多聚体蛋白质的新免疫原性模拟物的制作方法

专利名称：多聚体蛋白质的新免疫原性模拟物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗学免疫疗法领域，特别是目标为下调自体(“自身”)蛋白质和其它弱免疫原性抗原的主动免疫疗法领域。本发明因此提供多亚基蛋白的新的和改善的免疫原性变体以及制备该变体必要的工具。本发明另外涉及免疫疗法的方法以及在该方法中有效的组合物。
背景技术：
在最近20多年中主动免疫疗法(“接种”)作为治疗或减轻疾病的手段已经受到增长的关注。显著地，自从报道使用抗受精疫苗的第一次实验的70年代后期，已经已知主动免疫疗法作为破坏对以某种方式与病理(或另外不希望有的)生理疾病相关的自体蛋白的耐受性的手段的应用。
通过“免疫原化”相关自身蛋白，例如通过化学偶联(“缀合”)至大的外源和免疫原性载体蛋白(参考美国4,161,519)或通过制备自体蛋白和外源载体蛋白之间的融合构建体(参考WO 86/07383)，已经常规制备针对自体抗原的疫苗。在这些构建体中，免疫原性分子的载体部分负责提供T-辅助淋巴细胞表位(“TH表位”)，其致使可以破坏自身耐受性。
后来的研究已经证明尽管该策略确实可以提供对自体蛋白的耐受性的破坏，然而遇到许多问题。最重要的是随时间诱导的免疫应答将由针对免疫原载体部分的抗体支配而对自体蛋白的反应性经常下降的事实，当载体先前已经用作免疫原时该效应特别明显-该现象称为载体抑制(参考例如Kaliyaperumal等1995，Eur.J.Immunol 25，3375-3380)。然而，当使用治疗接种时通常需要每年再免疫数次和保持该治疗多年，这还导致其中以针对自体分子的免疫应答为代价针对载体部分的免疫应答将愈加占优势的情形。
当将半抗原-载体技术用于破坏自身耐受性时，涉及的另外的问题是在该构建体中载体对自体蛋白部分施加的负空间效应由于表位简单的屏蔽或掩蔽或由于在免疫原自身部分中诱导的构象变化，可接近的类似在天然自体蛋白中所见构象模式的B-细胞表位的数量经常减少。最后，经常难以足够详细地表征半抗原-载体分子。
WO 95/05849提供上述半抗原-载体策略的改进。据证明其中少至1个单一外源TH表位内替代(in-substituted)的自身蛋白能够破坏对自体蛋白的耐受性。焦点放在自体蛋白三级结构的保持以便确保尽管外源TH元件的引入在免疫原中保持最大数量的自体B-细胞表位。该策略已经普遍证明极其成功，因为诱导的抗体是广谱的以及高亲和力的，并且免疫应答具有比当用常规载体构建体免疫时看到的更早的起始和更高的效价。
WO 00/20027提供上述原理的扩展。发现在自身蛋白编码序列中单个TH表位的引入可以诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其特异性地与表达自身蛋白的细胞反应。WO 00/20027的技术还提供联合治疗，其中抗体和CTL都被诱导-在这些实施方案中，免疫原仍必须保存B-细胞表位的基本部分。
WO 95/05849和WO 98/46642都公开适合于下调TNFα(肿瘤坏死因子α)活性的疫苗技术，TNFα是一种涉及几种疾病如I型糖尿病，类风湿性关节炎，和炎性肠病的病理学的细胞因子。两个公开教导当该分子遭遇免疫系统时单体TNFα三级结构的保存。
WO 00/65058涉及白细胞介素5(IL5)的下调，白细胞介素5(IL5)是一种涉及嗜曙红粒细胞活性的活化的分子，该活性在多种呼吸道疾病如慢性哮喘的发病机理中是重要的。据教导可以借助多肽接种技术，活疫苗和核酸接种完成下调，并且据进一步教导如果产生针对IL5的免疫应答B-细胞表位的保存是重要的。
尽管上述参考的技术已经提供非常有希望的结果，当评估疫苗方法在抗击疾病中的生存力时几种因素开始起作用。这些因素之一是免疫原性蛋白质的表达水平。
例如，为了使核酸疫苗有功能，体内转染编码“免疫原化的”自体蛋白的构建体的细胞必须能够表达足量的免疫原以便诱导适当的免疫应答。此外，基于多肽的疫苗要求免疫原性蛋白质能以工业发酵方法以令人满意的量生产。然而，经常观察到在已知蛋白质的氨基酸序列中即使轻微的变化可以对能够回收的蛋白量具有显著的影响。
另外，遗传修饰的蛋白质序列的稳定性可能较不最佳(在贮存期限和体内稳定性两方面)。
最后，当期望下调的自身蛋白是杂聚物或同聚物时，未必该蛋白质的单体单元的变体将能够诱导对多聚蛋白的天然构象充分特异的抗体。
发明目的本发明的一个目的是提供多聚自体蛋白的改善的免疫原性的类似物以及提供诱导针对该多聚自体蛋白的体液免疫的改善方法。本发明的另一目的是提供自身蛋白的免疫原性的类似物，当在异种宿主细胞中表达时其具有改善的稳定性和显示改善的性质。最后，提供当制备或使用改善的免疫原时有用的方法和措施也是本发明的目的。
发明概述当在细菌宿主细胞中生产大规模量的重组蛋白质时，经常期望表达产物变得可以作为细菌内的内含体获得。对此的原因有几个例如当蛋白质作为不溶性的内含体表达时表达产率通常显著较高，并且也易于蛋白质的纯化，因为期望的表达产物容易和便利地从来自细菌发酵的可溶性蛋白中分离。
当表达重组蛋白质为不溶性内含体时，经常需要将表达产物进行各种蛋白质重折叠过程以便获得其生物活性形式，即使该步骤导致未折叠成正确的生物活性形式的总重组蛋白的一定损失但这通常是可接受的。
然而，当生产非免疫原性的自身蛋白的重组免疫原性变体时，需要引入TH表位，由此当与天然自身蛋白相比较时蛋白质产物的一级结构被改变。本发明人已经体验即使最轻微的变化导致内含体表达接着重折叠的常规方法不实际与天然自身蛋白相比已经保持令人满意的B-细胞表位部分的重折叠后的蛋白质的产率经常极低，并且该问题随考虑的蛋白质的复杂性增加。
现在已经发现从细菌作为可溶性蛋白质生产的蛋白质构建体的设计和实施表达是制备自身蛋白免疫原性变体的优越途径-即使由于其它可溶性蛋白必须去除而使随后的纯化步骤变得更复杂，当与上述的常规方法相比时获得显著更高产率的最后纯化和正确折叠的产物。并且，非常重要的，从该类型表达获得的纯化的蛋白质显示至今空前的保存它们源自的天然自身蛋白B-细胞表位的能力。
简短地，按照本发明，当最初选择适于接种目的的自身蛋白的免疫原性变体时，变体蛋白质的可溶性表达是极好的选择标准。
为了获得该免疫原化的自身蛋白(和其中初级序列中已经引入变化的其它蛋白质)的可溶性蛋白质表达的目的，许多参数可以变化-不仅通过在单体水平上稳定它们的结构而且通过制备多聚体的单体模拟物可以生产难以装配的多亚基蛋白，另外按照本文阐明的教导可以稳定简单的单体蛋白。
另一重要因素是发酵条件-本发明人的实验室中的发现已经例如显示在与为获得高水平表达通常使用的那些相比较低的温度下的细菌发酵大大地促进变体蛋白质可溶性形式的生产。
本发明人已经发现IL5和TNFα的“单体化”形式的制备可以提供具有高稳定性，优越的免疫原性和理想的生产特征的免疫原性分子。特别地，当表达重组多肽时蛋白质的产率惊人地高，所述重组多肽通过两个借助肽接头连接的hIL5单体构建并包括外源T辅助细胞表位。认为该发现构成涉及多亚基蛋白的普遍适用的发现，所述多亚基蛋白的四级结构允许其单体形式的裁剪(tailoring)。
认为本发明技术特别适于制备破坏对自体蛋白的自耐受性(autotolerance)的免疫原，因为肽接头的引入可以与外源T辅助细胞表位的提供优美地结合，同时保存多亚基蛋白的3D结构(即通过将原始的四级结构强加于单体蛋白中的新三级结构，保存该蛋白质的三级和四级结构元件)。
因此，在一广泛的方面，本发明涉及多聚蛋白的免疫原性类似物，所述多聚蛋白(本质上)由非借助肽键连接的至少2个单体单元组成，其中所述类似物a)包括所述多聚蛋白的至少2个单体单元的基本片段，其中所述基本片段经肽键通过肽接头连接，
b)包括至少一个对于多聚体蛋白质异源的MHC II类结合氨基酸序列，并且c)可以作为一种单一的表达产物由含有编码类似物的表达载体的细胞生产。
本发明人已经还发现在单体TNFα的氨基酸序列中的许多特定操作导致即是免疫原性又能够获得有功能的四级结构的单体分子的提供，这意味着这些分子具有如此高程度保存的四级结构以致它们自发地可以形成有功能的，受体结合的二聚体和三聚体，并且此外这些单体在细菌中作为可溶性蛋白质生产。
已经在TNFα蛋白质中进行的这些操作中的一些被认为普遍适用于期望制备与天然蛋白质相比稳定的三级结构的蛋白质。
本发明的一个特别方面涉及TNFα单体结构中的许多变化，其是充分地非破坏性的以致允许TNFα单体的正确折叠，同时引入至少一个MHC II类结合氨基酸序列。已经例如发现可以在不含这个的天然TNFα的一个特定环结构中进行外源TH表位的插入，其对蛋白质的表达特性或单体形成有功能的TNFα二聚体或三聚体的能力具有负影响。因此，本发明的一个重要部分涉及人TNFα的免疫原性类似物，其中所述类似物包括至少一种外源MHC II类结合氨基酸序列并且另外具有以下的特性-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中已经插入或内替换至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列于柔性环3中，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中已经引入至少一个稳定TNFα单体3D结构的二硫键，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中氨基末端的氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9中任何一个已经被缺失，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中在内含子位置中插入或内替换至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列于环1中，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列引入作为人TNFα的N-末端中人工杆(stalk)区域的一部分，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中引入至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列以便通过增加三聚体相互作用界面的疏水性而稳定单体结构，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中将侧邻甘氨酸残基的至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于TNFα氨基酸序列中，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于D-E环中，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于两个相同的人TNFα子序列(subsequence)之间，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中已经将人TNFα中的至少一个盐桥加强或用二硫键替代，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中通过引入模拟鼠TNFα晶体结构的突变增强可溶性/或和对蛋白水解的稳定性，和/或-本发明的人TNFα单体或TNFα的单体化类似物，其中通过引入至少一个点突变减小或消除潜在的毒性。
通常，已经发现本发明所有最适合的免疫原性类似物是在当从它们的重组宿主细胞中以可溶性形式生产和分离它们时的阶段已经是可溶性蛋白质的那些。
本发明另外提供编码这些免疫原性类似物的核酸片段(如DNA片段)和包括这些DNA片段的载体。
本发明还提供用于制备类似物的转化细胞。
本发明进一步提供包含本发明的类似物或载体的免疫原性组合物。
本发明还提供的是治疗方法，其中多亚基蛋白被下调和治疗与特定多亚基蛋白有关的特定疾病。
附例

图1p2ZOP2f昆虫细胞表达载体。
载体的序列在SEQ ID NO60中阐明。载体在OpIE2启动子下游和OpIE2聚腺苷酸尾(OpIE2pA)的上游含有多克隆位点(MCS)。标记zeocin抗性基因(ZeoR)在第二个OpIE2启动子的控制下。
发明详述定义下面，将定义和详细解释在本发明说明书和权利要求中使用的许多术语以便澄清本发明的边界和范围。
术语“T-淋巴细胞”和“T-细胞”将对胸腺来源的淋巴细胞可替换地使用，所述胸腺来源的淋巴细胞负责各种细胞介导的免疫应答以及体液免疫中的辅助细胞活性。同样，对于生产抗体的淋巴细胞，术语“B-淋巴细胞”和“B-细胞”可替换地使用。
在此将“多聚蛋白”定义为包括不是通过肽键首尾连接的至少两条多肽链的蛋白质(术语“多亚基蛋白”与其可替换使用)。因此，多聚蛋白可以是由通过二硫键和/或非共价结合以多聚体形式保持在一起的几个多肽组成的多聚体。该术语还包括的是加工的前蛋白(pre-protein)和蛋白原(pro-protein)，其在加工后包括至少两个游离C-末端和至少两个游离N-末端。最后，该术语中还包括暂时在至少两个多肽之间存在的复合体，所述多肽可以形成不稳定然而还具有生物活性的具有独特3-维结构的分子实体。
“免疫原性类似物”(或“免疫原化”的类似物或变体)在此意指命名包括在完整多聚蛋白中发现的序列信息的基本部分的单一多肽。即，本发明的类似物蛋白质包括一条多肽链而多聚蛋白包括至少2条多肽链。应当注意类似物可以是多聚体单体亚基结构的变化，当在那种情形中，免疫原性类似物能够形成类似天然多聚体的多聚蛋白复合体。
多聚蛋白的“单体化的”类似物或变体在本文中是单一多肽，其包括通过肽键共价连接形式的至少2条在天然多聚蛋白中发现的多肽链，其中这2条多肽链不是通过肽键连接。
多亚基蛋白单体单元的“基本片段”意欲是指单体多肽的一部分，其构成至少足够的单体多肽以使形成以与可以在多亚基蛋白中发现的基本上相同的3D构象折叠的结构域。
“IL5多肽”在此意欲表示具有来源于人和其它哺乳动物的IL5蛋白质的氨基酸序列的多肽。在原核系统中制备的未糖基化形式的IL5也包括在术语的范围内，因为由于例如酵母或其它非哺乳动物的真核生物表达系统的使用导致具有各种糖基化模式的形式。然而应当注意当使用术语“IL5多肽”时意图是当提供给待治疗的动物时所考虑的多肽通常是非免疫原性的。换句话说，IL5多肽是自身蛋白或该自身蛋白的异种类似物(xeno-analogue)，其通常将不产生针对所考虑动物的IL5的免疫应答。
“TNFα多肽”在此意欲表示具有有来源于人和其它哺乳动物的TNFα蛋白质的氨基酸序列的多肽。在原核系统中制备的未糖基化形式的TNFα也包括在术语的范围内，因为由于例如酵母或其它非哺乳动物的真核生物表达系统的使用导致具有各种糖基化模式的形式。然而应当注意当使用术语“TNFα多肽”时意图是当提供给待治疗的动物时所考虑的多肽通常是非免疫原性的。换句话说，TNFα多肽是自身蛋白或该自身蛋白的异种类似物，其通常将不产生针对所考虑动物的TNFα的免疫应答。
“IL5类似物”是已经进行它一级结构的变化和/或与来自其它分子种类的元件相联系的IL5多肽。该变化可以例如是IL5多肽与适当的融合配体(partner)融合的形式(即专门涉及C-和/或N-末端氨基酸残基增加的一级结构的变化)和/或它可以是IL5多肽的氨基酸序列中插入和/或缺失和/或替代的形式。该术语还包括的是衍生化的IL5分子，参考IL5修饰的以下讨论。
“TNFα类似物”是已经进行它一级结构的变化和/或与来自其它分子种类的元件相联系的TNFα多肽。该变化可以例如是TNFα多肽与适当的融合配体融合的形式(即专门涉及C-和/或N-末端氨基酸残基增加的一级结构的变化)和/或它可以是TNFα多肽的氨基酸序列中插入和/或缺失和/或替代的形式。该术语还包括的是衍生化的TNFα分子，参考TNFα修饰的以下讨论。
应当理解IL5和TNFα类似物也包括包含完整IL5和TNFα多亚基蛋白的基本部分的单体变体。
当在此使用缩略语“IL5”和“TNFα”时，意欲分别是指成熟的野生型IL5和TNFα的氨基酸序列(在此也表示“IL5m”和“IL5wt”以及“TNFαm”和“TNFαwt”)。成熟的人IL5表示为hIL5，hIL5m或hIL5wt，而鼠成熟IL5表示为mIL5，mIL5m，或mIL5wt，类似的句法用于TNFα。在其中DNA构建体包括编码前导序列和其它物质的信息的情形中，这将通常从上下文中清楚。
术语“多肽”在本发明上下文中意欲是指2-10个氨基酸残基的短肽，11-100个氨基酸残基的寡肽，和多于100个氨基酸的多肽。另外，术语还意欲包括蛋白质，即包含至少一个多肽的有功能的生物分子；当包含至少两个多肽时，这些可以形成复合体，共价连接或可以非共价连接。蛋白质中的多肽可以是糖基化的和/或脂质化(lipidated)的和/或包含辅基。
术语“子序列”是指任何连续的至少3个氨基酸或当相关时至少3个核苷酸的一段序列，其分别直接来源于天然存在的IL5氨基酸序列或核酸序列。
术语“动物”在本发明上下文中通常意欲表示动物物种(优选哺乳动物)，如灵长类智人(Homo sapiens)，家犬(Canis domesticus)等，不是仅单一的动物。然而，术语还表示该动物物种的种群，因为重要的是按照本发明方法免疫的个体都包含基本上相同的IL5，以允许用相同的免疫原免疫动物。如果，例如IL5或TNFα的遗传变体存在于不同的人种群中，可能需要在这些不同的种群中使用不同的免疫原以便能够在每个种群中分别破坏对IL5和TNFα的自耐受性。对于本领域技术人员将清楚的是在本发明上下文中的动物是具有免疫系统的生物。优选动物是脊椎动物，如哺乳动物。
通过术语“下调”在这里是指在活体中多亚基蛋白生物活性的减小(例如通过用多亚基蛋白和对该分子在生物学上重要的结合配体之间的相互作用来干涉)。可以通过几种机理获得下调在这些之中，通过抗体结合简单的干涉多亚基蛋白中的活性位点是最简单的。然而，抗体结合导致多亚基蛋白通过清除细胞(如巨噬细胞和其它吞噬细胞)去除也在本发明的范围内。
表述“实施呈递...给免疫系统”意欲表示以受控的方式将动物的免疫系统进行免疫原性攻击。如将从以下公开内容中显示，可以以多种方式实施免疫系统的这种攻击，其中最重要的是用含有“药物疫苗(pharmaccines)”(即施用来治疗或改善正在进行的疾病的疫苗)的多肽接种或核酸“药物疫苗”接种。取得的最重要的结果是动物中的免疫感受态细胞以免疫有效的方式遭遇抗原，而获得该结果的精确方式对于构成本发明基础的创造性思想较不重要。
术语“免疫原性有效量”具有它在本领域中的通常含义，即能够诱导免疫应答的免疫原的量，该免疫应答显著地使与免疫原共有免疫特征的病原体参与。
当使用表述即IL5，TNFα或其它自身蛋白已经被“修饰”时在此是指构成自身蛋白骨架的多肽的化学修饰。该修饰可以例如是氨基酸序列中某些氨基酸残基的衍生化(例如烷基化，酰化，酯化等)，但从以下公开内容必须理解优选的修饰包含氨基酸序列一级结构的变化(或增加)。
当讨论“对自身蛋白的自耐受性”时必须理解因为相关多亚基蛋白是待接种的种群的自身蛋白，种群中的正常个体不产生对它的免疫应答；然而不能排除动物种群中偶然个体可能能够产生针对天然多聚体的抗体，例如作为自身免疫疾病的一部分。无论如何，动物物种通常将仅对它自身的多聚体是自耐受性的，但它不能排除来源于其它动物物种或来自具有不同表型的种群的类似物将也被所述动物耐受。
“外源T-细胞表位”(或“外源T-淋巴细胞表位”)是在动物物种中能够与MHC分子结合并且刺激T-细胞的肽-因此是备选的术语。本发明中优选的外源T-细胞表位是“泛主的(promiscuous)”(或“通用的”或“广范围的”)表位，即与动物物种或种群中特定类别的MHC分子的基本部分结合的表位。仅已知极其有限量的这种泛主T-细胞表位，以下将详细讨论它们。应当注意为了使按照本发明使用的免疫原在动物种群的尽可能大的部分中有效，可能需要1)插入数个外源T-细胞表位于相同的类似物中或2)制备数个类似物，其中每个类似物具有插入的不同的泛主表位。还应当注意外源T-细胞表位的概念还包括隐藏T-细胞表位的使用，所述隐藏T-细胞表位来源于自身蛋白并且仅当以分离形式存在而不是所考虑的自身蛋白的一部分时发挥免疫原性性能。
“外源T辅助淋巴细胞表位”(外源TH表位)是外源T细胞表位，其与MHC II类分子结合并且可以呈递在与MHC II类分子结合的抗原呈递细胞(APC)的表面。
“对多亚基蛋白异源的MHC II类结合氨基酸序列”因此是不存在于所考虑的多亚基蛋白中的MHC II类结合肽。如果它对于含有多亚基蛋白的动物物种也真正是外源的，该肽将是外源TH表位。
(生物)分子的“功能部分”在本发明上下文中意欲是指分子的一部分，其负责至少一种由分子发挥的生物化学或生理学作用。在本领域众所周知的是许多酶和其它效应分子具有负责由所考虑的分子发挥的作用的活性位点。分子的其它部分可能用作稳定或溶解度增强目的，因此如果这些目的与本发明的特定实施方案的上下文不相关能够省去。然而，按照本发明，优选使用尽可能多的多聚分子，因为当使用本文所述的单体时事实上已经证明增加的稳定性。
术语“佐剂”具有它在疫苗技术领域中的通常含义，即物质或物质的组合物，其1)自身不能产生针对疫苗免疫原的特异性免疫应答，但2)然而能够增强针对免疫原的免疫应答。或者，换句话说，仅用佐剂接种不提供针对免疫原的免疫应答，用免疫原的接种可能或不可能产生针对免疫原的免疫应答，但用免疫原和佐剂的组合接种诱导针对免疫原的免疫应答，其要强于由免疫原单独所诱导的免疫应答。
分子的“靶向”在本发明的上下文中意欲表示其中在引入到动物中后分子将优选出现在某些组织中或将优选与某些细胞或细胞类型有关的情形。可以以多种方式完成该效应，所述多种方式包括在促进靶向的组合物中配制分子或通过在分子中引入促进靶向的基团。以下将详细讨论这些问题。
“免疫系统的刺激”意指物质或物质的组合物显示普遍的，非特异性的免疫刺激效应。多种佐剂和推定的佐剂(如某些细胞因子)共有刺激免疫系统的能力。使用免疫刺激剂的结果是免疫系统增加的“机敏”，其意味着与分开使用免疫原相比同时或依次用免疫原免疫诱导显著更有效的免疫应答。
本发明的免疫原性类似物的特征目前公开策略的目标多聚蛋白可以是同聚物和杂聚物。如从实施例明显所示，本发明第一方面的最重要特征是所考虑的多聚蛋白可以是“单体化的”而没有引入多亚基蛋白3维结构的显著变化。因此，多亚基蛋白的具体功能对于本发明的要点不重要-相反它是决定是否它是本发明第一方面的本发明方法的适当候选物的蛋白质的结构特征。例如，如果多亚基蛋白中的一个单体的N-末端具有对多聚体中另一单体的C-末端的空间邻近，可以完成这两个特定单体通过肽接头的连接而不强加相对于天然多亚基蛋白结构的显著变化。在另一方面，如果末端远远相隔，本发明的实施要求至少单体之一的大部分与本发明的免疫原性目的无关或者单体亚基之间的连接可以用长的连接肽完成而这不会对蛋白质的抗原特性有负影响。
在本发明的第二方面，自身蛋白单体单元的“免疫原化”是以这种方式完成，即产生的变体单体仍能够形成多聚体蛋白的一部分，其共有天然多聚自身蛋白的四级结构。
有利的是如果按照本发明的免疫原性类似物在基本片段显示当是多聚蛋白的一部分时在相应单体中发现的B-细胞表位的基本部分。B-细胞表位的基本部分在此意欲是指与其它蛋白质相比在抗原性上表征多亚基蛋白的B-细胞表位的部分。优选基本部分显示当是多聚蛋白的一部分时在相应单体中发现的基本上所有B-细胞表位-当然，在单体序列中引入较小变化可能是需要的。例如可以通过氨基酸插入，替代，缺失或增加修饰来源于单体单元的氨基酸序列，以便与多亚基蛋白相比减小类似物毒性和/或以便引入MHC II类结合氨基酸序列，如果不期望使该序列位于接头中。
特别优选的实施方案提供本发明的免疫原性类似物，其中每个基本部分基本上包含每个单体单元的完整的氨基酸序列，其为连续序列或为包括插入片段的序列。即，仅无关紧要的单体单元序列部分从类似物中省去，例如在其中该序列不有助于单体单元的三级结构或多亚基蛋白的四级结构的情形中。然而，只要保持多亚基蛋白的3D结构，该实施方案允许单体的替换或插入。因此，特别有利的是如果免疫原性类似物是一种其中所有多聚蛋白的单体单元的氨基酸序列在类似物中出现，特别有利的是如果类似物包括(所有)组成多聚蛋白的单体的完整的氨基酸序列，其为连续的序列或为包括插入片段的序列。
如将明显的是，因此优选完整多聚蛋白的3-维结构基本上保存在类似物中。
可以以几种方式完成保持B-细胞表位基本部分或甚至如本文所述进行修饰的多亚基蛋白的3-维结构的举例说明。一种是简单地制备针对多聚体的多克隆抗血清(例如在兔中制备的抗血清)和此后使用该抗血清作为针对生产的修饰蛋白的测试试剂(例如在竞争ELISA中)。在与多聚体相同的程度上和抗血清反应的修饰形式(类似物)必须被认为具有与多聚体相同的3D结构，而显示与该抗血清有限(但仍显著和特异的)反应性的类似物被认为已经保持原始B-细胞表位的基本部分。
备选地，可以制备与多聚体上不同表位反应的单克隆抗体的选择并用作试验样板。该方法具有以下优势，允许1)多聚体的表位作图和2)在制备的类似物中保持的表位的作图。
当然，第三种方法将解析多聚体(参考以上)的3-维结构并将这与解析的制备的类似物的三维结构相比较。三维结构可以通过X-射线衍射研究和NMR-波谱学的帮助解析。另外的涉及三级结构的信息在某种程度上可以从圆二色性研究获得，其具有仅要求纯化形式的多肽的优势(而X-射线衍射要求提供结晶多肽，NMR要求提供多肽的同位素变体)以便提供关于给定分子的三级结构的有用信息。然而，需要最终X-射线衍射和/或NMR以获得结论性的数据，因为圆二色性只能通过二级结构元件的信息提供正确3-维结构的间接证据。
本发明的免疫原性类似物可以包括肽接头，其包括或有助于类似物中存在对多亚基蛋白异源的至少一个MHC II类结合氨基酸序列。这在其中不希望改变对应于多亚基蛋白中单体单元的氨基酸序列的那些情形中特别有用。备选地，肽接头可以无关于或非有助于来自衍生多亚基蛋白的动物物种中的MHC II类结合氨基酸序列的存在；这可以在其中需要利用极短接头或其中例如通过在活性位点引入MHC II类结合元件将潜在有毒的类似物去毒是有利的情形中便利地完成。如果需要，这两种实施方案可以与引入将分子去毒的点突变结合。
优选MHC II类结合氨基酸序列结合大部分来自衍生多亚基蛋白的动物物种中的MHC II类分子，即MHC II类结合氨基酸序列是通用的或泛主的。
当然重要的是该序列在免疫原意欲用作疫苗组分的物种中用作T细胞表位的目的。存在多种天然存在的“泛主”T-细胞表位，其在大部分的动物物种或种群个体中是活性的并优选引入疫苗，由此减小在相同疫苗中对极大量不同类似物的需要。因此，至少一种MHC II类结合氨基酸序列优选选自天然T-细胞表位和人工MHC-II结合肽序列。特别优选的序列是天然T-细胞表位，选自破伤风类毒素表位如P2(SEQ ID NO3)或P30(SEQ IDNO5)，白喉类毒素表位，流感病毒血凝素表位，和恶性疟原虫(P.falciparum)CS表位。
这些年来已经鉴定了多种其它的泛主T-细胞表位。特别地已经鉴定能够结合大部分由不同HLA-DR等位基因编码的HLA-DR分子的肽，这些全部都是可能引入按照本发明使用的类似物的T-细胞表位。还参考在下列参考文献中讨论的表位，其由此全部结合于此作为参考WO 98/23635(Frazer IH等，分配给The University of Queensland)；Southwood S等，1998，J.Immunol.1603363-3373；Sinigaglia F等，1988，Nature 336778-780；Chicz RM等，1993，J.Exp.Med 17827-47；Hammer J等，1993，Cell 74197-203；和Falk K等，1994，Immunogenetics 39230-242。后面的参考文献还涉及HLA-DQ和-DP配体。因为是与这些共有共同基序的表位，在这5个参考文献中全部所列表位作为在本发明中使用的候选天然表位有关。
备选地，表位可以是任何能够结合大部分MHC II类分子的人工T-细胞表位。关于这点在WO 95/07707中和在相应的文章Alexander J等，1994，Immunity 1751-761中(两个公开内容通过参考结合于此)描述的pan DR表位肽(“PADRE”)是令人感兴趣的按照本发明使用的表位的候选物。应当注意在这些文章中公开的最有效的PADRE肽在C-和N-末端携带D-氨基酸以便改善施用时的稳定性。然而，本发明主要旨在将相关表位结合作为类似物的一部分，其应当然后接着在APC的溶酶体分隔中被酶促分解以允许随后在MHC-II分子的范围内的呈递，因此将D-氨基酸结合到本发明所用的表位中是不便利的。
一种特别优选的PADRE肽是具有氨基酸序列AKFVAAWTLKAAA(SEQ ID NO7)或其免疫有效子序列的PADRE肽。这和其它具有相同缺少MHC限制性的表位是优选的T-细胞表位，其应当存在于本发明方法所用的类似物中。该超泛主表位将供本发明最简单的实施方案所用，其中将仅单一修饰的IL5呈递给接种的动物的免疫系统。
本发明优选实施方案包括通过引入至少一个外源免疫优势TH表位的修饰。应当理解TH表位的免疫优势的问题取决于所考虑的动物物种。如本文所用，术语“免疫优势”简单地是指在接种的个体中产生显著免疫应答的表位，但众所周知的事实是在一个体中免疫优势的TH表位在相同物种的另一个体中未必是免疫优势，即使它可能能够结合后者个体中的MHC-II分子。
如上所述，通过引入至少一个氨基酸插入，增加，缺失，或替代可以完成外源T-细胞表位的引入。当然，通常情形将是在氨基酸序列中引入多于一个变化(例如插入或替代完整的T-细胞表位)但实现的重要目的是当被抗原呈递细胞(APC)加工时类似物将产生存在于APC表面上MCH II类分子范围内的T-细胞表位。因此，如果单体单元的氨基酸序列在适当位置包含多个在外源TH表位中也能发现的氨基酸残基，那么通过氨基酸插入，增加，缺失和替代提供外源表位的剩余氨基酸可以完成外源TH表位的引入。换句话说，不需要通过插入或替代引入完整的TH表位。
按照本发明，类似物还可以形成大分子的一部分，其中它与至少一个功能部分偶联，其的存在不在显著程度上负面干涉类似物的抗体可接近性。该部分(其可以与类似物融合)的性质可以是将修饰分子靶向至抗原呈递细胞(APC)或B-淋巴细胞，以刺激免疫系统，和优化类似物对免疫系统的呈递。
靶向部分便利地选自对B-淋巴细胞特异性表面抗原或对APC特异性表面抗原充分特异的结合配体，如半抗原或糖，对于其在B-淋巴细胞或APC上存在受体。免疫刺激部分可以选自细胞因子，激素，和热激蛋白。呈递优化部分可以选自脂质基团，如棕榈酰基，肉豆蔻基，法呢基，香叶基-香叶基，GPI-锚钩，和N-酰基甘油二酯基。
适当的细胞因子是干扰素γ(IFN-g)，Flt3L，白细胞介素1(IL-1)，白细胞介素2(IL-2)，白细胞介素4(IL-4)，白细胞介素6(IL-6)，白细胞介素12(IL-12)，白细胞介素13(IL-13)，白细胞介素15(IL-15)，和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)中任何一个的有效部分。
优选的热激蛋白是HSP70，HSP90，HSC70，GRP94和钙网蛋白(CRT)中任何一个或其有效部分。
优选氨基酸插入，缺失，替代或增加的数量至少为2，如3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，和25个插入，替代，增加或缺失。更优选氨基酸插入，替代，增加或缺失的数量不超过150，如最多100，最多90，最多80，和最多70。特别优选替代，插入，缺失，或增加的数量不超过60，特别地数量不应超过50或甚至40。最优选的是不超过30的数量。关于氨基酸增加，应当注意当产生的构建体是融合多肽的形式时，这些经常显著高于150。
本发明优选的实施方案包括通过引入至少一个外源免疫优势TH表位(＝“外源MHC II类结合氨基酸序列”)的修饰。应当理解TH表位的免疫优势的问题取决于所考虑的动物物种。如本文所用，术语“免疫优势”简单地是指在接种的个体中产生显著免疫应答的表位，但众所周知的事实是在一个体中免疫优势的TH表位在相同物种的另一个体中未必是免疫优势，即使它可能能够结合后者个体中的MHC-II分子。
另一要点是TH表位的MHC限制性问题。通常，天然存在的TH表位是MHC限制性的，即，构成TH表位的某个肽将仅与MHC II类分子的一种亚型有效结合。这又具有作用即在大多数情形中一种特异性TH表位的使用将导致仅在种群的一部分中有效的疫苗组分，并且根据该部分的大小，需要在相同分子中包括更多的TH表位，或者备选地制备多组分疫苗，其中组分是彼此区别于引入的TH表位性质的变体。
