重复性与稳定性好、检测指标可灵活选择以及高灵敏度与高信噪比等诸多优点；在进行多样本，如血清或者其他生物样品的检测，样品量仅需要μ L到数十yL。
[0005]传统测定凝血酶的试剂盒主要有发色底物和酶联免疫吸附试剂盒等，这些试剂盒简单易行，但灵敏度不够高，不宜进行微量分析。荧光法是将荧光底物与凝血酶结合，通过测定荧光强度可以得出凝血酶的含量，单纯使用荧光法需要用荧光底物标记凝血酶，操作步骤繁琐，荧光背景不易降低，灵敏度低。针对以上问题，建立一种检测凝血酶的适配体-悬浮芯片试剂盒，实现对人血清样本中凝血酶快速、准确、特异和高效的定量检测，目前并未见相关类似报道。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒。
[0007]本发明的技术方案概述如下:
[0008]一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒，包括:
[0009]A试剂:用下述方法制成:第一适配体的5'端依次连接有6个(CH2)和氨基后，与羧基化荧光磁性编码微球在pH = 8.0的100X稀释的TE缓冲液中，通过氨基-羧基进行偶联得到捕获探针液体；所述捕获探针液体中捕获探针的浓度为2000个/μ L ;所述第一适配体序列用SEQ ID N0.1所示；
[0010]B试剂:用下述方法制成:用含0.005Μ MgCl2、浓度为0.01M的pH = 7.4磷酸盐缓冲液稀释5'端生物素化的第二适配体至I μ M ;所述第二适配体序列用SEQ ID N0.2所示；
[0011]C 系列试剂:浓度为 O、1、1.75,3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450 和 900ηΜ 的凝
血酶水溶液；
[0012]D试剂:用下述方法制成:用pH = 7.4的浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液为溶剂配制浓度为?ο μ g/mL链霉亲和素-藻红蛋白溶液。
[0013]优点:本发明的试剂盒能对凝血酶快速、准确、高效的定量检测，为临床提供早期诊断治疗的依据，并可进一步发展应用于临床上大规模血清样本的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明的试剂盒检测凝血酶模式图。
[0015]图2为凝血酶检测标准曲线。
[0016]A图为凝血酶浓度为7_56nM时的标准曲线；
[0017]B图为凝血酶浓度为56_900nM时的标准曲线； [0018]MFI 为凝血酶浓度为 O、1、1.75,3.5、7、14、28、56、90、112.5、225和 450nM检测所获得的系列有效中位荧光强度值；
[0019]MF10为凝血酶浓度为900nM时所获得的有效阳性中位荧光强度值；
【具体实施方式】
[0020]羧基化突光磁性编码微球(Luminex公司，美国)
[0021]人α-凝血酶(Enzyme Research Laboratories,美国，本发明各实施例采用的是人α-凝血酶)
[0022]人血清标准样品(不含凝血酶，中杉金桥生物技术有限公司，北京)
[0023]链霉亲和素-藻红蛋白(Invitrogen公司，美国)
[0024]96 孔细胞板(Costars 3599，Corning 公司，美国)
[0025]小型台式涡旋振荡器(MS3_Digital，IKA公司，德国)
[0026]悬浮芯片系统(LX200，Luminex公司，美国)
[0027]磁分离器(LifeSep?96F,Luminex 公司，美国)
[0028]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0029]实施例1
[0030]一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒，包括:
[0031]A试剂:用下述方法制成:第一适配体的5'端依次连接有6个(CH2)和氨基后，与羧基化荧光磁性编码微球在pH = 8.0的100X稀释的TE缓冲液中，通过氨基-羧基进行偶联得到捕获探针液体；所述捕获探针液体中捕获探针的浓度为2000个/μ L ;所述第一适配体序列用SEQ ID N0.1所示；
[0032]SEQ ID N0.1:TTT TTT TTT TGG TTG GTG TGG TTG G ；
[0033]第一适配体的5'端依次连接有6个(CH2)和氨基的序列=NH2- (CH2) 6_TTT TTT TTTTGG TTG GTG TGG TTG G ；
