肿瘤特异性单克隆抗体的制作方法

专利名称：肿瘤特异性单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及癌症，并且更具体而言涉及用于治疗和诊断癌症的人单克隆抗体。
背景技术：
在美国癌症是导致死亡的主要原因之一。每年超过五十万的美国人死于癌症，并且有超过一百万人新近诊断出患有此疾病。在癌症中，赘生性细胞从其正常生长调节机制中逃离出来并以不受控制的方式增生，导致发展成恶性肿瘤。如果对原发肿瘤的治疗不彻底在该疾病的实质发展前或还没开始，那么肿瘤细胞会转移到第二位点上。因而早期诊断和有效治疗恶性肿瘤因而对存活十分必要。
治疗癌症的现有方法包括外科手术、放射疗法和化学疗法。这些治疗法中的每一个的主要问题是它们对癌细胞缺乏特异性。例如，外科手术移除肿瘤往往不彻底。即使几个残留的赘生性细胞也能致命，因为它们能快速增生并转移到其他位置。放射疗法和化学疗法也有严重的局限性。这些疗法瞄准身体中所有的生长细胞，包括正常的细胞和赘生性细胞。由于这些疗法对正常组织的毒性，可安全使用的放射量或化疗剂量往往不足以杀死所有赘生性细胞。此外，它们对正常组织的毒性由包括恶心和脱发的令人不快的副作用表现出来，这些副作用严重降低了接受这些治疗的癌症患者的生活质量。显然需要更具选择性和有效性的治疗癌症的方式。
单克隆抗体是特异性识别并结合到其相应抗原的区域或表位免疫球蛋白的同种制备。赘生性细胞选择性地表达不呈现于正常细胞中的抗原。因此，可产生出针对肿瘤特异性抗原的单克隆抗体。此等肿瘤特异性抗原可被连接到杀死或阻止赘生性细胞的生长的治疗部分上。另外，所述肿瘤特异性抗原可被连接到允许赘生性细胞成像的诊断部分上。因此，针对由肿瘤细胞(与正常细胞相比)选择性表达的抗原的单克隆抗体可有利的用于早期检测和有效治疗癌症。
对癌症最流行的免疫治疗策略由于其对小鼠单克隆抗体的依赖而具有有限的效用。利用杂交瘤技术可很容易并且数量上实际不受限制地来制造小鼠单克隆抗体。然而，当施加到人体时，它们可被人体免疫系统识别为异质的并且在对患病组织发挥其治疗作用前被中和。而且，鼠科免疫系统往往优先识别存在于肿瘤细胞中的正常人体抗原的免疫优势表位(immunodominant epitope)。因此，人体肿瘤特异性抗原往往不能产生治疗上有益的鼠科抗体。
人单克隆抗体能克服所有这两种局限性。最重要的是，人单克隆抗体不如鼠科抗体那样致免疫。因此，肿瘤特异性人单克隆抗体能更有效的瞄准及消除赘生性细胞。而且，人体免疫系统针对存在于正常细胞的表位而产生抗原的可能性更小，增加了产生和成功地鉴别肿瘤特异性抗原的几率。此外，人体免疫系统的组成部分不同于老鼠的组成部分，潜在地含有新颖的抗体特异性。
目前用以产生肿瘤特异性人单克隆抗体的程序一般以从荷瘤患者身上获得的淋巴细胞开始。这些程序依赖于活体内刺激和放大在肿瘤-反应性淋巴细胞。这些程序受到癌症患者的激活的B-细胞的抗原特异性的狭窄范围的严重限制。由于显然不可能在活体内以肿瘤细胞使个体免疫，而对小鼠却可以，因此还不可能很容易的产生对任何给定抗原或肿瘤细胞类型的肿瘤特异性人单克隆抗体。用来产生任何想要的特异性的肿瘤特异性抗体的程序将可能十分有利于有效的免疫疗法和免疫诊断。
因此，存在对用于癌症的治疗和诊断中的改进的肿瘤特异性人单克隆抗体的需要。本发明满足这一需要并且还提供相关的优势。

发明内容
本发明提供分离的人单克隆抗体或其功能片断，包括一个具有大体上选自由以下SEQ ID NO组成的群组的CDR的氨基酸序列的互补决定区10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中人单克隆抗体或其功能片断特异地结合到赘生性细胞或其抗原上。
本发明还提供了一种编码人单克隆抗体或其功能片断的分离的核酸，包括一个对下述CDR的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，该CDR由大体上选自由以下SEQ ID NO组成的群组的核苷酸序列进行编码9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