如果所用T-细胞的MHC限制性完全未知(例如在其中接种的动物具有很不确定的MHC组成的情形中)，可以通过下式确定由特定疫苗组成覆盖的动物种群的部分 -其中pi是在种群中对存在于疫苗组合物中第i个外源T-细胞表位的响应者的频率，n是在疫苗组合物中外源T-细胞表位的总数。因此，含有3个在种群中分别具有0.8，0.7和0.6的响应频率的外源T-细胞表位的疫苗组合物将产生1-0.2×0.3×0.4＝0.976
-即97.6％的种群在统计上将产生对疫苗的MHC-II介导的应答。
上式不适用于其中或多或少所用肽的精确的MHC限制性模式已知的情形。如果，例如某一肽仅结合由HLA-DR的等位基因DR1，DR3，DR5和DR7编码的人MHC-II分子，那么该肽和另一结合剩余的由HLA-DR等位基因编码的MHC-II分子的肽的一起使用将完成所考虑种群的100％覆盖度。同样，如果第二个肽仅结合DR3和DR5，该肽的加入将根本不增加覆盖度。如果将种群应答的计算纯粹基于疫苗中T-细胞表位的MHC限制性，通过下式可以确定由特定疫苗组成覆盖的种群部分 -其中φj是种群中编码结合疫苗中T-细胞表位任何一个并且属于3种已知HLA基因座(DP，DR和DQ)的第j种的MHC分子的等位基因单倍型频率的总和；实际上，首先确定哪个MHC分子将识别疫苗中的每个T-细胞表位，其后按类型(DP，DR和DQ)将这些MHC分子列出-然后，对于每种类型将列出的不同等位基因单倍型的单独频率求和，由此产生φ1，φ2，和φ3。
可能出现的是式II中的pi值超过对应的理论值πiπi=1-Πj=13(1-vj)2---(IV)]]>-其中vj是种群中编码结合疫苗中第i个T-细胞表位并且属于3种已知HLA基因座(DP，DR和DQ)的第j种的MHC分子的等位基因单倍型频率的总和。这意味着在1-πi的种群中存在f剩余_i＝(pi-πi)/(1-πi)的响应者频率。因此，可以调整式III结果产生式V -其中如果负数将术语1-f剩余_i设定为零。应当注意式V要求所有表位已经针对相同的单倍型组进行单倍型作图。
因此，当选择引入本发明类似物的T-细胞表位时，重要的是包括所有可获得的表位知识1)种群中对每个表位的响应者的频率，2)MHC限制性数据，和3)在种群中相关单倍型的频率。
应当注意本发明优选的类似物包含修饰，其导致包括与对应的多聚蛋白单体单元或其长度至少为10个氨基酸的子序列具有至少70％序列同一性的一段序列的多肽。优选更高的序列同一性，例如至少75％或甚至至少80％或85％。可以将对蛋白质和核酸的序列同一性计算为(Nref-Ndif)·100/Nref，其中Ndif是当对比时在两个序列中不相同残基的总数量，并且其中Nref是在序列之一中残基的总数量。因此，DNA序列AGTCAGTC将与序列AATCAATC具有75％的序列同一性(Ndif＝2和Nref＝8)。
最后，为了结论性地证实本发明的类似物作为免疫原确实有效，可以进行各种试验以便提供必要的证实，还参考在本文实施例中阐明的细节。在本上下文中，还对WO 00/65058中有效IL5类似物的鉴定的讨论进行参考-该公开内容可以用于证实进行本发明技术的类似物(IL5衍生的或否)的有效性。
可以进行本发明技术的优选多聚体是IL5和TNFα。
基于IL5的构建体对于hIL5，已经发现模拟天然hIL5二聚体结构和同时包括外源TH元件的构建体提供与基于单体结构的构建体相比优越的结果，例如优于在WO 00/65058中公开的构建体，特别是当涉及表达水平和针对构建体的抗血清的抗体反应性时。
优选的基于IL5的构建体是其中类似物选自以下各项的那些-两个完整的由肽接头连接的IL5单体，所述肽接头包括至少一个MHC II类结合氨基酸序列，和-两个完整的由插入的肽接头连接的IL5单体，其中至少一个IL5单体包括异源MHC II类结合氨基酸序列。
该类似物可以具有线性结构IL-Lm-IL或ILm-Li-ILn或IL-Li-ILm或IL-Li-ILm或ILm-Lm-ILn，其中“IL”是成熟的单体IL5的完整氨基酸序列，“ILm”和“ILn”，其可以相同或不相同，表示包括异源MHC II类结合氨基酸序列的、成熟单体IL5的实质上(substantially)完整的氨基酸序列，“Lm”是类似物中的包括或有助于至少一个MHC II类结合氨基酸序列的肽接头，“Li”是在类似物中不包括或有助于任何MHC II类结合氨基酸序列的惰性肽接头。特别优选Lm，ILm和ILn包含破伤风类毒素的P2和/或P30表位或包含PADRE，并且Li是二甘氨酸接头。然而，Li可以是任何非免疫原性的接头肽，其不产生MHC II类结合序列。
最优选的实施方案是具有在SEQ ID Nos9，11，13和15中任何一个中阐明的成熟氨基酸序列的hIL5类似物。
TNFα背景肿瘤坏死因子(TNF，TNFα，恶液质素，TNFSF2)是炎症和免疫功能的有效的旁分泌和内分泌介质。TNFα对许多细胞是有细胞毒性的，特别是与γ-干扰素结合。TNFα最初在1975年鉴定并证明引发肿瘤坏死和退化。后来已经详细研究抗癌作用，但治疗没有成功作为癌症治疗，尽管仍有使用TNFα的癌症试验进行。后来发现TNFα是恶病质的原因并且发现TNF通过受体介导的过程发挥它的功能。已经鉴定两种不同的TNFα受体(TNFR55和TNFR75)，其介导TNFα的细胞毒性和炎性作用。在慢性炎性疾病如类风湿性关节炎(RA)期间TNFα诱导和保持炎症过程并且被认为在变态反应和牛皮癣中具有关键作用。通过可溶性受体，受体特异性抑制剂，TNFα生产的下调或单克隆抗-TNFα抗体阻断TNFα信号是有吸引力的逆反(adverse)TNFα上调和信号发生(signaling)的生物作用的治疗方式。
从用可溶性TNFα受体和单克隆抗-TNFα抗体的治疗获得的结果明显的是抗-TNFα治疗在几种疾病中是成功的，如RA和节段性回肠炎。抗-TNFα治疗被认为是安全和有效的。
迄今，两种TNFα拮抗剂，Remicade(英夫利昔单抗，Cento-cor/Johnson&Johnson)和Enbrel(依那西普，Immunex)已经被批准用于临床使用。
Remicade是针对可溶性和细胞相关的TNFα的嵌合小鼠-人单克隆IgG1抗体。Remicade阻断TNF与它内源性细胞表面TNFα受体的结合。食品和药物管理局(FDA)在1998年10月批准Remicade用于中度至严重或常规疗法难治愈的瘘状(fistulizing)节段性回肠炎。指示被扩展至包括在氨甲蝶呤单独难以治愈的类风湿关节炎中与氨甲蝶呤的附加使用和在2002年7月在节段性回肠炎中的维持治疗。
Enbrel是重组蛋白质，其由与人IgG1的Fc部分融合的人TNFα受体的胞外部分组成。Enbrel通过用作诱饵TNFα受体抑制TNFα活性。FDA在1998年11月批准Enbrel用于类风湿性关节炎。已经用这些TNFα拮抗剂治疗多于350,000位患者。连续进行这些试剂的临床功效和安全信息的检查，尽管感染和其它免疫相关的不利事件对于TNFα拮抗剂仍是一个主要担忧，近来由FDA和专利医疗产品委员会(CPMP)进行的售后经验安全评估声称抗-TNFα治疗具有有利的风险-得益平衡，尽管已经要求标签变化，包括对严重感染的变化。
与确立的抗-TNFα治疗相比，目前建议的TNFα免疫疗法具有微克量的接种和较低频率注射的优势以保持与单克隆抗体大的融合相比抗-TNFα的体内高效价。正结果是副作用的低风险和较不昂贵的治疗。还认为天然多克隆抗体应答将作为比其它抗-TNFα治疗更有效的TNFα下调剂剂。
TNFα被翻译成233个氨基酸的前体蛋白并作为三聚体的II型跨膜蛋白分泌，其被特异性的金属蛋白酶切割成三聚体可溶性蛋白，其中每个相同的单体亚基由157个氨基酸组成(其氨基酸序列在SEQ ID NO17中阐明)。人TNFα是非糖基化的而鼠TNFα具有单个N-糖基化位点。TNFα单体具有17kDa的分子量而三聚体具有52kDa的理论MW，尽管交联的三聚体在SDS-PAGE中作为43kDa移动。TNFα包含两个半胱氨酸，其通过形成分子内二硫键稳定结构。TNFα的N和C-末端对于活性是重要的。特别是C-末端是敏感的，因为三个，两个甚至一个氨基酸的缺失急剧降低可溶性和生物活性。重要的氨基酸是Leu157，其在三聚体中的两个单体之间形成稳定的盐桥。在另一方面开始八个氨基酸的缺失提高活性1.5-5倍，而开始九个氨基酸的缺失恢复全长活性。TNFα是充分研究的蛋白质并且已经鉴定许多导致三聚体形成和受体结合的分子内和分子间相互作用。
因此，实际上，人TNFα(SEQ ID NO17)作为二聚体和三聚体存在，但在两种情形中分子非常适合作为本发明的候选目标。
TNFα构建体优选的TNFα类似物选自1)通过肽接头首尾连接的两个或三个完整的TNFα单体，其中至少一个肽接头包括至少一个MHC II类结合氨基酸序列，和2)通过惰性肽接头连接的两个或三个完整的TNFα单体，其中至少一个单体包括至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列或者其中至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列任选地通过惰性接头融合至N-或C-末端单体。
特别有趣的是具有高稳定性的免疫原性TNFα分子，因为发明人较早已经发现单体TNFα构建体倾向于相对不稳定，然而参考以下讨论。
因此，该类型的构建体非常类似于上述讨论的IL5构建体。
已经生产以与上述关于IL5类似的方式由表位和/或惰性肽接头连接在一起的编码3TNFα亚基的基因。目的是产生具有与天然TNFα三聚体尽可能相近的构象的变体TNFα分子。设计变体以有效地引发针对野生型TNFα的中和抗体。最适当的TNFα变体是在不存在去污剂或其它种类的可以破坏蛋白质构象的添加剂的情况下的可溶性和稳定的蛋白质。
通过表达使用接头和TH表位连接在一起成为一条单一多肽链的三个单体，意欲制备比先前的变体TNFα免疫原更稳定的TNFα变体。通过引入需要的TH表位于稳定的氢键，盐桥或二硫键的外部，这将允许TNFα结构的保存。
从TNFα的X-射线晶体结构中看出N末端的开始5个残基太柔性而不允许结构确定。然而C-末端定位接近于单体界面的中部和较不柔性。Arg-6和Leu-157的αC原子的距离是10，其是3-4个氨基酸残基的距离。因此似乎可能将单体亚基直接连接在一起，但因为C-末端位于柔弱(delicate)位点，对于该连接使用柔性接头，例如甘氨酸接头可能是有利。
使用“单体化三聚体”方法迄今已经设计五种变体。对照TNF_T0(TNFα三聚体数0，SEQ ID NO22)由三个通过2个分开的甘氨酸接头(GlyGlyGly)直接连接在一起的单体组成。设计TNF_T0以便与野生型三聚体蛋白质一样稳定。当然，可以使用其它蛋白质化学领域已知的惰性柔性接头代替上述甘氨酸接头，重要的特征是柔性接头不有害地干涉单体化的蛋白质折叠成类似于生理活性野生型TNFα的3D结构的3D结构的能力。
TNF_T0构建体在大肠杆菌中被表达成可溶性蛋白质，并且它已经被用于制备例举性的构建体TNF_T4(SEQ ID NO57)，其是引入PADREMHC II类结合肽(SEQ ID NO7)的变体。在该构建体中，单体单元和外源表位之间的比率因此为每3个单体1个表位，而不是在现有技术依赖于免疫原化单体蛋白质的变体的情形中的每个单体1个表位-对于SEQ IDNO55)也是如此。该事实提供对三聚体稳定性的潜在的正面影响。该方法的产物是TNF_C2变体(SEQ ID NO28，参见以下)，其是在与TNF_T4相同的位置具有PADRE表位的TNFα单体。
平行地，破伤风类毒素P2和P30表位(分别SEQ ID NO3和5)已经被用于TNF_T1和TNF_T2变体(分别SEQ ID NO49和51)，其在每个接头区域包含一个表位，和也用于TNF_T3(SEQ ID NO59)中，其含有一个C-末端表位并且一个在第二个连接区域中。蛋白质大部分从N-末端向C-末端折叠。构成TNF_T3基础的思想是当开始两个N-末端结构域折叠时它们将用作对于由表位包围的第三个结构域(单体)的内部陪伴分子。
已经发现除了上面详述的将多聚蛋白“单体化”的技术以外，TNFα(和可能许多其它多亚基蛋白)允许生产单体，其1)包括至少一个稳定化突变和/或2)包括至少一个非TNFα衍生的MHC II类结合氨基酸序列，其中这些TNFα单体变体能够正确地折叠成三级结构，其随后允许形成具有正确四级结构的二聚体和三聚体TNFα蛋白质(如通过具有受体结合活性的这些证明)。因此，在这些构建体中，已经可能制备未必需要生产为单体化的三聚体的单体TNFα的变体，因为引入单体序列的变化引入如此有限的单体三级结构的破坏以致可以形成二聚体或三聚体。按照构成本发明基础的思想，另外已经发现所有这些变体可以表达为来自细菌细胞的可溶性蛋白质。
因此可以按照可以结合并可以进一步与已经讨论的本发明“单体化方法”结合的下列策略制备免疫原性TNFα变体(因为这些特定的修饰的等位基因天然是非破坏性的)柔性环策略本发明人已经发现在位置Gly108-Ala109中插入PADRE表位(SEQ IDNO7)是有希望的制备具有紧密类似天然TNFα分子的结构的TNFα变体的方法。已经从TNFα晶体结构中推断出直接插入该位点的TH表位将在附近无任何邻近的氨基酸残基来相互作用。用TNF34(SEQ ID NO18)研究，按照该方法制备的第一个PADRE构建体已经显示当在37℃下培养细菌宿主细胞时约5％表达的蛋白质TNF34在大肠杆菌中是可溶性的并且95％的TNF34表达为内含体，但是在其中发酵温度为25℃的发酵工艺适应后，发酵的可溶性蛋白质的产率接近100％。因此，生长条件的优化增加可溶性蛋白质的产率。
已经制备许多其它的构建体(TNF35-TNF39，SEQ ID NO，23，24，25，26，和27)，其中所有这些仅依赖于引入SEQ ID NO7于柔性环3中。
稳定性增强突变将TH表位引入柔性环3可以潜在地使TNFα变体的结构不稳定。然而，这潜在的不稳定作用可以通过引入将形成二硫键的半胱氨酸稳定结构来抵消。迄今已经将在两个不同位置的半胱氨酸对引入变体TNF34-A和TNF34-B(SEQ ID NO29和30)。此外，平行地缺失已知减小受体相互作用强度的柔性N-末端(开始8个氨基酸)，因此变体TNF34-C(SEQ ID NO31)。将二硫键引入单体以与天然存在的二硫键(Cys-67 Cys-101)一起稳定表位插入位点。该策略还将同样稳定TNFα单体和单体化的二聚体或三聚体。
其它构建体已经将几种不同策略用于将是可溶性表达产物的变体的设计。TNFX1.1-2(SEQ ID NO32和33)是基于将SEQ ID NO7插入TNFα的第一个环，其中插入位点位于内含子位点。在TNFX2.1(SEQ ID NO34)中创造包含SEQ ID NO7插入片段的人工“杆”区域。
TNFα的突变已经显示指向三聚体界面的、大的疏水氨基酸替换稳定三聚体结构。TNFX3.1和TNFX3.2(SEQ ID NO35和36)是稳定现有的TNF34变体的方案。TNFX4.1(SEQ ID NO37)使用二甘氨酸接头以消除来自PADRE肽的对整个TNF34结构的结构约束。作为插入位点，TNFX5.1(SEQ ID NO38)使用在TNF家族成员BlyS中发现的环结构。TNFX6.1-2，TNF7.1-2和TNFX8.1(SEQ ID NO39，40，41，42，和43)是另外的变体。TNFX9.1和TNFX9.2(SEQ ID NO44和45)是TNF34变体，其使用相同的重叠的4-6个氨基酸的TNFα序列，其在表位之前和之后。最后，两个变体(SEQ ID NO46和47)是在与TNF34中PADRE肽的相同位置的P2/P30双重变体。
另外，从TNFα的晶体结构发现一种稳定的盐桥存在于TNFα单体内残基Lys-98和Glu-116之间。盐桥的定义是在Asp或Glu的侧链氧和Arg，Lys或His带正电的原子侧链氮之间小于7.0的原子间距离的静电相互作用。通过在该位点用Arg或His定点替代突变Lys-98，结合用Asp替代Glu116，可以获得对该盐桥的稳定性和由此三聚体分子的稳定性的改善。还可以以上述方法用二硫键与这些盐桥交换。
已经发现关于可溶性和蛋白水解方面鼠TNFα比人TNFα显著更稳定。TNFα变体的改善包括制备定点突变体以便模拟鼠TNFα晶体结构以获得在蛋白水解上更稳定的TNFα产物。
从人和鼠TNFα的x-射线结构中发现三聚体的中心(在三个TNFα单体中间)由于疏水力结合在一起，而三聚体的顶部和底部由于天然存在的盐桥连接。因此，通过筛选这些盐桥更强的连接，也将可以改善TNFα三聚体的稳定性。
最后，用本发明TNFα变体获得的初步结果已经令人惊奇地证明至少在它们结合TNF-受体的意义上，变体是在生理上活性的。然而，因为TNFα是有毒蛋白，期望制备将在用按照本发明的疫苗免疫的患者中不导致严重副作用的安全变体。因此，本发明的另一重要实施方案是如果在相关毒性模型中试验以后这些证明对接种的个体有潜在危险，在构建体中包括去毒突变。
在本领域已知许多点突变将TNFα去毒或至少在很大程度上降低毒性。如果需要将这些点突变引入本发明的变体。特别优选的突变是对于成熟TNFα用Ser替代Tyr-87，用Asn替代Asp-143，和用Arg替代Ala-145。另外，所有在Loetscher，H.，Stueber，D.，Banner，D.，Mackay，F.和Lesslauer，W.1993 JBC 268(35)26350-7中提到的有效突变也是本发明的去毒实施方案中令人感兴趣的实施方案。
总之，已经按照本发明制备下列具体的TNFα变体
使用的号码是从SEQ ID NO17的N-末端V开始(即，从SEQ ID NO17的第二个氨基酸开始)。在N-末端缬氨酸之前在一些序列中是用于翻译起始的甲硫氨酸。
本发明最优选的蛋白质构建体因此是由SEQ ID NOs18，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，49，51，53，55，57，和59中任何一个，以及从其中衍生的仅包括其保守氨基酸改变或去毒氨基酸改变的任何氨基酸序列所表示的那些。
无论如何，所有上面讨论的这些TNFα变体可以表达为来自细菌细胞如大肠杆菌的可溶性蛋白质是重要的实施方案。
当目的是从大肠杆菌中表达时，优选的载体是pET28b+，p2Zop2F(SEQ ID NO60)是用于昆虫细胞表达的载体，pHP1(或它可商购的“孪生物(twin)”pCI)是用于哺乳动物细胞表达的载体。
本发明提供的通用疗法本发明提供借此变得可以以非常有利的方式下调特定多聚蛋白的方法。
一般来说，提供在自体宿主中下调多聚蛋白的方法，该方法包含向动物免疫系统实施免疫原性有效量的至少一种本发明免疫原性类似物的呈递。优选自体宿主是哺乳动物，最优选人。
可以以多种方式实施该方法，其中施用蛋白质疫苗是一种选择，但核酸疫苗策略或活接种策略也很令人感兴趣。
蛋白质/多肽接种和配制当通过将其施用于动物实施类似物向动物免疫系统的呈递时，多肽的配制遵照本领域普遍承认的原理。
制备包含肽序列作为活性成分的疫苗在本领域中通常是众所周知的，如由美国专利4,608,251；4,601,903；4,599,231；4,599,230；4,596,792；和4,578,770所例举，其全部结合于此作为参考。典型地，这些疫苗被制备成可注射的液体溶液或悬浮液；还可以制备适合于注射前液体溶液或悬浮液的固体形式。还可以将制剂乳化。经常将活性免疫原性成分与赋形剂混合，所述赋形剂是药物可接受的和与活性成分相适合的。适当的赋形剂是例如水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等，及其组合。另外，如果需要，疫苗可以包含少量的辅助物质如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，或增强疫苗效力的佐剂；参考以下详细讨论佐剂。
疫苗常规是通过注射肠胃外，例如皮下，皮内，真皮内，真皮下或肌内施用。另外适于其它给药方式的制剂包括栓剂，在一些情形中口服，颊含(buccal)，舌下，腹膜内，阴道内，肛门，硬膜外，脊髓，和颅内制剂。对于栓剂，常规粘合剂和载体可以包括例如聚链烯二醇(polyalkalene glycol)或甘油三酯；该栓剂可以从包含0.5％-10％，优选1-2％活性成分的混合物形成。口服制剂包括这些常规使用的赋形剂，如例如药用级甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。这些组合物采取溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊，缓释制剂或粉剂的形式并含有10-95％，优选25-70％的活性成分。对于口服制剂，霍乱毒素是令人感兴趣的制剂配体(并且也可能是偶联配体)。
可以将多肽配制成中性或盐形式的疫苗。药用盐包括酸式加成盐(与肽的游离氨基形成)并且其与无机酸如例如盐酸或磷酸，或诸如乙酸，草酸，酒石酸，扁桃酸的有机酸形成。与游离羧基形成的盐也可以衍生于无机碱如例如氢氧化钠，氢氧化钾，氢氧化铵，氢氧化钙，或氢氧化铁，和诸如异丙胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的有机碱。
以适合于剂量配制的方式并且以诸如治疗有效免疫原性的量施用疫苗。施用的量取决于治疗的患者，包括例如个体免疫系统产生免疫应答的能力，和期望保护的程度。适当的剂量范围是大约每次接种数百微克活性成分，优选范围约0.1μg至2,000μg(即使1-10mg范围内的更高量也被考虑)，如约0.5μg至1,000μg的范围内，优选1μg至500μg的范围内并且特别地约10μg至100μg的范围内。最初给药和加强接种的适当疗法也是可变的，但典型的是最初给药接着随后接种或其它给药。
施用的方式可以广泛地变化。任何给药疫苗的常规方法可以适用。这些包括在固体生理可接受的基质上的口服施用或在生理可接受的分散剂中通过注射等肠胃外施用。疫苗的剂量将取决于给药途径并且将按照接种的人的年龄和抗原的配制而变化。
一些疫苗类似物在疫苗中是充分免疫原性的，但对于其它一些如果疫苗另外包含佐剂物质免疫应答将被增强。
已知对疫苗实现佐剂作用的各种方法。常规原理和方法在“The Theoryand Practical Application of Adjuvants”，1995，Duncan E.S.Stewart-Tull(编辑)，John Wiley & Sons Ltd，ISBN 0-471-95170-6中和同样在“VaccinesNewGeneration Immunological Adjuvants”，1995，Gregoriadis G等(编辑)，PlenumPress，New York，ISBN 0-306-45283-9中详述，两者结合于此作为参考。
特别优选使用可以证明促进对自身抗原的自耐受性的破坏的佐剂；实际上，在其中将未修饰的IL5用作自身疫苗中的活性成分的情况下基本上如此。适当的佐剂的非限制性实例选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂如毒素，细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；微团形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉；和包封佐剂。通常应当注意上面涉及用作类似物中第一，第二和第三部分的化合物和试剂的公开内容还加以必要的变更是指它们在本发明的疫苗佐剂中的应用。
佐剂的施用包括使用试剂如氢氧化铝或磷酸盐(铝)，通常用作缓冲盐水中的0.05-0.1％溶液，用作0.25％溶液的与糖的合成聚合物(例如Carbopol)的混合物，通过用70℃至101℃的温度分别热处理30秒至2分钟时期蛋白质在疫苗中的聚集体，通过交联剂的聚集也是可能的。还可以使用通过用胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段)再活化清蛋白的聚集体，与细菌细胞如短小棒状杆菌(C.parvum)或内毒素或革兰氏阴性菌的脂多糖成分的混合物，生理可接受的油载体如二缩甘露醇一油酸酯(Aracel A)中的乳剂或含有20％用作嵌段取代物(block substitute)的全氟化碳(Fluosol-DA)溶液的乳剂。还优选与油如角鲨烯和IFA的混合物。
按照本发明DDA(二甲基二(十八烷基)溴化铵)与DNA和γ-菊粉一样是令人感兴趣的佐剂候选物，而且弗氏完全和不完全佐剂以及皂树皂苷如QuilA和QS21与RIBI一样是令人感兴趣的。另外的可能是单磷酰脂A(MPL)，上述C3和C3d，和胞壁酰二肽(MDP)。
脂质体制剂还已知赋予佐剂作用，因此按照本发明脂质体佐剂是优选的。
按照本发明免疫刺激复合物基质类型(ISCOM基质)的佐剂也是优选的选择，特别是因为已经显示该类型的佐剂能够上调APC的MHC II类表达。ISCOM基质由(任选分级的)来自皂树(Quillaja saponaria)的皂苷(三萜系化合物)，胆固醇，和磷脂组成。当与免疫原性蛋白质混合时，产生的特定制剂称为ISCOM颗粒，其中皂苷构成60-70％w/w，胆固醇和磷脂是10-15％w/w，蛋白质10-15％w/w。关于免疫刺激复合物的组成和使用的细节可以例如在上述涉及佐剂的教材中发现，而且Morein B等，1995，Clin.Immunother.3461-475以及Barr IG和Mitchell GF，1996，Immunol.and Cell Biol.748-25(两者结合于此作为参考)为完全免疫刺激复合物的制备提供有用的指导。
另一高度有趣(因此优选)的实现佐剂作用的可能是使用在Gosselin等，1992(其结合于此作为参考)中描述的技术。简短地，通过将抗原偶联至针对单核细胞/巨噬细胞上Fcγ受体的抗体(或抗原结合抗体片段)可以增强相关抗原如本发明抗原的呈递。特别地抗原和抗-FcγRI之间的偶联物已经显示增强为了接种的免疫原性。
其它可能包括使用靶向和免疫调节物(即细胞因子)，其作为蛋白质构建体的部分在权利要求中提及。关于这一点，合成的细胞因子的诱导物如聚I:C也是可能的。
适当的分枝杆菌衍生物选自胞壁酰二肽，完全弗氏佐剂，RIBI，和海藻糖的二酯如TDM和TDE。
适当的免疫靶向佐剂选自CD40配体和CD40抗体或其特异性结合的片段(参考上述讨论)，甘露糖，Fab片段，和CTLA-4。
适当的聚合物佐剂选自糖如葡聚糖，PEG，淀粉，甘露聚糖和麦芽糖；诸如可塑性聚合物；和胶乳如胶乳珠。
还有另一令人感兴趣的调节免疫应答的方式是包括免疫原(任选地与佐剂和药用载体和赋形剂一起)于“虚拟淋巴结”(VLN)(由ImmunoTherapy公司，360 Lexington Avenue，New York，NY 10017-6501开发的专有医疗装置)中。VLN(薄管装置)模拟淋巴结的结构和功能。将VLN插入皮肤下产生无菌炎症位点，细胞因子和趋化因子增长。T-和B-细胞以及APC迅速对危险信号响应，汇集(home)至发炎位点并在VLN的多孔基质内部累积。已经显示当使用VLN时产生对抗原的免疫应答所需的抗原剂量减小，通过使用VLN的接种赋予的免疫保护优于使用Ribi作为佐剂的常规免疫。该技术尤其在Gelber C等，1998，“Elicitation ofRobust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts ofImmunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual LymphNode”，in“From the Laboratory to the Clinic，Book of Abstracts，10月12日-10月15日，1998，Seascape Resort，Aptos，California”中简短地描述。
期望疫苗应当一年至少施用一次，如一年至少1，2，3，4，5，6，和12次。更明确地，期望每年1-12次，如对于需要其的个体一年1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12次。先前已经显示通过使用按照本发明的优选自身疫苗诱导的记忆免疫不是永久性的，因此免疫系统需要用类似物周期性地攻击。
由于基因变异，不同个体可能对相同多肽起不同强度的免疫应答反应。因此，按照本发明的疫苗可以包含几种不同的多肽以便提高免疫应答，也参考上面关于外源T-细胞表位引入的选择的讨论。疫苗可以包含两种或多种多肽，其中所有多个定义如上。
疫苗因此可以包括3-20种不同类似物，如3-10种类似物。然而，通常类似物的数量将寻求保持在最小值如1或2种类似物。
核酸接种作为对基于肽疫苗的传统给药的非常重要的备选方案，核酸接种的技术(也称为“核酸免疫”，“遗传免疫”，和“基因免疫”)提供多种有吸引力的特征。
首先，与常规疫苗方法形成对比，核酸接种不要求资源消耗的大规模生产免疫原性试剂(例如以工业化规模发酵生产蛋白质的微生物的形式)。另外，对于免疫原无需设备纯化和重折叠方案。最后，因为核酸接种依靠接种个体的生物化学仪器(apparatus)以便生产引入核酸的表达产物，期望发生表达产物的最佳翻译后加工；这在自身免疫的情形中特别重要，因为如上所述，多聚体原始B-细胞表位的有效部分应当保存在修饰的分子中，并且因为B-细胞表位原则上可以由任何(生物)分子(例如糖，脂质，蛋白质等)的一部分构成。因此，免疫原的天然糖基化和脂质化模式可能对整体免疫原性非常重要，并且期望通过使宿主生产免疫原保证。
应当注意与目前公开的类似物的增强的表达水平对于DNA接种的功效非常重要，因为体内表达水平是DNA疫苗免疫原性功效中的决定因素之一。
因此，本发明的优选实施方案包含通过将编码类似物的核酸引入动物的细胞和由此获得引入核酸的细胞的体内表达，将本发明的类似物有效呈递给免疫系统。
在该实施方案中，引入的核酸优选是DNA，其可以是以下形式裸DNA，用带电荷或不带电荷的脂质配制的DNA，在脂质体中配制的DNA，包括在病毒载体中的DNA，用促进转染的蛋白质或多肽配制的DNA，用靶向蛋白质或多肽配制的DNA，用钙沉淀剂配制的DNA，与惰性载体分子偶联的DNA，包裹在聚合物中的DNA，例如在PLGA(参考在WO98/31398中描述的微囊化技术)中或在壳多糖或脱乙酰壳多糖中，和用佐剂配制的DNA。关于这点，应当注意几乎所有与常规疫苗制剂中佐剂使用有关的考虑适用于DNA疫苗的配制。因此，本文所有涉及佐剂在基于多肽的疫苗中的应用的公开内容加以必要的变更适用于它们在核酸接种技术中的应用。
关于以上已经详述的基于多肽的疫苗的给药途径和给药方案，这些也适用于本发明的核酸疫苗，并且所有上面关于多肽给药途径和给药方案的讨论加以必要的变更适用于核酸。对此应当加上核酸疫苗可以适当地静脉内和动脉内施用。另外，在本领域中众所周知的是核酸疫苗可以通过使用所谓的基因枪施用，因此这种相当的给药方式也被认为是本发明的一部分。最后，已经报道VLN在核酸给药中的使用产生好结果，因此特别优选这种特殊的给药方式。
另外，用作免疫试剂的核酸可以包含编码在权利要求中规定部分的区域，所述部分例如以上述免疫调节物质如作为有效佐剂讨论的细胞因子的形式。该实施方案优选的形式包含使类似物的编码区域和免疫调制剂的编码区域在不同读框中或至少在不同启动子的控制下。因此避免类似物或表位被生产为免疫调制剂的融合配体。备选地，可以使用两个不同的核苷酸片段，但因为当使两个编码区域包括在相同分子中时确保共表达的优势，这较不优选。
因此，本发明还涉及诱导针对IL5的抗体生产的组合物，该组合物包含-本发明的核酸片段或载体(参考以下核酸和载体的讨论)，和-如上所述药物和免疫可接受的赋形剂和/或载体和/或佐剂。
在通常情形下，以载体形式引入核酸，其中表达在病毒启动子的控制下。关于本发明载体和DNA片段更详细的讨论，参考以下讨论。另外，可获得关于核酸疫苗的配制和使用的详细公开内容，参考Donnelly JJ等，1997，Annu.Rev.Immunol.15617-648和Donnelly JJ等，1997，Life Sciences60163-172。这些参考文献结合于此作为参考。
活疫苗实施本发明类似物向免疫系统的呈递的第三种备选方案是使用活疫苗技术。在活疫苗中，通过向动物施用非病原的微生物实施对免疫系统的呈递，所述微生物已经用编码本发明类似物的核酸片段或结合该核酸片段的载体转化。非病原微生物可以是任何适当的减毒细菌菌株(通过传代或通过使用重组DNA技术去除致病表达产物而减毒)，例如牛分枝杆菌BCG.，非病原链球菌属(Streptococcus spp.)，大肠杆菌(E.coli)，沙门氏菌属(Salmonella spp.)，霍乱弧菌属(Vibrio cholerae)，志贺氏菌属(Shigella)等。涉及现有技术活疫苗制备的综述可以例如在Saliou P，1995，Rev.Prat.451492-1496和Walker PD，1992，Vaccine 10977-990中发现，两者结合于此作为参考。关于在该活疫苗中使用的核酸片段和载体的细节，参考以下讨论。