[0034]B试剂:用下述方法制成:用含0.005M MgCl2、浓度为0.01M的pH = 7.4磷酸盐缓冲液稀释5'端生物素化的第二适配体至IliM ;所述第二适配体序列用SEQ ID N0.2所示；
[0035]SEQ ID N0.2:TTT TTA GTC CGT GGT AGG GCA GGT TGG GGT GAC T ；
[0036]第二适配体的5 ^端生物素化的第二适配体的序列:B1tin_TTT TTA GTC CGT GGTAGG GCA GGT TGG GGT GAC T ；
[0037]C 系列试剂:浓度为 O、1、1.75,3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450 和 900ηΜ 的凝
血酶水溶液；
[0038]D试剂:用下述方法制成:用pH = 7.4的浓度为0.01M的磷酸盐缓冲液为溶剂配制浓度为10 μ g/mL链霉亲和素-藻红蛋白溶液。
[0039]实施例2
[0040]使用实施例1的一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒绘制凝血酶检测的标准曲线: [0041]①各取10 μ L C系列试剂中各个浓度的凝血酶水溶液加到96孔板中，各加入临用时煮沸冷却至室温下的9 μ L B试剂，涡旋混匀，37°C 700rpm振荡孵育30min ；
[0042]②将临用时超声Imin的A试剂，涡旋混匀后取IyL加到上述各个孔中，涡旋混匀，37 °C 700rpm振荡孵育30min，于磁分离器上分离甩去上清，50 μ L洗涤缓冲液(0.02Μ Tris-HCl, pH = 7.4)洗涤，涡旋混匀后磁分离弃上清避光加入50 μ L D试剂，混匀370C 700rpm振荡孵育30min ;在25°C条件下利用悬浮芯片系统对其上机检测，记录有效中位荧光强度值MFI ；以将900nM凝血酶的中位荧光强度值作为有效阳性中位荧光强度值MF10,以为 MFI/MFI。为 Y 轴，以凝血酶浓度值(0、1、1.75,3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450和900nM)为X轴绘图，采用4P-L0gistic回归曲线和直线对凝血酶不同浓度区间进行分段拟合，得到图2。
[0043]当检测温度非25V ±2°C条件时，要根据现场的温度重新使用实施例1的一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒绘制凝血酶检测的适配体-悬浮芯片标准曲线。
[0044]实施例3
[0045]血清样本中凝血酶的测定
[0046]在未含有凝血酶的人血清标准样本中加入不同量的凝血酶标准品，检测之前将各个凝血酶标准品用TE缓冲液稀释100倍，进行加标检测。具体方法是将每个样品检测所获得的MFI值，除以MFItl后得到的比率代入实施例2所获得的标准曲线方程中，即可得到待测样本中凝血酶的检测量。通过样本的加标量和检测量分别计算回收率和相对标准偏差。由表1可知，回收率在82.6%到114.2%之间，相对标准偏差在10%以内。
[0047]表1人血清中凝血酶加标检测结果(η = 3)
[0048]
【权利要求】
1.一种用适配体-悬浮芯片检测凝血酶的试剂盒，其特征是包括: A试剂:用下述方法制成:第一适配体的5'端依次连接有6个(CH2)和氨基后，与羧基化荧光磁性编码微球在pH = 8.0的10X稀释的TE缓冲液中，通过氨基-羧基进行偶联得到捕获探针液体；所述捕获探针液体中捕获探针的浓度为2000个/μ L ;所述第一适配体序列用SEQ ID N0.1所示； B试剂:用下述方法制成:用含0.005Μ MgCl2、浓度为0.0lM的pH = 7.4磷酸盐缓冲液稀释5'端生物素化的第二适配体至I μ M ;所述第二适配体序列用SEQ ID N0.2所示； C 系列试剂:浓度为 O、1、1.75,3.5、7、14、28、56、90、112.5、225、450 和 900ηΜ 的凝血酶水溶液； D试剂:用下述方法制成:用pH = 7.4的浓度为0.0lM的磷酸盐缓冲液为溶剂配制浓度为10 μ g/mL链霉亲和素-藻红蛋白溶液。
【文档编号】G01N21/64GK104034712SQ201410310023
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】刘楠, 高志贤, 刘亚楠, 马新华, 李晓丽, 欧国荣 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所