本发明还提供了一种用于减少赘生性细胞增生的方法。所述方法由投以有效量的本发明的人单克隆抗体或功能片断而组成。还提供了一种检测样品中的赘生性细胞的方法。所述方法由使细胞和本发明的单克隆抗体或功能片断相接触并检测人单克隆抗体或功能片断对样品的特异性结合而组成。与正常细胞相比，有单克隆抗体或功能片断的存在或增高的含量说明样品中存在赘生性细胞。


图1显示LH11238和LH13抗体对活的H3464细胞表面的结合。图1A显示利用LH11238抗体所作的荧光激活的细胞分类法(fluorescent activated cellsorting，FACS)分析。图1B显示利用LH13抗体所作的FACS分析。
图2说明LH13抗原由H3396细胞分泌。图2A显示来自H3396(实心环)细胞的条件培养基竞争LH13抗体对固定细胞单层的结合。图2B显示LH13抗原由H3396细胞分泌出来并且结合到培养皿上。
图3显示通过阴离子交换色谱法在Q琼脂糖凝胶柱上提纯LH13抗原。
图4说明LH13抗原易受到胰蛋白酶和糖苷内切酶-F/肽-N-糖苷酶(lycosidase)F治疗的影响。
图5显示以ELISA格式的重组体LH13、LH11238与变体Fab的表征。画面A显示LH13抗体(空心环)、HCDR3变体S97N(填充环)、LCDR3变体R91Y(空心方块)、及组合的突变体4H7(填充方块)各自经部分浓缩的LH13抗原滴定并以山羊抗-人K碱性磷酸酶共轭进行检测的结果。画面B显示LH11238抗体(空心环)和LCDR3突变体Q89W(空心方块)、N93C(空心三角)、N94C(填充方块)、以及P95aR(填充环)各自经H3396肿瘤细胞系的固定单层滴定并以山羊抗-人K碱性磷酸酶进行检测的结果。
具体实施例方式
本发明针对肿瘤特异性人单克隆抗体及其功能片断。本发明之人单克隆抗体及其功能片断特异性结合到与正常细胞相比较而言的赘生性细胞上，而且可用于选择性地瞄准肿瘤。这些抗体来源于人体，而且在投药到人体目标时不可能产生免疫响应。因此，可以使它们共轭于细胞毒素剂或抑制细胞剂并且为消除肿瘤而用于选择性地瞄准癌细胞。肿瘤特异性人单克隆抗体也可被用在诊断程序中来鉴别赘生性细胞。及早检测到癌症大大提高了个体幸免于该疾病的机会。
在一个实施例中，本发明提供了用来生成产生肿瘤特异性人单克隆抗体的杂交瘤的方法。在混合淋巴细胞反应中，用肿瘤细胞或肿瘤细胞膜在活体外使正常人体脾细胞免疫。接着使所述免疫脾细胞无限增生化来产生提供无限供应的肿瘤特异性人单克隆抗体的杂交瘤。使用正常细胞作为杂交瘤来源极大放大了对治疗癌症所能获得的不同肿瘤特异性抗体的组成部分。另外，在本发明的方法中用作抗原的细胞或细胞膜类型可视需要进行变动以便有效生产用于不同人体治疗和诊断应用的抗体。
在另一个实施例中，本发明针对编码人体肿瘤特异性单克隆抗体的核酸。这些核酸可用来表达经编码的人体抗体或其片断。另外，编码核酸可被重组工程来产生对肿瘤细胞展示出更高的亲合性或更高的选择性的经改质的人体抗体或功能片断，或增大经编码的抗体的其他功能特征。所述经改质的抗体可以被额外构造以含有其他治疗上有利的改质，例如与细胞毒素剂的关联性得到提升或免疫系统的刺激得到增强。
在进一步的实施例中，本发明针对由肿瘤特异性人单克隆抗体识别的抗原。该抗原可以用在癌症诊断程序中并生长出用于癌症治疗的特异性细胞毒素剂。肿瘤特异性抗原也可用作疫苗并投药到具有患癌症的个体上以发展出针对赘生性细胞的有效免疫响应。编码肿瘤特异性抗原的核酸可用作诊断程序中的探针，或由重组法加以改质来发展出抗原的特定抑制剂。
免疫球蛋白或抗体分子的基本结构由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，它们以非共价相关联而且也可以通过二硫键来连接。每一条重链和轻链含有约110个氨基酸的胺基-末端可变区和在链的剩余部分中的恒定序列。可变区包括几个高变区、或形成抗体分子的抗原-结合位点并决定其特异性的互补-决定区(CDR)。在重链和轻链的CDR任一侧为骨架区，即锚定和定向CDR的相对保守的氨基酸序列。恒定区由五条重链序列(μ、γ、δ、α、或ε)中的一条和两条轻链中的一条(κ或λ)组成。重链恒定区序列决定该抗体的同型和该分子的效应物功能。