作为细菌活疫苗的备选方案，以下讨论的本发明的核酸片段可以结合于非毒性病毒疫苗载体如牛痘毒株或任何其它适当的痘病毒中。
通常，仅将非病原微生物或病毒施用于动物一次，但在某些情形中可能需要在生命中多次施用微生物以便保持保护性免疫。甚至考虑当施用活疫苗或病毒疫苗时上面对于多肽疫苗详述的那些免疫方案将是有效的。
备选地，将活疫苗或病毒疫苗与先前或随后的多肽和/或核酸免疫结合。例如，可以用活疫苗或病毒疫苗实施初次免疫，接着随后使用多肽或核酸方法加强免疫。
可以用核酸转化微生物或病毒，其包含编码上述部分例如以上述免疫调制物质如作为有效佐剂讨论的细胞因子的形式的区域。该实施方案优选的形式包含使类似物的编码区域和免疫调制剂的编码区域在不同读框中或至少在不同启动子的控制下。由此避免类似物或表位被生产为免疫调制剂的融合配体。备选地，可以使用两个不同的核苷酸片段作为转化剂。当然，作为表达产物，可以提供在相同读框中含有辅助部分的本发明类似物，按照本发明该实施方案特别优选。
联合治疗一种特别优选的实施本发明的方式包括使用核酸接种作为首次(初次)免疫，接着用基于多肽的疫苗或如上所述的活疫苗次级(加强)免疫。
本发明方法在疾病治疗中的应用治疗方案的精确选择取决于多亚基蛋白对目标的选择。例如，当以IL5为目标时所有在WO 00/65058中讨论的条件有关，当目标是TNFα时，相关的疾病/病症是类风湿性关节炎，幼年慢性关节炎，脊椎关节病，多肌炎，皮肤肌炎，血管炎，牛皮癣(斑块)和牛皮癣关节炎，Mb.Crohn，慢性梗阻性肺病，骨髓发育异常综合征(myelodysplastic syndrome)，类风湿性关节炎中的葡萄膜炎，急性肺功能障碍，哮喘，韦格纳肉芽肿病，过敏性肠病，颞下颌疾病(颚关节疼痛)，口炎骨质疏松症，和癌恶病质以及其它炎性疾病和在本领域通常认为与TNFα的副作用相关的其它病症。因此通过使用本发明用于下调多亚基蛋白活性的方法可以治疗或减轻与这些疾病中任何一种相关的症状。
本发明的组合物本发明还涉及用于实施本发明方法的组合物。因此，本发明还涉及包含免疫原性有效量的上面定义的类似物的免疫原性组合物，所述组合物另外包含药物和免疫学可接受的稀释剂和/或媒介物和/或载体和/或赋形剂和任选地佐剂。换句话说，本发明的该部分涉及基本上如上所述的类似物制剂。当提及肽疫苗的类似物配制时，佐剂，载体和媒介物的选择因此符合上面已经讨论的。
按照本领域众所周知的方法制备类似物。较长的多肽通常通过重组基因技术制备，所述重组基因技术包括将编码类似物的核酸序列引入适当的载体，用该载体转化适当的宿主细胞，表达核酸序列(通过在适当条件下培养宿主细胞)，从宿主细胞或它们的培养上清液回收表达产物，和随后纯化和任选的进一步修饰，例如重折叠或衍生。关于所需的工具的细节不仅在下面标题“本发明的核酸片段和载体”而且在实施例中发现。
较短的肽优选通过众所周知的固相或液相肽合成技术制备。然而，该技术中的近来发展已经使可以通过这些方法生产全长多肽和蛋白质，因此通过合成方法制备长构建体也在本发明的范围内。
本发明的核酸片段和载体从上面的公开内容应当理解不但通过重组基因技术而且通过化学合成或半合成可以制备修饰的多肽；当修饰是或包含与蛋白质载体(如KLH，白喉类毒素，破伤风类毒素，和BSA)和非蛋白质分子如糖聚合物偶联时和当然还当修饰包含将侧链或侧基增加到多聚体衍生的肽链上时后两种选择特别相关。如从上面应当理解，这些实施方案不是优选的实施方案。
为了重组基因技术的目的和当然为了核酸免疫的目的，编码类似物的核酸片段是重要的化学产物(同样它们的互补序列)。因此，本发明的一个重要部分涉及核酸片段，其编码如本文所述的类似物，即如上详述的多聚体衍生的人工多聚体多肽。本发明的核酸片段是DNA或RNA片段。
本发明最优选的DNA片段包含选自SEQ ID NO8，10，12，14，17，48，50，52，54，56，和58或与这些中任何一个互补的核酸序列组成的组的核酸序列。
通常将本发明的核酸片段插入适当的载体以形成携带本发明核酸片段的克隆或表达载体；该新载体也是本发明的一部分。关于本发明这些载体构建的细节将在以下转化的细胞和微生物中讨论。取决于应用的目的和类型，载体可以是质粒，噬菌体，粘粒，微型染色体，或病毒的形式，而且只在某些细胞中瞬时表达的裸DNA也是重要的载体(并可以用于DNA接种)。本发明优选的克隆和表达载体能够自主复制，由此允许为了高水平表达的高拷贝数或为了随后克隆的高水平复制。
本发明载体的通常轮廓在5’→3’方向和在可操作的连接中包含下列特征驱动本发明核酸片段表达的启动子，任选地编码前导肽的核酸序列，该前导肽使多肽片段能够分泌(至胞外相或当适用时至周质中)或整合到膜中，本发明核酸片段，和任选地编码终止子的核酸序列。当在生产者菌株或细胞系中用表达载体操作时，为了转化细胞的遗传稳定性的目的，优选当导入宿主细胞时载体整合到宿主细胞的基因组中。相比之下，当使用用于在动物中实施体内表达的载体工作时(即当在DNA接种中使用载体时)为了安全的原因优选载体能够整合到宿主细胞的基因组中；典型地，使用裸DNA或非整合型病毒载体，其选择对于本领域技术人员是众所周知的。
将本发明的载体用于转化宿主细胞以生产本发明修饰的IL5多肽。该转化的细胞，其也是本发明的一部分，可以是培养细胞或细胞系用于增殖本发明的核酸片段和载体，或用于重组生产本发明修饰的IL5多肽。备选地，转化的细胞可以是适当的活疫苗菌株，其中已经插入核酸片段(单一或多个拷贝)以便实施修饰的IL5分泌或整合至细菌膜或细胞壁中。
本发明优选的转化细胞是微生物如细菌(如物种埃希氏菌属(Escherichia)[例如大肠杆菌]，芽孢杆菌属(Bacillus)[例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)]，沙门氏菌属，或分支杆菌属(Mycobacterium)[优选非病原性的，例如牛分支杆菌BCG])，酵母(如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))，和原生动物。备选地，转化细胞来源于多细胞生物如真菌，昆虫细胞，植物细胞，或哺乳动物细胞。最优选的是来源于人的细胞，参考以下细胞系和载体的讨论。近来的结果已经显示可商购的黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)细胞系(从Invitrogen获得的施奈德2(S2)细胞系和载体系统)在重组生产本发明IL类似物中的应用的巨大前景，因此特别优选该表达系统，这种类型的系统通常也是本发明的优选实施方案。
为了克隆和/或优化的表达，优选转化的细胞能够复制本发明的核酸片段。表达核酸片段的细胞是优选的有效的本发明实施方案；它们可以用于小规模或大规模制备类似物或者在非病原性细菌的情形中，作为活疫苗中的疫苗成分。
当通过转化细胞生产本发明的类似物时，尽管远非基本的，便利的是将表达产物输出到培养基中或运送至转化细胞的表面上，因为这两种选择都促进随后表达产物的纯化。
当已经鉴定有效的生产者细胞，基于其基础优选建立稳定的携带本发明载体和表达编码修饰的IL5的核酸片段的细胞系。优选地，该稳定的细胞系分泌或携带本发明的IL5类似物，由此促进其纯化。
通常，将含有来源于与宿主细胞相适合的物种的复制子和对照序列的质粒载体用于宿主中。载体通常携带复制位点以及标记序列，其能够提供在转化细胞中的表型选择。例如，典型地使用pBR322，来源于大肠杆菌物种的质粒(参见例如Bolivar等，1977)，转化大肠杆菌。pBR322质粒包含氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此提供鉴定转化细胞的容易方法。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体必须还包含或被修饰以包含可以被原核微生物使用用于表达的启动子。
大部分通常用于原核生物重组DNA构建的那些启动子包括B-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，1978；Itakura等，1977；Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，1979；EP-A-0 036 776)。尽管这些是最通常使用的，已经发现和使用其它微生物启动子，已经公开关于它们的核苷酸序列的细节，使技术人员能够将它们与质粒载体功能连接(Siebwenlist等，1980)。某些来自原核生物的基因可以在大肠杆菌中从它们自己的启动子序列有效表达，排除通过人工方法加入另外的启动子的需要。
除了原核生物，可以使用真核微生物如酵母培养物，这里启动子应当能够驱动表达。尽管通常可获得其它许多菌株，在真核微生物中最常使用酿酒酵母，或者普通面包酵母。对于在酵母中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，1979；Kingsman等，1979；Tschemper等，1980)。该质粒已经含有trp1基因，其为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变体菌株例如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，1977)提供选择标记。于是作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1损伤的存在为通过在缺乏色氨酸条件下培养来检测转化提供了有效的环境。
适当的酵母载体中的启动序列包括用于3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968；Holland等，1978)的启动子，所述糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，果糖磷酸激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡糖异构酶和葡糖激酶。在构建适当的表达质粒中，将与这些基因有关的终止序列也连接到表达载体中期望表达的序列的3’端，以提供mRNA的聚腺苷酸化和终止。
其它具有另外通过生长条件控制转录的优势的启动子是对于醇脱氢酶2，同种细胞色素C(isocytochrome C)，酸性磷酸酶，与氮代谢有关的降解酶，和上述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。任何含有酵母相容启动子，复制起点和终止序列的质粒载体是适当的。
除了微生物，来源于多细胞生物的细胞培养物也可以用作宿主。原则上，可使用任何这种细胞培养物，无论来源于脊椎动物或无脊椎动物培养物。然而，最大的兴趣是在脊椎动物细胞，在脊椎动物培养物(组织培养物)的增殖近年来已经变成常规方法(组织培养，1973)。这种有用的宿主细胞系的实例是VERO和HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，和W138，BHK，COS-7 293，秋粘虫(SF)细胞(作为完整的表达系统可从尤其Protein Sciences，1000 Research Parkway，Meriden，CT 06450，U.S.A.和Invitrogen商购)，和MDCK细胞系。在本发明中，特别优选的细胞系昆虫细胞系S2，可以获自Invitrogen，PO Box 2312，9704 CH Groningen，荷兰。
用于该细胞的表达载体通常包括(如果需要)复制起点，位于待表达基因前面的启动子，以及任何需要的核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。
对于用于哺乳动物细胞中，病毒材料经常提供对表达载体的对照功能。例如，通常使用的启动子来源于多形瘤，腺病毒2，和最经常地猿猴病毒40(SV40)或巨细胞病毒(CMV)。SV40病毒的早期和晚期启动子特别有用，因为两者都容易从病毒中作为还包含SV40病毒复制起点的片段获得(Fiers等，1978)。还可以使用较小或较大的SV40片段，条件是包括从HindIII位点向位于病毒复制起点中的BglI位点延伸的约250bp序列。另外，还可以并且经常期望使用启动子或通常与期望基因序列相关的对照序列，条件是该对照序列与宿主细胞系统相容。
通过构建载体以包括外源起点，如可以来源于SV40或其它病毒(例如多形瘤，腺病毒，VSV，BPV)可以提供复制起点，或者可以通过宿主细胞染色体复制机制提供复制起点。如果将载体整合到宿主细胞染色体中，后者经常是充分的。
实施例14种新的二表位(P2+P30)单体IL5构建体的设计IL5是反平行的同型二聚体，其中单体的C-末端和N-末端紧密位于分子中。这使可能将两个单体连接成单独一个紧密类似于野生型二聚体四级结构的单体。
如先前在Li等1997，PNAS USA 94(13)6694-9中所述，使用p2/P30表位作为接头或通过插入二甘氨酸接头我们已经接近这个。
用于所有研究工作的编码DNA分子的天然hIL5购自R&D系统(BBG16)。该DNA序列不包括hIL5前导序列；因此增加合成的编码天然hIL5前导肽的DNA序列。编码P2和P30T细胞表位的序列来源于破伤风类毒素。将这些序列插入基因的天然序列，由此提供IL5的免疫原性变体。保存IL5基因内的读框进行插入。
制备变体的克隆策略基于引物或具有序列重叠的DNA片段的延伸。首先，利用野生型IL5 DNA分子作为模板和侧翼载体引物，在两个分开的PCR反应中延伸具有互补5’末端的弥补插入的两套引物。此后，这两条双链片段，其因此也具有互补的5’末端，在第二次PCR中退火和延伸以包括完整的插入片段。最后，使用侧翼引物扩增片段。这些插入片段然后用适当的内切核酸酶消化，同样将载体消化，将载体和插入片段连接在一起。该方法是由Horton等1989描述的并且由Ausabel等在Currentprotocols in molecular biology(8.5.7-9页)“Introduction of a point mutationby sequential PCR steps”中概述的“splice by overlap extension”方法的改进。
标准的分子生物学技术和DNA操作如限制酶消化，琼脂糖凝胶电泳，大肠杆菌细胞的培养和保藏使用在实验室手册Sambrook，J.，Fritsch，E.F.&Maniatis，T.1989中描述的标准分子生物学技术和使用M&E标准方案进行。
实施例2hIL5.34和hIL5.35
为了使T-细胞表位在分子内部，将P2和P30头接尾作为接头插入两个IL5单体之间，由此产生两个构建体hIL5-P30-P2-hIL5(hIL5.34，在SEQID NO5和6中的成熟肽)和hIL5-P2-P30-hIL5(hIL5.35，在SEQ ID NO7和8中的成熟肽)-两个DNA构建体都编码天然IL5前导序列，导致266个氨基酸的成熟表达产物。由这些设计产生的翻译产物意欲折叠成“单体IL5二聚体”，即具有非常类似于二聚IL5的完整3-维结构的三级结构的单体分子。
实施例3hIL5.36&hIL5.37基于前面由J.Li等通过插入二甘氨酸接头成功产生生物活性的单体“IL5二聚体模拟物”，设计类似的但具有免疫原性的加入T-细胞表位的构建体。变体hIL5.36因此具有在SEQ ID NO9和10中成熟肽的结构，变体hIL5.37具有SEQ ID NO11和12中成熟肽的结构。这两个构建体都编码天然IL5前导序列，接着IL5中的开始4个氨基酸，其再接着第一个插入的表位-另一个表位位于C-末端。
存在2个主要原因使N-末端表位不位于这两个构建体中完整IL5序列的N-末端而不是旨在保存hIL5序列。通过使用与hIL5的N-末端一起的天然hIL5前导肽，我们确保前导肽被正确地切割掉。并且，因为IL5的N-末端构成柔性区域，它对于产生的构建体的3-维结构保持不重要。
由这些设计得到的翻译产物似乎折叠成如实施例2所述的“单体IL5二聚体”。
实施例4表达水平已经将上述人IL5类似物插入多种载体，用于构建，DNA接种和使用本领域的标准方法在昆虫，哺乳动物或大肠杆菌细胞中的重组表达。
特别地，使用COS细胞(瞬时表达)和S2细胞中的标准表达系统和方案，发现表达水平甚至好于使用编码IL5野生型蛋白质的构建体获得的那些，并且表达水平也超过当表达在WO 00/65058中公开的hIL5变体时获得的那些。
实施例5抗-IL5交叉反应性抗体的引入目前公开的人IL5类似物被用于标准的小鼠免疫方案。简而言之，用来自实施例2和3的上述变体免疫小鼠。通过免疫亲和层析分离鼠抗hIL5抗体，将它们抗-hIL5活性与针对野生型hIL5产生的鼠抗体比较。结果显示抗体比针对WO 00/65058中教导的类似物的抗体效价更高，亲和力也更高。
初步结果还显示按照本发明的多聚体模拟物已经至少保存IL5的一些特异活性。
实施例6TNFα变体的制备编码野生型人TNFα单体多肽(SEQ ID NO17)的合成DNA序列“SMTNFWT3”(SEQ ID NO16)由Entelechon GmbH作为连接产物供应。为了在大肠杆菌中表达，按照密码子使用数据库通过排除所有在大肠杆菌中频率小于10％的密码子，优化人hTNFα的DNA序列。另外，设计序列以包括用于随后克隆步骤的5’NcoI限制位点。
将SMTNFWT3连接产物引入pCR 4 TOPO平端载体并转化大肠杆菌DH10B细胞。纯化来自10个得到的SMTNFWT3TOPO克隆的质粒DNA，选择5个含有期望片段的克隆(当通过限制酶(RE)消化分析时)。
分离来自5个可能正确的SMTNFWT3TOPO克隆的NcoI/EcoRI DNA片段，并转移至pET28b(+)载体，测定序列。在4个克隆中鉴定插入，缺失或替代，而1个克隆似乎正确。随后将正确的构建体-SMTNFWT3pET28用作产生所有单一TNFα变体的模板。
实施例7TNF34构建将PanDR表位氨基酸序列(SEQ ID NO7和20)人工“反向翻译”成为在大肠杆菌中优化表达的DNA序列(SEQ ID NO19)，参见以下，并通过SOE PCR插入TNFα的环3。
将得到的构建体(编码SEQ ID NO18的DNA序列)放置在pET28b+载体中以产生TNF34-pET28b+。
实施例8单体化的三聚体构建单体化的三聚体构建体是基于3个由三甘氨酸接头和/或表位编码区域分开的TNFα编码区域。
作为3个分开个体，合成TNFα基因。通过SOE PCR装配3个片段，将装配的基因(SEQ ID NO21)克隆到pCR2.1-TOPO中。在序列验证后，分离正确克隆。hTNFT_0基因(编码TNFα-GlyGlyGly-TNFα-GlyGlyGly-TNFα的SEQ ID NO21，SEQ ID NO22，即3拷贝的被2个三甘氨酸接头分开的SEQ ID NO17)然后被转移至pET28b+以产生hTNFT_0-pET28b+。分离正确克隆，验证序列并转化到大肠杆菌系BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中。
将hTNFT_0-pET28b+用作模板以通过SOE PCR产生下列4个单体化的三聚体变体hTNFT_1，hTNFT_2，hTNFT_3和hTNFT_4(SEQ ID NO49，51，57，和59)。以类似方法可以制备另一变体(SEQ ID NO53)。
hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3是包括破伤风类毒素表位P2和P30(分别SEQ ID NO3和5)的变体，其需要两轮SOE PCR装配。hTNFT_4是含有PADRE(SEQ ID NO7)插入片段的变体，并且可以通过单独一轮SOE PCR装配。以类似方法可以制备另一变体(SEQ ID NO55)。
通过上述方法构建hTNFT_4，在TOP10细胞中发现hTNFT_4-pET28b+的正确克隆，将构建体转移至BL21-STAR和HMS174细胞。
为了产生hTNFT_1，hTNFT_2和hTNFT_3，通过SOE PCR以极小的三聚体片段插入表位，通过RE切割和连接将其插入hTNFT_0-pET28b+。
实施例9
稳定化TNF34突变体为了进一步使上述TNF34-pET28b+变体稳定，构建含有附加二硫键的引入以及缺失突变的变体。构建3种不同变体TNF34-A-pET28b+含有替代Q67C和A111C，TNF34-B-pET28b+含有A96C和I118C，TNF34-C-pET28b+含有8个最N-末端氨基酸的缺失-表达产物的氨基酸序列在SEQ ID NO20，30，和31中阐明。
所有3种构建体是使用SOE PCR制备，并克隆于BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，接着序列验证。
实施例10柔性环变体为了发现可能显示与TNF34-pET28b+变体相比改善性能的变体，制备其中PADRE插入片段(SEQ ID NO7)在TNFα分子的柔性环3中移动的构建体。
所有这些TNF35-pET28b+，TNF36-pET28b+，TNF37-pET28b+，TNF38-pET28b+，TNF39-pET28b+和PADRE位于分子C-末端的变体；TNFC2-pET28b+，是用SOE PCR技术制备并且克隆于BL21-STAR，BL21-GOLD和HMS174中，接着序列验证。表达产物的氨基酸序列在SEQID NO23，24，24，26，27和28中阐明。
为了也评估使用昆虫细胞作为表达系统的可能性，将TNFWT，TNF34，TNF35，TNF36，TNF37，TNF38，TNF39和TNFC2转移至p2Zop2f载体(参考图1)并在S2昆虫细胞中表达。
实施例11其它构建体已经制备另外大量的TNFα变体，所有命名为TNFX，参见以上。通过SOE PCR已经制备编码这些变体的DNA，并直接克隆到pET28b+中。
已经将正确的TNFX克隆转化到BL21-STAR和HMS174中，随后验证序列。
实施例12周质表达已经将LTB前导序列直接添加到TNF34-pET28b+中SEQ ID NO16的上游，以便将表达靶向周质空间。
实施例13哺乳动物表达为了检验在哺乳动物细胞中的表达，已经将SEQ ID NO16和编码TNF34的DNA转移至pHP1载体，其是可商购的pCI载体(PromegaCorporation)的变体。pHP1包括作为标记的卡那霉素抗性基因而不是pCI的AmpR基因。
实施例14GroEL和GroES的共表达先前已经报道大肠杆菌陪伴分子复合体，GroEL/ES的表达增加可溶性TNFα突变体的表达(Jeong，W等1997，Biotechnology letters，19卷，第6期579-582页)。为了检验GroEL/ES的共表达是否能改善如本文所述的TNFα变体的表达，已经使用包含来自大肠杆菌的在它天然启动子控制下的GroEL/ES操纵子的质粒。已经将该质粒与编码野生型TNFα，TNF34或TNF37的DNA共转化到HMS174中。通过平铺在含有卡那霉素和Carbecillin，它们是两个相关的选择标记的平板上选择双重转化子。然后通过RE分析鉴定双重转化子以检验两个质粒在相同克隆中的存在。
在预实验中，在37℃下将细胞培养至OD600＝0.6-1，接着在42℃下热激30分钟。未将对照细胞级分热激，将所有细胞稀释5倍到含有1mMIPTG的LB培养基中，并在25℃下培养。
收获细胞，分析上清液和裂解液的TNFα表达。进行考马斯染色以评估GroEL/ES表达。
在该实验中，未观察到通过加入陪伴分子的改善。这主要是因为在该实验中即使缺少陪伴分子下我们也获得几乎100％的可溶性物质。然而我们将检验对本发明其它变体的改善，如果这些似乎是较小可溶性的变体。
实施例15大肠杆菌表达已经在实验室发酵罐以及摇瓶中检验可溶性TNFα变体在三种不同大肠杆菌菌株中的表达。所用的发酵设备是Infors发酵罐系统，工作体积为1L。检验的三种大肠杆菌菌株是HMS174，BL21 STAR和BL21 GOLD。用于发酵的培养基是以葡萄糖为唯一碳源的已知成分的基本培养基。
一个主要目的是测定最佳发酵工艺参数(特别是温度和IPTG浓度)以便优化可溶性TNFα变体的表达。
工艺参数参数设定点范围 处理界限pH 7.0 6.5-7.5＜6.4-＞7.6起始温度37℃ 36-38℃＜36-＞38℃诱导温度25℃ 24-26℃＜24-＞26℃DO2张力30％ 0-100％＞90％超过4小时1000搅拌器1000-1500 -RPM已经发现一种适当的方案如下IPTG浓度是0.5mM，诱导温度降低至25℃。总发酵时间是14-18小时，包括增殖，诱导和蛋白质生产。总发酵时间取决于培养物的生长。如从接种培养物中的OD计算，在发酵罐中OD600的起始典型地为0.1-0.3(在预培养物中2-6)。培养物的诱导在OD600＝20±1-2或接种后9-11小时进行。然后进行蛋白质生产3-5小时。
备选地通过利用低温培养以避免变体蛋白质胞内沉淀为内含体，完成TNFα变体的表达。在与实际诱导相同的温度下完成培养物至所需OD的培养，以避免通过将温度从最佳生长温度(37℃)改变至较低的诱导温度(25℃)对细胞造成的“休克”。通过使用该方法，认为只有强加在细胞上的压力是通过IPTG的实际诱导-无论如何，该方法最近已经提供显著改善的可溶性表达产物的产率。通过提前一天制备少量过夜培养物和制备较大的1L LB培养基，在大LB-培养物中物质的产生能够在约9小时内完成，而实际诱导时期是过夜完成(16-20小时内)。因此，优选方法可以描述如下在2×2L带挡板的含有1L LB培养基的摇瓶中进行TNFα变体的表达，每个仅具有的对上述方法的修改是将细胞(BL21 STAR)在25℃下培养至OD436为0.7，其后用1mM IPTG诱导细胞并允许生产蛋白质20小时(仍在25℃下)。
实施例16选择测定将使用KD-4和Wehi细胞的直接受体ELISA以及多克隆ELISA和细胞毒性测定用作最优良的测定以筛选并且接着纯化。将针对TNFα变体生产的抗体用于抑制受体和细胞毒性测定中野生型TNFα的结合，以测量抗体质量。
实施例17纯化步骤在本实施例中，详细描述重组生产和随后纯化TNFα变体中的一种(TNF37)。然而，纯化方法是按照本发明优选的一种并且也将适用于(对于每种变体具有小的相关调整)本发明的其它TNFα变体。
将来自LB-卡那霉素平板(含有1.5％琼脂的60mg卡那霉素/L LB培养基)的大肠杆菌菌株BL21 STAR/TNF37菌落再悬浮在5ml LB-培养基(60mg卡那霉素/L LB)中并在New Braunswick振荡器中220RPM振荡同时在37℃下培养过夜(16小时)。
将2×2ml该培养物转移至2L带挡板的摇瓶中的2×1L LB(60mg卡那霉素/L)，并允许细胞在New Braunswick振荡器中在220RPM下培养至OD436＝0.6-0.8。该步骤已经在例举的温度37℃和25℃下进行，但温度对于每种培养物可以优化。
将1ml 1M IPTG加入每个摇瓶并允许细胞生长16-20小时。在诱导前，如果这已经不是发酵温度，将温度调整至25℃。
通过在Sorvall离心机中使用SLA-3000转头在5000RPM下离心15分钟，将细胞收获在离心管(500ml)中。
使用0.9％NaCl将细胞转移至一个预先称量的500ml离心管中，通过如上离心收获细胞。
排除上清液并称量管子以测定细胞重量(应当为7-11克)。
加入200ml 50mM Na2HPO4，pH＝7.0(如果将细胞再悬浮，它们应当直接使用，否则可以冷冻)。
细胞破裂，离心，和过滤细胞的机械破裂在效率，可靠性和选择任何在纯化的随后步骤中需要的缓冲液的能力方面提供优于酶破裂的几个优势。通过在使用前将冰水加入样品室和将冰水通过两个样品通道之间的机器，在操作期间将APV-1000保持冷却。在层析分离蛋白质之前，离心和过滤用来去除来自溶液的任何颗粒或聚集体。细胞破裂和HA-层析应当在同一天完成，因为这可能最小化由于在层析步骤中从这些分离导致的明显的蛋白酶活性。破裂，离心和过滤的方法如下将小心再悬浮的细胞物质转移至细胞-破裂仪(APV-1000)。使用700巴的反压力(这时溶液应当清澈)将细胞悬浮液小心2x通过破裂仪(在每次通过后在冰上冷却并将冰水在通道之间通过APV-1000)。
将破裂的细胞转移至500ml离心管，使用SLA-3000转头在Sorvall离心机中在10000RPM下旋转细胞45分钟。
将提取物(约225ml)通过0.22μm滤器。
羟基磷灰石(HA)层析羟基磷灰石Bio-Gel HTP Gel(BIO-RAD；目录号#130-0420)是磷酸钙的结晶形式，其已经证明它本身是独特的分离蛋白质如单克隆抗体和其它蛋白质的工具，否则通过其它方法不能分离。然而，以我们的经验，在高于2ml/min的流动将压力升至不能接受的高水平的意义上，材料的流动特性稍微苛刻。此外当试图如制造厂商所推荐用氢氧化钠再生时材料已经崩溃数次。
缓冲液和柱缓冲液A+B的贮液1M Na2HPO4x2H2O，pH＝7.0(pH用HCl调整至7)。缓冲液A+B由贮液的稀释液制备。
缓冲液A50mM Na2HPO4x2H2O，pH＝7.0缓冲液B0.3M Na2HPO4x2H2O，pH＝7.0使用在缓冲液A中的悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱，用羟基磷灰石Bio-Gel HTP Gel(BIO-RAD；目录#130-0420)将柱填充至约50-60ml。
层析程序以30ml/min流动清洗系统20ml。
平衡以2ml/min流动4CV缓冲液A以2ml/min流动通过泵(BioCad上的入口F)上样(如果需要管道中的样品约225+5-10ml)。
以2ml/min流动用1.5CV缓冲液A洗涤柱。
洗脱以2ml/min流动用4CV的0％-100％梯度的缓冲液B洗脱蛋白质。
以2ml/min流动用2CV缓冲液B清洗柱。
以2ml/min流动用4CV缓冲液A再平衡。
选择级分，合并，在4℃下针对15x体积的20mM Tris-HCl，0.075MNaCl，pH8.0透析。
在HA层析后选择含有TNF37的级分HA层析洗脱级分曲线基本上由“穿过(run through)”级分和一个可以分成几个峰的洗脱峰组成。因为含有TNF37的峰不能直接鉴定，基于全部峰的考马斯染色凝胶选择含有TNF37的级分。然而，因为随后的纯化步骤，该点级分的选择较不重要，可以稍后在方法中去除污染物。因此，较不保守的选择级分确保变体的最大产率。
开始用“点印迹”检查“穿过”的任何TNF37。这产生阳性结果，其在理论上应当说明显著部分的变体未与柱结合。然而，当将“穿过”进行非常有效的SP-琼脂糖阳离子交换层析(参考下一步)和用考马斯染色凝胶分析级分时，它们不含有任何可检测的TNF37-变体，说明在“点印迹”中的一些假阳性反应或一部分变体与SP-琼脂糖结合完全不同。
SP-琼脂糖阳离子交换层析由于与野生型TNFα7.8的pI相比，变体相当高的计算的9.4的pI，SP-琼脂糖是选择的碱性阳离子交换步骤。这pI的增加是通过PADRE表位引入2个赖氨酸的结果。该层析对于TNF37变体非常有效和迅速，并期望可用于大量的其它TNFα的环变体。
在继续SP-琼脂糖层析之前施加的样品应当具有低于8mS/cm的电导率并且pH应当至少7.7，因为以我们的经验这变化已经使蛋白质的结合特性有时不同。
缓冲液和柱缓冲液A+B贮液的1M Tris-HCl.pH＝8.0。
缓冲液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
缓冲液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
使用在缓冲液A中的悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱，用SP-琼脂糖FF(Amersham Biosciences；目录#17-0729-01)将柱填充至约60ml。
层析程序以30ml/min的流动清洗系统20ml。
平衡以4ml/min流动4CV缓冲液A以4ml/min流动通过泵(BioCad上的入口F)上样(如果需要管道中的样品样品+10ml)。
以4ml/min流动用1.5CV缓冲液A洗涤柱。
洗脱以4ml/min流动用4CV的0％-100％梯度的缓冲液B洗脱蛋白质。