本文所用术语“人单克隆抗体”用来指单克隆抗体，其包含的重链和轻链CDR氨基酸序列与特定人体免疫球蛋白中所发现的重链和轻链CDR氨基酸序列大体相同。与重链或轻链CDR大致相同的氨基酸序列与参考序列相比展示出相当量或程度的序列同一性并且有利的促进被具有参考序列的抗体所特异性结合的抗原进行特异性结合。所述同一性在描绘特定人单克隆抗体的氨基酸序列时为确定已知的或可识别的。只要保留了结合特定抗原的能力，大体相同的重链和轻链CDR氨基酸序列可以进行(例如)氨基酸的微小改质或保守取代。术语“人单克隆抗体”用来包括用淋巴细胞或杂交瘤细胞(例如)通过重组法来产生的具有大体的人CDR氨基酸序列的单克隆抗体。
本文所用术语“大体上相同”当用于指氨基酸序列时用来指一个具有与参考氨基酸序列充足的结构同一性或相似性以被所属领域的技术人员认为具有参考氨基酸序列所编码的多肽或其片断的特定功能的氨基酸序列。该术语可以包括初级结构的同一性或相似性，其在所属领域中也分别称为序列同一性或序列相似性。与抗体或其功能片断之参考序列大体上相同的氨基酸序列可以具有与参考序列至少70％相同的初级结构，其包括(例如)与参考序列至少80％、至少83％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少98％相同的序列。所述术语可以包括三级结构同一性或相似性，其中把三级结构理解为指功能活性抗体或其片断的三维结构。所述术语中包括的特定功能可为特定于通过参考氨基酸序列来编码的多肽或其片断的任何生物活性，其包括(例如)对赘生性细胞或其抗原的特异性结合。
与参考序列大体上相同的核酸序列包括对相同的多肽氨基酸序列进行编码的核酸序列。在所属领域中一般把彼此互不相同但编码相同的氨基酸序列的核酸序列称为由于遗传密码退化而具有不活动的差异性(silent difference)。所细胞群。在随后的传代中，通常为7天的间隔，hMSC生长为紧密堆积的纺锤状细胞轮。在5周末(第4代)，hMSC产生5.4-6.6×107的细胞(表2)。
表2 hMSC生长动力学

体外大鼠脾细胞和hMSC之间的混合淋巴细胞反应以及细胞毒T淋巴细胞应答与未刺激的脾细胞相比，hMSC显著增强健康大鼠脾细胞的增殖(刺激指数＝18.8)(图2A)。注射了hMSC的大鼠的脾细胞增殖在体外由hMSC再刺激后也增加(刺激指数＝15.6)；不过，这些细胞中的增殖应答与健康大鼠脾细胞的没有显著差异。这些数据显示虽然hMSC能够诱导大鼠脾淋巴细胞的初级增殖应答，向大鼠给药hMSC未能在体内致敏淋巴细胞进行体外的次级增殖应答。
图8A显示了大鼠脾细胞和人类骨髓基质细胞(hMSC)之间的混合淋巴细胞反应2×105健康大鼠脾细胞(N-Spl)或者2周前用hMSC静脉内处理的大鼠脾细胞(T-Spl)以10∶1的应答细胞∶刺激细胞比和或不和辐射的(20Gy)hMSC一式三份培养96小时。培养物由3H-脱氧胸苷(0.25μCi/孔)脉冲16小时，然后由自动细胞收集器收集。并通过液闪测量3H-脱氧胸苷的掺入。在由hMSC处理和未处理的大鼠获得的脾细胞之间未检测到差异。SI＝刺激指数。(B)大鼠脾细胞(1×107)域。所述术语描述于(例如)Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)；Molec.Biology andBiotechnologyA Comprehensive Desk Reference(Myers，R.A.(ed.)，New YorkVCH Publisher，Inc.)；Huston等人，Cell Biophysics.22189-224(1993)；Plückthun和Skerra，Meth.Enzymol..178497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)，它们以引用的方式并入本文中。术语功能片断用以包括(例如)通过蛋白酶消化或减少人单克隆抗体并通过所属领域的技术人员已知的重组DNA方法所产生的片断。
本文所用术语“VL片断”是指包括所有或部分的轻链可变区(其包括CDR)的人单克隆抗体的轻链片断。VL片断可进一步包括轻链恒定区序列。
本文所用术语“Fd片断”是指包括所有或部分的重链可变区(其包括CDR)的人单克隆抗体的重链片断。Fd片断可以进一步包括重链恒定区序列。
本文所用术语“Fv片断”是指人单克隆抗体的单价抗原-结合片断，其包括重链和轻链的所有或部分可变区，而且缺少重链和轻链的恒定区。重链和轻链的可变区包括(例如)CDR。例如，Fv片断包括重链和轻链两者的约110个氨基酸的所有或部分胺基末端可变区。
本文所用术语“Fab片断”是指大于Fv片断的人单克隆抗体的单价抗原-结合性片断。例如，Fab片断包括重链和轻链的可变区、以及所有或部分的第一恒定域。因此，Fab片断额外包括(例如)重链和轻链的约110到约220的氨基酸残基。
本文所用术语“Fab′片断”是指大于Fv片断的人单克隆抗体的单价抗原-结合片断。例如，Fab′片断包括所有轻链、重链的所有可变区、以及重链的所有或部分的第一和第二恒定域。例如，Fab′片断可以额外包括一些或所有的重链的220到330氨基酸残基。
本文所用术语“F(ab′)2片断”是指人单克隆抗体的二价抗原-结合片断。F(ab′)2片断包括(例如)两条重链和两条轻链的所有或部分可变区，而且可以进一步包括两条重链和两条轻链的所有或部分的第一恒定域。所属领域的技术人员知道人单克隆抗体片断的确切边界会有变动，只要所述片断保持功能活性。利用熟知的重组法，所属领域的技术人员能够设计核酸来表达具有用于特定用途的想要端点的功能片断。
本文所用术语“标记物”用以指可被附着于本发明的人单克隆抗体或其他分子的部分。可将部分用于(例如)治疗或诊断程序。
治疗标记物包括(例如)可被附着于本发明的分子并用来减少赘生性细胞不受控制的增生或存活能力的部分。能降低细胞增生或存活的标记物可以是(例如)细胞毒素剂或细胞抑制剂、增长因子、细胞死亡受体收缩剂或免疫调谐剂。
诊断标记物包括(例如)可通过分析方法检测的部分。分析方法包括(例如)定性和定量程序。定性分析方法包括(例如)免疫组织化学和间接免疫荧光法。定量分析方法包括(例如)免疫亲合程序，如放射免疫分析、ELISA或FACS分析。分析方法还包括活体外和活体内的成像程序。可通过分析方法检测的诊断标记物的具体实例包括酶、放射性同位素、发色团、荧光染料、化学发光标记、及生物素。
标记物可以直接附着于本发明的分子上，或附着于特异性结合本发明的分子的二级结合剂上。所述二级结合剂可以为(例如)二级抗体。二级抗体可为多克隆或单克隆的，而且来源于人类、啮齿动物或嵌合体。
本文所用术语“细胞毒素剂或细胞抑制剂”用以指减少细胞的存活能力或增生潜力的药剂。所述药剂可以附着于(例如)本发明的人单克隆抗体或其他分子上并且用来瞄准细胞或组织。被瞄准的细胞和组织可以包括(例如)赘生性细胞和肿瘤。被瞄准的细胞和组织的实例包括衍生自乳房、肺部及卵巢组织的细胞和组织。细胞毒素剂或细胞抑制剂能够以多种方式发挥作用来减少细胞的存活能力或增生能力。所述功能包括(例如)抑制DNA合成、抑制细胞分裂、诱导细胞凋亡、或诱导非凋亡性杀死细胞。细胞毒素剂和细胞抑制剂的具体实例包括美洲商陆抗病毒蛋白、相思豆毒素、蓖麻蛋白和它们的A链、亚德里亚霉素(doxorubicin)、顺铂、碘-131、钇-90、铼-188、.铋-212、红豆杉醇、5-氟尿嘧啶VP-16、博莱霉素、氨甲喋呤、去乙酰长春酰胺、阿霉素(adriamycin)、长春新碱、长春碱、BCNU、丝裂霉素及环磷酰胺以及例如TNF-α和TNF-β的某些细胞因子。细胞毒素剂或细胞抑制剂可以包括(例如)放射性核、化疗药物、蛋白质及凝集素。
本文所用术语“特异性结合”用以指人单克隆抗体或其功能片断与抗原的选择性交互作用。由于所述交互作用具有选择性，人单克隆抗体不会大体上结合、或被制成不会大体上结合到除特定抗原以外的标记上。特异性结合可以包括(例如)约105M-1或更高的相关常数(Ka)。因此，特异性结合可包括至少约1×106M-1、1×107M-1、或1×108M-1、1×109M-1、1×1010M-1、1×1011M-1或1×1012M-1的相关常数。特异性结合还可包括(例如)高活性交互作用。