以4ml/min流动用2CV缓冲液B清洗柱。
以4ml/min流动用4CV缓冲液A再平衡。
选择级分，合并，在4℃下针对15x体积的20mM Tris-HCl，0.075MNaCl，pH8.0透析。
在SP琼脂糖层析后选择含有TNF37的级分曲线基本上由“穿过”级分和几种含有蛋白质的峰组成。然而，两个峰含有变体以及一些污染物。这时重要的是在第二个峰的右侧不包括许多级分，因为以我们的经验这包括许多在随后层析步骤中难以去除的污染物。
Q-琼脂糖阴离子交换层析Q-琼脂糖是选择的用于去除主要污染蛋白质的碱性阴离子交换步骤，其具有高再现性，接着包括HA-层析和SP-琼脂糖的TNF37的纯化。TNF37变体它本身不与柱结合，但主要的未知污染物与柱结合。然而，可以以已经在SP-琼脂糖步骤中的保守方式选择级分，那样避免污染物。然而，与当在方法中使用Q-琼脂糖时比较，这损害TNF37变体的产率，因为在该步骤中还去除其它次要的污染物，优选将它包括在整个方法中。总之，Q-琼脂糖步骤在纯化变体37中是重要的并且提供甚至更好的高产率的终产物。
缓冲液和柱缓冲液A+B的贮液1M Tris-HCl.pH＝8.0。
缓冲液A20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH＝8.0。
缓冲液B20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH＝8.0。
使用在缓冲液A中的悬浮液和XK 26/40(Amersham Biosciences)柱，用Q-琼脂糖FF(Amersham Biosciences；目录#17-0510-01)将柱填充至约50-60ml。
层析程序以30ml/min流动清洗系统20ml。
平衡以4ml/min流动4CV缓冲液A以2ml/min流动通过泵(BioCad上的入口F)上样(如果需要管道中的样品样品+10ml)。
以4ml/min流动用3CV缓冲液A洗涤柱。
洗脱以4ml/min流动用2CV的100％缓冲液B洗脱剩余的蛋白质。
以4ml/min流动用4CV缓冲液A再平衡。
选择级分，合并，并直接上样至SP-琼脂糖柱。
洗脱曲线基本上由“穿过”级分和几种含有蛋白质的峰组成。“穿过”级分有时可以分成几种完全分离的全都包含TNF37变体的峰，因此全部被合并。当明显的蛋白水解降解的问题被解决时，TNF37的不均匀性可能被解决。
实施例18免疫研究材料盐水(无菌水中0.9％NaCl，Fresenius Kabi Norge AS，挪威)完全弗氏佐剂(Sigma，F-5881，39H8926)不完全弗氏佐剂(Sigma，F-5506，60K8937)铝胶2％[10mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 96(3176))Adjuphos[5mg Al/ml](Brenntag Biosector，Batch 2(8937))野生型人TNF(Invitrogen 目录号10062-024)KYM-1D4由A.Meager(A.Meager，J.Immunol.Methods 1991，144141-143)提供WEHI 164克隆13由T.Espevik(T.Espevik和J.Nissen-Myer，J.Immunol.Methods 1986，9599-105)提供四唑盐(MTS，CellTiter 96 Aqueous one solution；Promega，G3581)旋转棒(rotating bar)(Rotamix，Heto，Denmark)涡旋(Vortex)(OLE DICH仪器制造商ApS，丹麦)制剂/佐剂选择用盐水(0.9％ NaCl)将纯化的TNFα变体蛋白质(在20mM Tris-HCl，0.075M NaCl，pH8.0中)稀释至0.5mg/ml，分批(375μg/小管)并贮存在-20℃直至用于免疫。
对于每种TNF变体，用两种佐剂进行免疫1)完全弗氏佐剂(CFA，用于初次免疫)和不完全弗氏佐剂(IFA，用于加强免疫)和2)铝胶或Adjuphos(分别是现有技术的氢氧化铝和磷酸铝佐剂)-这些用于初次和加强注射。
在初次免疫之前，做出选择铝胶或Adjuphos作为TNF变体的佐剂的决定。选择具有最好的吸收TNF变体的能力的佐剂用于进一步在免疫实验中的使用。在两个小瓶中将两等分部分的TNFα变体与等体积的铝胶和Adjuphos混合。在旋转棒上在室温下轻轻混合小瓶30分钟。然后在13000g下将小瓶离心15分钟，在梯度(4-12％)SDS凝胶上检验上清液的可溶性TNF变体含量。然后选择含有最少游离变体(即其中更多的变体已经与铝颗粒结合)的佐剂/变体等分部分为最好的佐剂。
抗原/佐剂乳剂(emulgate)的制备通过下列方法制备CFA/IFA乳剂融化含有TNFα变体
的小瓶，转移至10ml无菌小瓶并与等体积的CFA或IFA混合。然后将小瓶进一步在涡旋上在3300rpm下在20℃下混合30分钟。
通过下列方法制备铝胶/Adjuphos乳剂用盐水将铝胶/Adjuphos稀释至1.4mg Al/ml。融化含有TNFα变体
的小瓶，转移至10ml无菌小瓶并与等体积的铝胶[1.4mg Al/ml]或Adjuphos[1.4mg Al/ml]混合。然后将小瓶进一步在旋转棒上在20℃下混合30分钟。
动物模型选择用TNFα变体将6-8周龄的Balb/Ca雌性小鼠反复免疫。以不同的时间间隔收集血样并研究分离的血清抗-野生型TNFα的抗体效价。小鼠定购自Taconic Farms，Inc.Acquires M&B A/S，丹麦。在实验开始前将小鼠收容在Pharmexa动物机构1周。
免疫方案和剂量用分别在CFA/IFA和铝胶/Adjuphos中的每种TNFα变体免疫10+10只小鼠的组。将20+20只小鼠用于使用野生型TNFα的免疫。
在初次免疫时，将50μg佐剂中的蛋白质皮下注射。在初次免疫后2，6和10周，所有小鼠将接受另外的使用25μg佐剂中的蛋白质的皮下加强免疫。
在初次免疫即刻前和每次加强免疫以后1周收集血样。
使用的测定使用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞的细胞毒性生物测定该测定是用来测定本发明TNFα变体的毒性。在滴定量的TNFα变体的存在下培养细胞48小时，通过加入四唑盐(MTS)测定细胞死亡，所述四唑盐被活细胞生物还原成有色甲产物。将TNFα变体的细胞毒性与人野生型TNFα比较。
使用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞的细胞毒性抑制生物测定该测定用来研究在TNFα免疫的小鼠中产生的抗血清中和野生型TNFα的细胞毒性作用的能力。用滴定量的抗血清和恒定浓度的野生型人TNFα培养细胞48小时，所述恒定浓度的野生型人TNFα在缺乏抗血清的情况下足以诱导50％细胞的细胞死亡。如上所述通过MTS测定细胞死亡。将来自TNFα变体免疫的小鼠的血清的中和能力与获自用人野生型TNFα免疫的小鼠的血清比较。
体外研究使用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞的细胞毒性生物测定使用WEHI 164克隆13-或KYM-1D4-细胞的细胞毒性抑制生物测定。
最好的免疫原性构建体的选择标准TNFα变体应当显示最小的细胞毒性。用TNFα变体免疫小鼠应当在WEHI-或KYM-1D4细胞中产生具有更好或与从人野生型TNFα免疫的小鼠中获得的血清相等的中和人野生型TNFα-介导的细胞毒性能力的抗血清。
序列表<110>法麦克萨有限公司<120>多聚体蛋白质的新免疫原性模拟物<130>P1013DK00<160>60<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>115<212>PRT<213>人<400>1Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg20 25 30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile35 40 45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr50 55 60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65 70 75 80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe85 90 95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile100 105 110Ile Glu Ser115<210>2<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(45)<223>
<400>2cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg45Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>3<211>15<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>破伤风类毒素P2表位<400>3Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu1 5 10 15<210>4<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P30表位<220>
<221>CDS<222>(1)..(63)<223>
<400>4ttc aac aac ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc48Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15gct tcc cac ctg gaa63Ala Ser His Leu Glu20<210>5<211>21<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>破伤风类毒素P30表位<400>5Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser1 5 10 15Ala Ser His Leu Glu20<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Pan DR结合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<223>
<400>6gcc aag ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>7<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Pan DR结合肽(PADRE)<400>7Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>8<211>858<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>通过P30和P2表位连接的2人IL5单体<220>
<221>CDS<222>(1)..(855)<223>
<220>
<221>mat_肽<222>(58)..()<223>
<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>
<400>8atg agg atg ctt ctg cat ttg agt ttg ctg gct ctt gga gct gcc tac 48Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5gtg tat gcc atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag 96Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu-1 1 5 10acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag144Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu15 20 25act ctg agg att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act192Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr30 35 40 45gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctg gag agt caa act gtg caa240Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln50 55 60ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa288Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65 70 75tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta336Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val80 85 90aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag ttt ctt ggt gta atg aac acc384Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr95 100 105gag tgg ata ata gaa agt ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg432Glu Trp Ile Ile Glu Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu110 115 120 125cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag cag tac atc aag gcc480Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala130 135 140aac tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg atc ccc aca gaa att ccc528Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ile Pro Thr Glu Ile Pro145 150 155
aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga576Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg160 165 170act ctg ctg ata gcc aat gag act ctg agg att cct gtt cct gta cat624Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His175 180 185aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca672Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr190 195 200 205ctg gag agt caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa720Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys210 215 220aac ttg tcc tta ata aag aaa tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt768Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys225 230 235gga gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag816Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu240 245 250ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga858Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser255 260 265<210>9<211>285<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>通过P2和P30表位连接的2人IL5单体<220>
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<220>
<221>mat_肽<222>(58)..()<223>
<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>
<400>10atg agg atg ctt ctg cat ttg agt ttg ctg gct ctt gga gct gcc tac 48Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5gtg tat gcc atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag 96Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu-1 1 5 10acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag144Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu15 20 25act ctg agg att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act192Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr
30 35 40 45gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctg gag agt caa act gtg caa240Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln50 55 60ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa288Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65 70 75tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta336Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val80 85 90aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag ttt ctt ggt gta atg aac acc384Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr95 100 105gag tgg ata ata gaa agt cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc432Glu Trp Ile Ile Glu Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile110 115 120 125ggc atc acc gag ctg ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg ctg cgc480Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Ash Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg130 135 140gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag atc ccc aca gaa att ccc528Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ile Pro Thr Glu Ile Pro145 150 155aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga576Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg160 165 170act ctg ctg ata gcc aat gag act ctg agg att cct gtt cct gta cat624Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His175 180 185aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca672Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr190 195 200 205ctg gag agt caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa720Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys210 215 220aac ttg tcc tta ata aag aaa tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt768Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys225 230 235gga gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag816Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu240 245 250ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt tga858Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser255 260 265<210>11<211>285<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>通过P2和P30表位连接的2人IL5单体<400>11Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu-1 1 5 10
Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu15 20 25Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr30 35 40 45Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln50 55 60Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys65 70 75Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val80 85 90Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr95 100 105Glu Trp Ile Ile Glu Ser Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile110 115 120 125Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg130 135 140Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ile Pro Thr Glu Ile Pro145 150 155Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg160 165 170Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His175 180 185Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr190 195 200 205Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys210 215 220Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys225 230 235Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu240 245 250Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser255 260 265<210>12<211>864<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由两个甘氨酸接头连接并且包括位于末端的P30和P2表位的两个人IL5单体<220>
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<220>
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<221>misc_feature<222>(817)..(861)<223>破伤风类毒素P30表位<220>
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<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>
<400>12atg agg atg ctt ctg cat ttg agt ttg ctg gct ctt gga gct gcc tac 48Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5gtg tat gcc atc ccc aca gaa ttc aac aac ttc acc gtg agc ttc tgg 96Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp-1 1 5 10ctg cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag att ccc aca agt144Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ile Pro Thr Ser15 20 25gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga act ctg192Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu30 35 40 45ctg ata gcc aat gag act ctg agg att cct gtt cct gta cat aaa aat240Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn50 55 60cac caa ctg tgc act gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctg gag288His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu65 70 75agt caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg336Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu80 85 90tcc tta ata aag aaa tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa384Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu95 100 105gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag ttt ctt432Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu110 115 120 125ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt ggc ggt atc ccc aca480Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser Gly Gly Ile Pro Thr130 135 140gaa att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc ttg gca ctg ctt tct528Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser145 150 155act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act ctg agg att cct gtt576Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val160 165 170
cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa gaa atc ttt cag gga624Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly175 180 185ata ggc aca ctg gag agt caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga672Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg190 195 200 205cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac att gac ggc caa aaa720Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys210 215 220aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tac768Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr225 230 235ctg caa gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt816Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser240 245 250cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc atc ggc atc acc gag ctg tga864Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe IIe Gly Ile Thr Glu Leu255 260 265<210>13<211>287<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由两个甘氨酸接头连接并且包括位于末端的P30和P2表位的两个人IL5单体<400>13Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp-1 1 5 10Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Ile Pro Thr Ser15 20 25Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu30 35 40 45Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn50 55 60His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu65 70 75Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu80 85 90Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu95 100 105Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu110 115 120 125Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser Gly Gly Ile Pro Thr130 135 140
Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser145 150 155Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val160 165 170Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly175 180 185Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg190 195 200 205Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys210 215 220Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr225 230 235Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser240 245 250Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu255 260 265<210>14<211>864<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由两个甘氨酸接头连接并且包括位于末端的破伤风类毒素P2和P30表位的两个人IL5单体<220>
<221>CDS<222>(1)..(861)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(70)..(114)<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>misc_feature<222>(817)..(861)<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>
<220>
<221>mat_肽<222>(58)..()<223>
<400>14atg agg atg ctt ctg cat ttg agt ttg ctg gct ctt gga gct gcc tac 48Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5gtg tat gcc atc ccc aca gaa cag tac atc aag gcc aac tcc aag ttc 96Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe-1 1 5 10
atc ggc atc acc gag ctg att ccc aca agt gca ttg gtg aaa gag acc144Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr15 20 25ttg gca ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg ata gcc aat gag act192Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr30 35 40 45ctg agg att cct gtt cct gta cat aaa aat cac caa ctg tgc act gaa240Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu50 55 60gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctg gag agt caa act gtg caa ggg288Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly65 70 75ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc tta ata aag aaa tac336Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr80 85 90att gac ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa aga cgg aga gta aac384Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn95 100 105caa ttc cta gac tac ctg caa gag ttt ctt ggt gta atg aac acc gag432Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu110 115 120 125tgg ata ata gaa agt ggc ggt atc ccc aca gaa att ccc aca agt gca480Trp Ile Ile Glu Ser Gly Gly Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala130 135 140ttg gtg aaa gag acc ttg gca ctg ctt tct act cat cga act ctg ctg528Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu145 150 155ata gcc aat gag act ctg agg att cct gtt cct gta cat aaa aat cac576Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His160 165 170caa ctg tgc act gaa gaa atc ttt cag gga ata ggc aca ctg gag agt624Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser175 180 185caa act gtg caa ggg ggt act gtg gaa aga cta ttc aaa aac ttg tcc672Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser190 195 200 205tta ata aag aaa tac att gac ggc caa aaa aaa aag tgt gga gaa gaa720Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu210 215 220aga cgg aga gta aac caa ttc cta gac tac ctg caa gag ttt ctt ggt768Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly225 230 235gta atg aac acc gag tgg ata ata gaa agt ttc aac aac ttc acc gtg816Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val240 245 250agc ttc tgg ctg cgc gtg cct aag gtg agc gcc agc cac ctg gag tga864Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu255 260 265<210>15<211>287<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由两个甘氨酸接头连接并且包括位于末端的破伤风类毒素P2和P30表位的两个人IL5单体<400>15
Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr-15 -10 -5Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe-1 1 5 10Ile Gly Ile Thr Glu Leu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr15 20 25Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr30 35 40 45Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu50 55 60Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly65 70 75Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr80 85 90Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn95 100 105Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu110 115 120 125Trp Ile Ile Glu Ser Gly Gly Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala130 135 140Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu145 150 155Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His160 165 170Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser175 180 185Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser190 195 200 205Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu210 215 220Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly225 230 235Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser Phe Asn Asn Phe Thr Val240 245 250Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu255 260 265<210>16<211>477
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人野生型TNF(优化的密码子)<220>
<221>CDS<222>(1)..(477)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>成熟的TNF序列<400>16atg gtg cgc tca agc tcg cgc acg ccg agt gac aaa cca gta gct cat 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15gtt gtg gcc aac cct cag gcg gaa ggc cag ctc caa tgg tta aat cgt 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcg aac gcc ctg ctg gcg aac ggc gtg gaa ctg cgt gat aac cag144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45ctg gtg gtc ccc agc gag ggg ctg tat ctg atc tat tca cag gtg ttg192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttt aag ggt cag ggt tgt ccg agc acc cac gtt ctg ctg acg cat acc240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80att tct cgt att gct gta tct tat caa act aaa gtc aat tta ctt tcg288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcg atc aaa tcc ccg tgc caa cgt gag acc cct gaa gga gcg gaa gcc336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aaa cct tgg tac gaa ccg atc tat ctg ggg ggc gtt ttt cag ctc gaa384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aaa ggt gat cgg ctg agc gcc gaa att aat cgc ccg gac tac ctt gat432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gca gag tcc ggt cag gtc tac ttc ggc att atc gca ttg taa477Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>17<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人野生型TNF(优化的密码子)<400>17Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30
Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>18<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>hTNF氨基酸109-157<400>18Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe
50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>19<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Pan DR结合肽(PADRE)<220>
<221>CDS<222>(1)..(39)<223>
<400>19gcg aag ttc gtt gca gct tgg acc ctg aag gcc gct gca 39Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>20<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Pan DR结合肽(PADRE)<400>20Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala1 5 10<210>21<211>1437<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>三聚体人TNF的单体模拟物<220>
<221>CDS<222>(1)..(1437)
<223>
<220>
<221>突变<222>(475)..(483)<223>三甘氨酸接头的编码序列<220>
<221>突变<222>(955)..(963)<223>三甘氨酸接头的编码序列<400>21atg gtg cgc agc agc agc cgc acc ccc agc gac aag ccc gtg gcc cac 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15gtg gtg gcc aac ccc cag gcc gag ggc caa ctg cag tgg ctg aac cgc 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcc aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtg gag ctg cgc gac aac cag144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45ctg gtg gtg ccc agc gag ggc ctg tac ctg atc tac agc cag gtg ctg192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttc aag ggc cag ggc tgc ccc agc acc cac gtg ctg ctg acc cac acc240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80atc agc cgc atc gcc gtg agc tac cag acc aag gtg aac ctg ctg agc288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcc atc aag agc ccc tgc cag cgc gag acc ccc gag ggc gcc gag gcc336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctc ggc ggc gtg ttc cag ctg gag384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aag ggc gac cgc ctg agc gcc gag atc aac cgc ccc gac tac ctg gac432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gcc gag agc ggc cag gtg tac ttc ggc atc atc gcc ctg ggt ggc480Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160gga gtc cgg tcc tcc tcc cgg aca cca tcc gac aaa cca gtc gct cat528Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175gtc gtc gct aat cca caa gct gaa ggt caa ctt caa tgg ctt aat cgg576Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190cgg gct aat gct ctt ctt gct aat ggt gtc gaa ctt cgg gac aat caa624Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205ctt gtc gtc cca tcc gaa ggt ctt tat ctt att tat tcc caa gtc ctt672Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220ttt aaa ggt caa ggt tgt cca tcc aca cat gtc ctt ctt aca cat aca720Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240
att tcc cgg att gct gtc tcc tat caa aca aaa gtc aat ctt ctt tcc768Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255gct att aaa tcc cca tgt caa cgg gaa aca cca gaa ggt gct gaa gct816Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270aaa cct tgg tat gaa cca att tat ctt ggt ggt gtc ttt caa ctt gaa864Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285aaa ggt gac cgg ctt tcc gct gaa att aat cgg cca gat tat ctt gac912Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300ttt gct gaa tcc ggt caa gtc tat ttt ggt att att gct ctg ggc ggt960Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320ggg gtt cgt tct tct tct cgt acg ccg tct gat aag ccg gtt gcg cac 1008Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335gtt gtt gcg aac ccg cag gcg gag ggg caa ttg cag tgg ttg aat cgt 1056Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350cgt gcg aac gcg ttg ttg gcg aat ggg gtt gaa ttg cgt gat aac caa 1104Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365ttg gtt gtt ccg tct gag ggg ttg tac ttg ata tat tct cag gtt ttg 1152Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380ttc aaa ggg caa ggg tgc ccg tct acg cat gtt ttg ttg acg cac acg 1200Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400ata tct cgt ata gcg gtt tct tac cag acg aag gtt aat ttg ttg tct 1248Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415gcg ata aaa tct ccg tgt caa cgt gaa acg ccg gaa ggg gcg gag gcg 1296Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430aag ccg tgg tat gaa ccg ata tac ttg ggg ggg gtt ttt cag ttg gaa 1344Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445aaa ggg gat cgt ttg tct gcg gag ata aac cgt ccg gac tat ttg gat 1392Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460ttc gcg gaa tct ggg caa gtt tac ttt ggg ata ata gcg ctg taa 1437Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu465 470 475<210>22<211>478<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>三聚体人TNF的单体模拟物<400>22Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320
Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu465 470 475<210>23<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(107)..(119)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(106)<223>hTNF氨基酸1-106<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(120)..(170)<223>hTNF氨基酸107-157<400>23Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Ala Lys Phe Val Ala Ala100 105 110Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>24<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(108)..(120)<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(107)<223>hTNF氨基酸1-107<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(121)..(170)<223>hTNF氨基酸108-157<400>24Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Ala Lys Phe Val Ala100 105 110Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>25<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有12个氨基酸的插入的PADRE的<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(109)<223>hTNF氨基酸1-109<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(169)<223>hTNF氨基酸110-157<400>25Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60
Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>26<211>167<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(109)<223>hTNF氨基酸1-109<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(121)..(167)<223>hTNF氨基酸111-157<400>26Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile
65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile115 120 125Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala130 135 140Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val145 150 155 160Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>27<211>165<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(107)..(119)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(106)<223>hTNF氨基酸1-106<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(119)..(165)<223>hTNF氨基酸111-157<400>27Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80
Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Ala Lys Phe Val Ala Ala100 105 110Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu115 120 125Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile130 135 140Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe145 150 155 160Gly Ile Ile Ala Leu165<210>28<211>173<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有C-末端三甘氨酸接头和PADRE的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(157)<223>hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(158)..(160)<223>三甘氨酸接头肽<220>
<221>诱变剂<222>(161)..(173)<223>PADRE<400>28Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95
Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly145 150 155 160Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala165 170<210>29<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和附加的二硫键的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MUTAGEN<222>(124)..(124)<223>Ala至Cys突变<220>
<221>DISULFID<222>(67)..(124)<223>
<220>
<221>诱变剂<222>(67)..(67)<223>Leu至Cys突变<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>hTNF氨基酸109-157<400>29Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Cys Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Cys Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>30<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和附加的二硫键的hTNF<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>具有一个突变的hTNF残基1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>具有一个突变的hTNF残基109-157<220>
<221>诱变剂<222>(96)..(96)<223>Ala至Cys突变<220>
<221>诱变剂<222>(131)..(131)<223>Ile至Cys突变<220>
<221>DISULFID<222>(96)..(131)<223>
<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)
<223>PADRE<400>30Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Cys85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Cys Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>31<211>162<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE的hTNF平头<220>
<221>诱变剂<222>(101)..(113)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(100)<223>hTNF氨基酸9-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(114)..(160)<223>hTNF氨基酸109-155
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(114)..(162)<223>hTNF氨基酸109-157<400>31Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly1 5 10 15Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly20 25 30Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr35 40 45Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr50 55 60His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln65 70 75 80Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu85 90 95Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala100 105 110Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val115 120 125Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro130 135 140Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile145 150 155 160Ala Leu<210>32<211>169<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(18)..(30)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(18)<223>hTNF氨基酸1-18<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(31)..(169)
<223>hTNF氨基酸19-157<400>32Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asn Pro20 25 30Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu35 40 45Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser50 55 60Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly65 70 75 80Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala85 90 95Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro100 105 110Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu115 120 125Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu130 135 140Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly145 150 155 160Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>33<211>165<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(18)..(30)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(18)<223>hTNF氨基酸1-18<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(30)..(165)<223>hTNF氨基酸22-157
<400>33Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Glu Gly20 25 30Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly35 40 45Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr50 55 60Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr65 70 75 80His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln85 90 95Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu100 105 110Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu115 120 125Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile130 135 140Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe145 150 155 160Gly Ile Ile Ala Leu165<210>34<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有添加的人工杆区和插入的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(2)..(14)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(15)..(170)<223>hTNF氨基酸2-157<400>34Met Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg Ser1 5 10 15Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn20 25 30
Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala35 40 45Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro50 55 60Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln65 70 75 80Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile85 90 95Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser100 105 110Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>35<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和单一稳定突变的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>具有一个突变的hTNF氨基酸109-157<220>
<221>诱变剂<222>(170)..(170)<223>Leu至Phe突变<400>35Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15
Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe165 170<210>36<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和一个单一突变的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>具有一个单一突变的hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(170)<223>hTNF氨基酸109-157<220>
<221>MUTAGEN<222>(49)..(49)<223>Val至Phe突变<400>36Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Phe Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr115 120 125Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg130 135 140Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser145 150 155 160Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>37<211>174<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的甘氨酸连接的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(111)..(123)<223>PADRE<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(110)<223>二甘氨酸接头<220>
<221>诱变剂<222>(124)..(125)<223>二甘氨酸接头<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(126)..(174)<223>hTNF氨基酸109-157<400>37Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Gly Gly Ala Lys100 105 110Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Glu Ala115 120 125Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu130 135 140Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp145 150 155 160Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>38<211>167<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(84)..(96)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(84)<223>hTNF氨基酸1-84<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(97)..(167)
<223>hTNF氨基酸87-157<400>38Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala85 90 95Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln100 105 110Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile115 120 125Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala130 135 140Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val145 150 155 160Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165<210>39<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(133)..(147)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(132)<223>hTNF氨基酸1-132<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(148)..(157)<223>hTNF氨基酸148-157
<400>39Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>40<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(136)..(148)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(135)<223>hTNF氨基酸1-135<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(149)..(160)<223>hTNF氨基酸146-157<400>40Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg
20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu130 135 140Lys Ala Ala Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155 160<210>41<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(64)..(76)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(63)<223>hTNF氨基酸1-63<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(77)..(157)<223>hTNF氨基酸77-157<400>41Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45
Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Ala50 55 60Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>42<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(72)..(84)<223>
<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(71)<223>hTNF氨基酸1-71<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(85)..(157)<223>hTNF氨基酸85-157<400>42Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu65 70 75 80
Lys Ala Ala Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys115 120 125Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>43<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有内替代的PADRE的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(127)..(139)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(126)<223>hTNF氨基酸1-126<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(140)..(157)<223>hTNF氨基酸140-157<400>43Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys100 105 110
Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Ala Lys115 120 125Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Leu Asp Phe130 135 140Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu145 150 155<210>44<211>176<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的肽和6个氨基酸重复的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(176)<223>hTNF氨基酸103-157<400>44Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala115 120 125Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln130 135 140
Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr145 150 155 160Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170 175<210>45<211>174<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的PADRE和4个氨基酸重复的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(109)..(121)<223>PADRE<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(1)..(108)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(122)..(174)<223>hTNF氨基酸105-157<400>45Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val1 5 10 15Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg20 25 30Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu35 40 45Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe50 55 60Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile65 70 75 80Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala85 90 95Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Lys Phe Val100 105 110Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala115 120 125Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu130 135 140Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp
145 150 155 160Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>46<211>194<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的破伤风类毒素P2和P30表位的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(110)..(124)<223>破伤风类毒素P2表位(SEQ ID NO2)<220>
<221>诱变剂<222>(125)..(145)<223>破伤风类毒素P30表位(SEQ ID NO3)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(109)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(146)..(194)<223>hTNF氨基酸109-157<400>46Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Gln Tyr Ile100 105 110Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe115 120 125Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu130 135 140
Glu Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val145 150 155 160Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro165 170 175Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile180 185 190Ala Leu<210>47<211>194<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>具有插入的破伤风类毒素P2和P30表位的hTNF<220>
<221>诱变剂<222>(110)..(130)<223>破伤风类毒素P30表位<220>
<221>诱变剂<222>(131)..(145)<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(2)..(109)<223>hTNF氨基酸1-108<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(146)..(194)<223>hTNF氨基酸109-157<400>47Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95
Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Phe Asn Asn100 105 110Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His115 120 125Leu Glu Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu130 135 140Leu Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val145 150 155 160Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro165 170 175Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile180 185 190Ala Leu<210>48<211>1545<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由甘氨酸接头和破伤风类毒素P2和P30连接的3hTNF序列<220>
<221>misc_feature<222>(475)..(483)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(1072)..(1542)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(529)..(999)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(1000)..(1008)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(1009)..(1071)<223>破伤风类毒素P30表位<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1545)<223>
<220>
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<220>
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<223>由三甘氨酸接头和破伤风类毒素P2和P30表位连接的3hTNF单体<400>51Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val
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<221>misc_feature<222>(1489)..(1551)<223>破伤风类毒素P30表位