本文所用术语“癌症”是指一种病理状况，其特征在于存在赘生性细胞。赘生性细胞是展示出非正常形态学或增生显型的细胞。所述细胞的特征在于(例如)不依赖于锚基的细胞生长、在减少的血清培养基中增生、并且丧失接触抑制。所述细胞还以(例如)组织的非正常更新生长(如肿瘤、促使血管新生的脉管系统)、及入侵到周围组织为特征。赘生性细胞也可以从原发肿瘤转移到人体中的其他位置。例如，乳房、肺部或卵巢细胞的肿瘤虽然仍可识别为由乳房、肺部或卵巢细胞来组成的，但会转移到其他器官上。因此，涉及乳房、肺部或卵巢时术语“肿瘤”或“癌症”用以包括这些肿瘤向身体的其它器官的转移。
本文所用术语“有效量”用来指可以减少赘生性细胞增生的本发明的分子的量。可被认为是对于一个具体应用的有效量的实际量可能取决于(例如)一些因素，如亲合性、活动性、稳定性、分子的生物利用率或选择性、附着于分子上的部分、药物载剂以及投药途径。利用所属领域的技术人员已知的方法可以决定或推断出有效量。所述方法包括(例如)用经培养的细胞或组织活体切片以及可靠的动物模型所作的活体外分析。
本文所用术语“经分离的”当用于指抗体时，是指从一种或多种化合物中分离出来，所述化合物被发现本质上具有抗体或在合成反应中用来产生抗体，包括(例如)反应物、前驱体或其它反应产物。经分离的试剂也可包括大体上纯净的试剂。该术语可以包括自然产生的分子(如生物合成反应的产物)或合成分子。
本发明提供人单克隆抗体或功能片断，其具有的至少一个CDR大体上为SEQ ID NO2或SEQ ID NO4的CDR的氨基酸序列。本发明也提供人单克隆抗体或功能片断，其具有的至少一个CDR大体上为SEQ ID NO6或SEQ IDNO8的CDR的氨基酸序列。本发明进一步提供由杂交瘤细胞系H1140、H2420及H935产生的人单克隆抗体或功能片断。也提供杂交瘤细胞系H1140、H2420及H935。
由杂交瘤细胞系LH11238、LH13、H1140、H2420及H935产生的人单克隆抗体都展示出(与正常细胞相比)对赘生性细胞的特异性结合，而因此成为肿瘤特异性人单克隆抗体。具体来说，本发明的人单克隆抗体都选择性的结合乳癌细胞并且显示出相对而言几乎不结合正常纤维。例如，与正常纤维原细胞、外周血淋巴细胞、黑素瘤细胞或肺部癌细胞相比，LH11238抗体特异性结合出现在乳房和卵巢癌细胞的表面和溶酶体间室的抗原。与正常纤维原细胞和黑素瘤细胞相比，LH13抗体特异性结合由乳房、肺部及卵巢癌细胞产生的产物。
由杂交瘤系H1140、H2420、H935及LH13产生的人单克隆抗体是IgM同型和λ轻链类的，但是由杂交瘤系LH11238产生的人单克隆抗体是IgM同型和K轻链类的。在以下实例中描述了肿瘤特异性人单克隆抗体进一步的特性。
对由LH11238细胞系产生的人单克隆抗体的重链可变区(VH)进行编码的核苷酸序列已经被测定并指定为SEQ ID NO1。将由LH11238细胞系产生的人单克隆抗体的VH氨基酸序列指定为SEQ ID NO2。对由LH11238细胞系产生的人单克隆抗体的轻链可变区(VL)进行编码的核苷酸序列也已经被测定并指定为SEQ ID NO3。将由LH11238细胞系产生的人单克隆抗体的VL氨基酸序列指定为SEQ ID NO4。
编码由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的重链可变区(VL)的核苷酸序列也已经被测定并指定为SEQ ID NO5。由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的VL氨基酸序列被指定为SEQ ID NO6。编码由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的轻链可变区(VL)的核苷酸序列也已经被测定并指定为SEQ ID NO7。由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的VL氨基酸序列被指定为SEQ ID NO8。
本发明进一步提供经分离的人单克隆抗体或其功能片断，其具有的至少一个CDR大体上具有选自由以下SEQ ID NO组成的群组的序列的CDR氨基酸序列10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中人单克隆抗体或其功能片断特异性结合赘生性细胞或其抗原。