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aaa ggt gac cgg ctt tcc gct gaa att aat cgg cca gat tat ctt gac 912Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300ttt gct gaa tcc ggt caa gtc tat ttt ggt att att gct ctg ggc ggt 960Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320ggg cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg1008Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu325 330 335gtt cgt tct tct tct cgt acg ccg tct gat aag ccg gtt gcg cac gtt1056Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val340 345 350gtt gcg aac ccg cag gcg gag ggg caa ttg cag tgg ttg aat cgt cgt1104Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg355 360 365gcg aac gcg ttg ttg gcg aat ggg gtt gaa ttg cgt gat aac caa ttg1152Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu370 375 380gtt gtt ccg tct gag ggg ttg tac ttg ata tat tct cag gtt ttg ttc1200Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe385 390 395 400aaa ggg caa ggg tgc ccg tct acg cat gtt ttg ttg acg cac acg ata1248Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile405 410 415tct cgt ata gcg gtt tct tac cag acg aag gtt aat ttg ttg tct gcg1296Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala420 425 430ata aaa tct ccg tgt caa cgt gaa acg ccg gaa ggg gcg gag gcg aag1344Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys435 440 445ccg tgg tat gaa ccg ata tac ttg ggg ggg gtt ttt cag ttg gaa aaa1392Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys450 455 460ggg gat cgt ttg tct gcg gag ata aac cgt ccg gac tat ttg gat ttc1440Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe465 470 475 480gcg gaa tct ggg caa gtt tac ttt ggg ata ata gcg ctg ggt ggc gga1488Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly485 490 495ttc aac aac ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc1536Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser500 505 510gct tcc cac ctg gaa taa1554Ala Ser His Leu Glu515<210>53<211>517<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由三甘氨酸接头连接并具有引入的P2和P30表位的3hTNF单体<400>53Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15
Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320
Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu325 330 335Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val340 345 350Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg355 360 365Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu370 375 380Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe385 390 395 400Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile405 410 415Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala420 425 430Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys435 440 445Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys450 455 460Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe465 470 475 480Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly Gly485 490 495Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser500 505 510Ala Ser His Leu Glu515<210>54<211>1485<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由三甘氨酸接头连接并在C-末端添加PADRE的3hTNF<220>
<221>CDS<222>(1)..(1485)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(484)..(954)
<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(955)..(963)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(964)..(1034)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(1035)..(1043)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(1044)..(1482)<223>PADRE<220>
<221>misc_feature<222>(475)..(483)<223>三甘氨酸接头<400>54atg gtg cgc agc agc agc cgc acc ccc agc gac aag ccc gtg gcc cac 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15gtg gtg gcc aac ccc cag gcc gag ggc caa ctg cag tgg ctg aac cgc 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcc aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtg gag ctg cgc gac aac cag144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45ctg gtg gtg ccc agc gag ggc ctg tac ctg atc tac agc cag gtg ctg192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttc aag ggc cag ggc tgc ccc agc acc cac gtg ctg ctg acc cac acc240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80atc agc cgc atc gcc gtg agc tac cag acc aag gtg aac ctg ctg agc288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcc atc aag agc ccc tgc cag cgc gag acc ccc gag ggc gcc gag gcc336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctc ggc ggc gtg ttc cag ctg gag384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aag ggc gac cgc ctg agc gcc gag atc aac cgc ccc gac tac ctg gac432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gcc gag agc ggc cag gtg tac ttc ggc atc atc gcc ctg ggt ggc480Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160gga gtc cgg tcc tcc tcc cgg aca cca tcc gac aaa cca gtc gct cat528
Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175gtc gtc gct aat cca caa gct gaa ggt caa ctt caa tgg ctt aat cgg576Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190cgg gct aat gct ctt ctt gct aat ggt gtc gaa ctt cgg gac aat caa624Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205ctt gtc gtc cca tcc gaa ggt ctt tat ctt att tat tcc caa gtc ctt672Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220ttt aaa ggt caa ggt tgt cca tcc aca cat gtc ctt ctt aca cat aca720Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240att tcc cgg att gct gtc tcc tat caa aca aaa gtc aat ctt ctt tcc768Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255gct att aaa tcc cca tgt caa cgg gaa aca cca gaa ggt gct gaa gct816Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270aaa cct tgg tat gaa cca att tat ctt ggt ggt gtc ttt caa ctt gaa864Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285aaa ggt gac cgg ctt tcc gct gaa att aat cgg cca gat tat ctt gac912Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300ttt gct gaa tcc ggt caa gtc tat ttt ggt att att gct ctg ggc ggt960Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320ggg gtt cgt tct tct tct cgt acg ccg tct gat aag ccg gtt gcg cac 1008Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335gtt gtt gcg aac ccg cag gcg gag ggg caa ttg cag tgg ttg aat cgt 1056Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350cgt gcg aac gcg ttg ttg gcg aat ggg gtt gaa ttg cgt gat aac caa 1104Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365ttg gtt gtt ccg tct gag ggg ttg tac ttg ata tat tct cag gtt ttg 1152Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380ttc aaa ggg caa ggg tgc ccg tct acg cat gtt ttg ttg acg cac acg 1200Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400ata tct cgt ata gcg gtt tct tac cag acg aag gtt aat ttg ttg tct 1248Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415gcg ata aaa tct ccg tgt caa cgt gaa acg ccg gaa ggg gcg gag gcg 1296Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430aag ccg tgg tat gaa ccg ata tac ttg ggg ggg gtt ttt cag ttg gaa 1344Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445aaa ggg gat cgt ttg tct gcg gag ata aac cgt ccg gac tat ttg gat 1392Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460
ttc gcg gaa tct ggg caa gtt tac ttt ggg ata ata gcg ctg gga ggg1440Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly465 470 475 480ggt gcc aag ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct taa1485Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala485 490<210>55<211>494<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由三甘氨酸接头连接并在C-末端添加PADRE的3hTNF<400>55Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220
Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400Ile Ser Arg lle Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly465 470 475 480Gly Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala485 490<210>56<211>1476<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由三甘氨酸接头连接并在C-末端具有PADRE的3hTNF
<220>
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<220>
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100 105 110aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctc ggc ggc gtg ttc cag ctg gag384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aag ggc gac cgc ctg agc gcc gag atc aac cgc ccc gac tac ctg gac432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gcc gag agc ggc cag gtg tac ttc ggc atc atc gcc ctg ggt ggc480Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160gga gtc cgg tcc tcc tcc cgg aca cca tcc gac aaa cca gtc gct cat528Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175gtc gtc gct aat cca caa gct gaa ggt caa ctt caa tgg ctt aat cgg576Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190cgg gct aat gct ctt ctt gct aat ggt gtc gaa ctt cgg gac aat caa624Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205ctt gtc gtc cca tcc gaa ggt ctt tat ctt att tat tcc caa gtc ctt672Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220ttt aaa ggt caa ggt tgt cca tcc aca cat gtc ctt ctt aca cat aca720Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240att tcc cgg att gct gtc tcc tat caa aca aaa gtc aat ctt ctt tcc768Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255gct att aaa tcc cca tgt caa cgg gaa aca cca gaa ggt gct gaa gct816Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270aaa cct tgg tat gaa cca att tat ctt ggt ggt gtc ttt caa ctt gaa864Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285aaa ggt gac cgg ctt tcc gct gaa att aat cgg cca gat tat ctt gac912Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300ttt gct gaa tcc ggt caa gtc tat ttt ggt att att gct ctg ggc ggt960Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320ggg gtt cgt tct tct tct cgt acg ccg tct gat aag ccg gtt gcg cac 1008Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335gtt gtt gcg aac ccg cag gcg gag ggg caa ttg cag tgg ttg aat cgt 1056Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350cgt gcg aac gcg ttg ttg gcg aat ggg gtt gaa ttg cgt gat aac caa 1104Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365ttg gtt gtt ccg tct gag ggg ttg tac ttg ata tat tct cag gtt ttg 1152Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380ttc aaa ggg caa ggg tgc ccg tct acg cat gtt ttg ttg acg cac acg 1200Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400ata tct cgt ata gcg gtt tct tac cag acg aag gtt aat ttg ttg tct 1248
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415gcg ata aaa tct ccg tgt caa cgt gaa acg ccg gaa ggg gcg gag gcg1296Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430aag ccg tgg tat gaa ccg ata tac ttg ggg ggg gtt ttt cag ttg gaa1344Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445aaa ggg gat cgt ttg tct gcg gag ata aac cgt ccg gac tat ttg gat1392Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460ttc gcg gaa tct ggg caa gtt tac ttt ggg ata ata gcg ctg gcc aag1440Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ala Lys465 470 475 480ttc gtg gcc gct tgg acc ctg aag gcc gca gct taa1476Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala485 490<210>57<211>491<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由三甘氨酸接头连接并在C-末端具有PADRE的3hTNF<400>57Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His
165 170 175Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His325 330 335Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg340 345 350Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln355 360 365Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu370 375 380Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr385 390 395 400Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser405 410 415Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala420 425 430Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu435 440 445Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp450 455 460
Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Ala Lys465 470 475 480Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala485 490<210>58<211>1545<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>由甘氨酸接头和引入的P2和P30连接的3hTNF<220>
<221>CDS<222>(1)..(1545)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4)..(474)<223>hTNF<220>
<221>mise_feature<222>(475)..(483)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(484)..(954)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(955)..(963)<223>三甘氨酸接头<220>
<221>misc_feature<222>(964)..(1008)<223>破伤风类毒素P2表位<220>
<221>misc_feature<222>(1009)..(1479)<223>hTNF<220>
<221>misc_feature<222>(1480)..(1542)<223>破伤风类毒素P30表位<400>58atg gtg cgc agc agc agc cgc acc ccc agc gac aag ccc gtg gcc cac 48Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15gtg gtg gcc aac ccc cag gcc gag ggc caa ctg cag tgg ctg aac cgc 96Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30cgc gcc aac gcc ctg ctg gca aac ggc gtg gag ctg cgc gac aac cag144Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45
ctg gtg gtg ccc agc gag ggc ctg tac ctg atc tac agc cag gtg ctg192Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60ttc aag ggc cag ggc tgc ccc agc acc cac gtg ctg ctg acc cac acc240Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80atc agc cgc atc gcc gtg agc tac cag acc aag gtg aac ctg ctg agc288Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95gcc atc aag agc ccc tgc cag cgc gag acc ccc gag ggc gcc gag gcc336Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110aag ccc tgg tac gag ccc atc tac ctc ggc ggc gtg ttc cag ctg gag384Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125aag ggc gac cgc ctg agc gcc gag atc aac cgc ccc gac tac ctg gac432Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140ttc gcc gag agc ggc cag gtg tac ttc ggc atc atc gcc ctg ggt ggc480Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160gga gtc cgg tcc tcc tcc cgg aca cca tcc gac aaa cca gtc gct cat528Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175gtc gtc gct aat cca caa gct gaa ggt caa ctt caa tgg ctt aat cgg576Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190cgg gct aat gct ctt ctt gct aat ggt gtc gaa ctt cgg gac aat caa624Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205ctt gtc gtc cca tcc gaa ggt ctt tat ctt att tat tcc caa gtc ctt672Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220ttt aaa ggt caa ggt tgt cca tcc aca cat gtc ctt ctt aca cat aca720Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240att tcc cgg att gct gtc tcc tat caa aca aaa gtc aat ctt ctt tcc768Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255gct att aaa tcc cca tgt caa cgg gaa aca cca gaa ggt gct gaa gct816Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270aaa cct tgg tat gaa cca att tat ctt ggt ggt gtc ttt caa ctt gaa864Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285aaa ggt gac cgg ctt tcc gct gaa att aat cgg cca gat tat ctt gac912Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300ttt gct gaa tcc ggt caa gtc tat ttt ggt att att gct ctg ggc ggt960Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320ggg cag tac atc aaa gct aac tcc aaa ttc atc ggc atc acc gaa ctg 1008Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu325 330 335gtt cgt tct tct tct cgt acg ccg tct gat aag ccg gtt gcg cac gtt 1056Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val
340 345 350gtt gcg aac ccg cag gcg gag ggg caa ttg cag tgg ttg aat cgt cgt1104Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg355 360 365gcg aac gcg ttg ttg gcg aat ggg gtt gaa ttg cgt gat aac caa ttg1152Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu370 375 380gtt gtt ccg tct gag ggg ttg tac ttg ata tat tct cag gtt ttg ttc1200Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe385 390 395 400aaa ggg caa ggg tgc ccg tct acg cat gtt ttg ttg acg cac acg ata1248Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile405 410 415tct cgt ata gcg gtt tct tac cag acg aag gtt aat ttg ttg tct gcg1296Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala420 425 430ata aaa tct ccg tgt caa cgt gaa acg ccg gaa ggg gcg gag gcg aag1344Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys435 440 445ccg tgg tat gaa ccg ata tac ttg ggg ggg gtt ttt cag ttg gaa aaa1392Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys450 455 460ggg gat cgt ttg tct gcg gag ata aac cgt ccg gac tat ttg gat ttc1440Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe465 470 475 480gcg gaa tct ggg caa gtt tac ttt ggg ata ata gcg ctg ttc aac aac1488Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Phe Asn Asn485 490 495ttc acc gtt tcc ttc tgg ctg cgc gtt cca aaa gtt tcc gct tcc cac1536Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His500 505 510ctg gaa taa1545Leu Glu<210>59<211>514<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>由甘氨酸接头和引入的P2和P30连接的3hTNF<400>59Met Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His1 5 10 15Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg20 25 30Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln35 40 45Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu50 55 60Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr65 70 75 80
Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser85 90 95Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala100 105 110Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu115 120 125Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp130 135 140Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly145 150 155 160Gly Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His165 170 175Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg180 185 190Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln195 200 205Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu210 215 220Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr225 230 235 240Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser245 250 255Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala260 265 270Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu275 280 285Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp290 295 300Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Gly305 310 315 320Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu325 330 335Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ale His Val340 345 350Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg355 360 365Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu
370 375 380Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe385 390 395 400Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile405 410 415Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala420 425 430Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys435 440 445Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys450 455 460Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe465 470 475 480Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Phe Asn Asn485 490 495Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His500 505 510Leu Glu<210>60<211>2773<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于昆虫细胞的p2ZOp2F表达载体<220>
<221>misc_recomb<222>(561)..(566)<223>HindIII位点<220>
<221>misc_recomb<222>(573)..(578)<223>AvaI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(586)..(591)<223>EcoRI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(593)..(598)<223>BamHI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(625)..(630)<223>ClaI位点
<220>
<221>misc_recomb<222>(629)..(634)<223>ClaI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(1156)..(1161)<223>ApaLI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(2128)..(2133)<223>PstI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(2204)..(2209)<223>NcoI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(2284)..(2289)<223>AvaI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(2294)..(2299)<223>AvaI，SmaI，和XmaI位点<220>
<221>misc_recomb<222>(2551)..(2556)<223>ApaLI位点<400>60ggatcatgat gataaacaat gtatggtgct aatgttgctt caacaacaat tctgttgaac 60tgtgttttca tgtttgccaa caagcacctt tatactcggt ggcctcccca ccaccaactt120ttttgcactg caaaaaaaca cgcttttgca cgcgggccca tacatagtac aaactctacg180tttcgtagac tattttacat aaatagtcta caccgttgta tacgctccaa atacactacc240acacattgaa cctttttgca gtgcaaaaaa gtacgtgtcg gcagtcacgt aggccggcct300tatcgggtcg cgtcctgtca cgtacgaatc acattatcgg accggacgag tgttgtctta360tcgtgacagg acgccagctt cctgtgttgc taaccgcagc cggacgcaac tccttatcgg420aacaggacgc gcctccatat cagccgcgcg ttatctcatg cgcgtgaccg gacacgaggc480gcccgtcccg cttatcgcgc ctataaatac agcccgcaac gatctggtaa acacagttga540acagcatctg ttcgaattta aagcttggta ccctcgagct cagctgaatt ctggatcctc600tagaccggtc atatgcggcc gcggatcgat cgatatctga ctaaatctta gtttgtattg660tcatgtttta atacaatatg ttatgtttaa atatgttttt aataaatttt ataaaataat720ttcaactttt attgtaacaa cattgtccat ttacacactc ctttcaagcg cgtgggactc780gatgctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag840aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg900
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 960tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg1020cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga1080agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc1140tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt1200aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact1260ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg1320cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt1380accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt1440ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct1500ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg1560gtcatgatga taaacaatgt atggtgctaa tgttgcttca acaacaattc tgttgaactg1620tgttttcatg tttgccaaca agcaccttta tactcggtgg cctccccacc accaactttt1680ttgcactgca aaaaaacacg cttttgcacg cgggcccata catagtacaa actctacgtt1740tcgtagacta ttttacataa atagtctaca ccgttgtata cgctccaaat acactaccac1800acattgaacc tttttgcagt gcaaaaaagt acgtgtcggc agtcacgtag gccggcctta1860tcgggtcgcg tcctgtcacg tacgaatcac attatcggac cggacgagtg ttgtcttatc1920gtgacaggac gccagcttcc tgtgttgcta accgcagccg gacgcaactc cttatcggaa1980caggacgcgc ctccatatca gccgcgcgtt atctcatgcg cgtgaccgga cacgaggcgc2040ccgtcccgct tatcgcgcct ataaatacag cccgcaacga tctggtaaac acagttgaac2100agcatctgtt cgaattaatt cggatctctg cagcacgtgt tgacaattaa tcatcggcat2160agtatatcgg catagtataa tacgactcac tataggaggg ccaccatggc caagttgacc2220agtgccgttc cggtgctcac cgcgcgcgac gtcgccggag cggtcgagtt ctggaccgac2280cggctcgggt tctcccggga cttcgtggag gacgacttcg ccggtgtggt ccgggacgac2340gtgaccctgt tcatcagcgc ggtccaggac caggtggtgc cggacaacac cctggcctgg2400gtgtgggtgc gcggcctgga cgagctgtac gccgagtggt cggaggtcgt gtccacgaac2460ttccgggacg cctccgggcc ggccatgacc gagatcggcg agcagccgtg ggggcgggag2520ttcgccctgc gcgacccggc cggcaactgc gtgcacttcg tggccgagga gcaggactga2580ccgacgccga ccaacaccgc cggtccgacg gcggcccacg ggtcccaggg gggtcgacct2640cgaaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc2700acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta2760tcttatcatg tct 277权利要求
1.一种多聚蛋白的免疫原性类似物，所述多聚蛋白由至少2个不是通过肽键连接的单体单元组成，其中所述类似物d)包括所述多聚蛋白的至少2个单体单元的基本片段，其中所述基本片段通过肽接头经肽键连接，e)包括至少一个对于所述多聚蛋白异源的MHC II类结合氨基酸序列，和f)可以作为来自细胞的单一表达产物生产，所述细胞含有编码所述类似物的表达载体。
2.按照权利要求1的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白是同聚蛋白。
3.按照权利要求1的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白是杂聚蛋白。
4.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中每个基本片段显示当为所述多聚蛋白的一部分时在对应的单体中发现的B-细胞表位的基本部分。
5.按照权利要求4的免疫原性类似物，其中每个基本片段显示当为所述多聚蛋白的一部分时在对应的单体中发现的基本上所有B-细胞表位。
6.按照权利要求4或5的免疫原性类似物，其中通过氨基酸插入，替代，缺失或增加修饰来源于单体单元的氨基酸序列，以便与多亚基蛋白相比降低所述类似物毒性和/或以便引入MHC II类结合氨基酸序列。
7.按照权利要求1-6中任何一项的免疫原性类似物，其中每个基本部分包含基本上完整的每个单体单元的氨基酸序列，其为连续序列或为包括插入片段的序列。
8.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白的所有单体单元的氨基酸序列在所述类似物中体现。
9.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其包括构成所述多聚蛋白的单体的完整氨基酸序列，其为连续序列或为包括插入片段的序列。
10.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中所述肽接头包括或有助于至少一个对于所述多亚基蛋白异源的MHC II类结合氨基酸序列在所述类似物中的存在。
11.按照权利要求1-9中任何一项的免疫原性类似物，其中所述肽接头无关于或非有助于来自衍生所述多亚基蛋白的动物物种中的MHC II类结合氨基酸序列的存在。
12.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中所述MHCII类结合氨基酸序列结合大部分来自已经衍生所述多亚基蛋白的动物物种的MHC II类分子。
13.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中至少一种MHC II类结合氨基酸序列选自天然T-细胞表位和人工MHC-II结合肽序列。
14.按照权利要求12的免疫原性类似物，其中所述天然T-细胞表位选自破伤风类毒素表位如P2或P30，白喉类毒素表位，流感病毒血凝素表位，和恶性疟原虫CS表位。
15.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中完整多聚蛋白的3-维结构基本上保存。
16.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白选自白细胞介素5(IL5)和肿瘤坏死因子α(INFα)组成的组。
17.按照权利要求16的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白是IL5并且其中所述类似物选自由下述物质组成的组-两个完整的通过肽接头连接的IL5单体，所述肽接头包括至少一个MHC II类结合氨基酸序列，-两个完整的通过惰性肽接头连接的IL5单体，其中至少一个单体包括异源MHC II类结合氨基酸序列。
18.按照权利要求17的免疫原性类似物，其具有线性结构IL-Lm-IL或ILm-Li-ILn或IL-Li-ILm或IL-Li-ILm或ILm-Lm-ILn，其中“IL”是成熟的单体IL5的完整氨基酸序列，“ILm”和“ILn”，其可以相同或不相同，表示包括异源MHC II类结合氨基酸序列的、成熟单体IL5的实质上完整的氨基酸序列，“Lm”是类似物中的包括或有助于至少一个MHC II类结合氨基酸序列的肽接头，“Li”是在类似物中不包括或有助于任何MHC II类结合氨基酸序列的惰性肽接头。
19.按照权利要求18的免疫原性类似物，其中Lm，ILm和ILn包含破伤风类毒素的P2和/或P30表位或包含PADRE，并且Li是二甘氨酸接头。
20.按照权利要求19的免疫原性类似物，其具有在SEQ ID No9，11，13和15中任何一个中阐明的成熟氨基酸序列。
21.按照权利要求16的免疫原性类似物，其中所述多聚蛋白是TNFα并且其中所述类似物选自由下述物质组成的组-通过肽接头首尾连接的两个或三个完整的TNFα单体，其中至少一个肽接头包括至少一个MHC II类结合氨基酸序列，-通过惰性肽接头首尾连接的两个或三个完整的TNFα单体，其中至少一个单体包括至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列或者其中至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列任选地通过惰性接头融合至N-或C-末端单体。
22.一种人TNFα的免疫原性类似物，其中所述类似物包括至少一种外源MHC II类结合氨基酸序列并且另外具有以下的特性-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中已经插入或内替换至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列于柔性环3中，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中已经引入至少一个稳定TNFα单体3D结构的二硫键，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中氨基末端的氨基酸1，2，3，4，5，6，7，8和9中任何一个已经被缺失，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中在内含子位置中插入或内替换至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列于环1中，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列引入作为人TNFα的N-末端中人工杆区域的一部分，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中引入至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列以便通过增加三聚体相互作用界面的疏水性而稳定单体结构，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中将侧邻甘氨酸残基的至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于TNFα氨基酸序列中，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于D-E环中，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中将至少一个外源MHC II类结合氨基酸序列插入或内替代于两个相同的人TNFα子序列之间，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中已经将人TNFα中的至少一个盐桥加强或用二硫键替代，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中通过引入模拟鼠TNFα晶体结构的突变增强可溶性和/或对蛋白水解的稳定性，和/或-按照权利要求16的人TNFα单体或类似物，其中通过引入至少一个点突变减小或消除潜在的毒性。
23.按照权利要求25或26的免疫原性类似物，其中所述类似物的氨基酸序列选自SEQ ID NO18，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，49，51，53，55，57，和59，以及仅包括其保守氨基酸改变的任何氨基酸序列组成的组。
24.按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，其可以表达为来自细菌细胞的可溶性蛋白质。
25.一种核酸片段，其编码按照前述权利要求中任何一项的免疫原性类似物，或与其互补的核酸片段。
26.按照权利要求25的核酸片段，其为DNA片段。
27.按照权利要求25的核酸片段，其包含选自SEQ ID NO17，48，50，52，54，56，和58或与其互补的核酸序列组成的组的核酸序列。
28.一种在自体宿主中下调多聚蛋白的方法，该方法包含向动物免疫系统实施呈递免疫原性有效量的至少一种按照权利要求1-26中任何一项的免疫原性类似物。
29.按照权利要求28的方法，其中所述自体宿主是哺乳动物，如人。
30.按照权利要求28或29的方法，其中通过将任选地与佐剂混合的按照权利要求1-26中任何一项的免疫原性类似物施用于所述自体宿主来实施呈递。
31.按照权利要求30的方法，其中所述佐剂选自免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂如毒素，细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；微团形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；γ-菊粉；和包封佐剂组成的组。
32.按照权利要求28-31中任何一项的方法，其中将免疫原性有效量的类似物通过选自以下各项的途径施用于动物肠胃外途径如皮内，皮下，和肌内途径；腹膜途径；口服途径；颊含途径；舌下途径；硬膜外途径；脊髓途径；肛门途径；和颅内途径。
33.按照权利要求32的方法，其中所述有效量为0.5μg-2000μg。
34.按照权利要求32或33的方法，其包括每年至少一次给药，如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次，和至少12次给药。
35.按照权利要求28的方法，其中通过将编码所述类似物的核酸引入动物的细胞和由此获得引入核酸的细胞的体内表达，将所述类似物呈递给免疫系统。
36.按照权利要求35的方法，其中引入的所述核酸选自以下形式裸DNA，用带电荷或不带电荷的脂质配制的DNA，配制在脂质体中的DNA，包括在病毒载体中的DNA，用促进转染的蛋白质或多肽配制的DNA，用靶向蛋白质或多肽配制的DNA，用钙沉淀剂配制的DNA，与惰性载体分子偶联的DNA，包封在壳多糖或脱乙酰壳多糖中的DNA，和用佐剂如在权利要求30中定义的佐剂配制的DNA。
37.按照权利要求35或36的方法，其中动脉内，静脉内或通过在权利要求31中定义的途径施用所述核酸。
38.按照权利要求35-37中任何一项的方法，其包括每年至少一次给药所述核酸，如每年至少2次，至少3次，至少4次，至少6次，和至少12次给药。
39.按照权利要求28的方法，其中通过施用非病原性的微生物或病毒实施对免疫系统的呈递，所述微生物或病毒携带编码和表达所述类似物的核酸片段。
40.按照权利要求39的方法，其中所述病毒是非毒性痘病毒如牛痘病毒。
41.按照权利要求40的方法，其中所述微生物是细菌。
42.按照权利要求39-41中任何一项的方法，其中将所述非病原性微生物或病毒向动物施用单独一次。
43.一种组合物，其用于诱导针对多亚基蛋白的抗体的生产，该组合物包含-按照权利要求1-26中任何一项的免疫原性类似物，和-药物和免疫可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
44.一种组合物，其用于诱导针对多亚基蛋白的抗体的生产，该组合物包含-按照权利要求27的核酸片段，和-药物和免疫可接受的载体和/或赋形剂和/或佐剂。
45.按照权利要求43或43的组合物，其中如权利要求30或31中任何一项所定义配制所述类似物。
46.一种用于制备按照权利要求1-26中任何一项的类似物的方法，该方法包含在促进权利要求27的核酸片段表达的条件下培养用按照权利要求27的核酸片段转化的宿主细胞，和随后从培养物中回收作为蛋白质表达产物的类似物。
47.按照权利要求46的方法，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
48.按照权利要求47的方法，其中所述类似物是可溶性的表达产物。
全文摘要
本发明涉及多亚基蛋白的新免疫原性变体如白细胞介素5(IL5)和肿瘤坏死因子α(TNF，TNFα)的免疫原性变体。除了在自体宿主中是免疫原性以外，变体还高度类似于衍生它们的蛋白质的天然3D结构。某些变体是多聚体的单体模拟物，其中肽接头(含有惰性的或T辅助细胞表位)确保促进正确折叠的单体单元的空间组织。变体的一种亚型是单体TNFα变体，其显示装配成与天然蛋白质具有高度结构相似性的多聚体的优越能力。还公开处理和生产变体的方法以及DNA片段，载体和宿主细胞。
文档编号A61K35/76GK1615316SQ02827197
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月15日 优先权日2001年11月16日
发明者斯腾·克雷斯内尔, 芬恩·斯陶舒姆·尼尔森, 托马斯·布拉特, 比耶恩·沃尔博格, 索尔恩·穆里特森 申请人:法麦克萨有限公司