由本发明的杂交瘤细胞系(如LH13和LH11238细胞系)产生的人单克隆抗体的变体能展示出(与正常细胞相比)对赘生性细胞的特异性结合，而且因此成为肿瘤特异性人单克隆抗体。在实例VIII和表5中描述了由杂交瘤细胞系LH13和LH11238产生的人单克隆抗体的功能变体和生产它们的方法。
由LH13细胞系产生、特异性结合于赘生性细胞的抗原的人单克隆抗体的功能变体列于表5中而且包括(例如)由克隆体S97G、S97T或S97N产生的抗体片断，其每一个具有未经改质的VL和在SEQ ID NO6中所设定的序列的101位点上加以改质的VH，根据Kabat等人的编号系统所述改质在HCDR3的97位点上。由克隆体S97G产生的抗体片断在如SEQ ID NO10的VH氨基酸序列中所设定的Kabat HCDR3的97位点上具有一个甘氨酸，SEQ ID NO10的VH氨基酸序列由在SEQ ID NO9中所设定的核苷酸序列来编码。由克隆S97T产生的抗体片断在如SEQ ID NO12的VH氨基酸序列中所设定的KabatHCDR3的97位点上具有一个苏氨酸而且由如在SEQ ID NO11中所设定的核苷酸序列来编码。由克隆体S97N产生的抗体片断在如SEQ ID NO14的VH氨基酸序列中所设定的Kabat HCDR3的97位点上具有一个天冬酰胺而且由如在SEQ ID NO13中所设定的核苷酸序列来编码。
由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的其它功能变体也包括由克隆体R91Y或R91F产生的抗体片断，其每一个具有未经改质的VH和在SEQ IDNO8中所设定的序列的90位点上加以改质的VL，根据Kabat等人的编号系统所述改质在LCDR3的91位点上。由克隆体R91Y产生的抗体片断在如SEQID NO16的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的91位点上具有一个酪氨酸，SEQ ID NO16的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO15中所设定的核苷酸序列来编码。由克隆体R91F产生的抗体片断在如SEQ ID NO18的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的91位点上具有一个苯基丙氨酸，SEQ IDNO18的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO17中所设定的核苷酸序列来编码。
如由克隆体V97Y和V97F产生的抗体片断所例示，由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的其它功能变体可以在SEQ ID NO8中所设定的VL序列的98位点上加以改质，同时保留一个未经改质的VH，根据Kabat等人的编号系统所述改质在LCDR3的97位点上。由克隆体V97Y产生的抗体片断在如SEQ IDNO20的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的97位点上具有一个酪氨酸，SEQ ID NO20的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO19中所设定的核苷酸序列来编码。由克隆体V97Y产生的抗体片断在如SEQ ID NO22的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的97位点上具有一个酪氨酸，SEQ ID NO22的VL氨基酸序列由在SEQ ID NO21中所设定的核苷酸序列来编码。
由LH13细胞系产生的、特异性结合到赘生性细胞的抗原上的人单克隆抗体的组合变体也列在表5中，而且包括(例如)由克隆体4D5、4E2、4H7、4G11或3G4产生的抗体片断。与由LH13细胞系产生的人单克隆抗体相比，把由克隆体4D5产生的抗体片断加以改质以在Kabat LCDR3的97位点上具有一个苏氨酸且在Kabat LCDR3的91位点上具有一个酪氨酸。4D5 VH的氨基酸序列设定于SEQ ID NO12中并且由设定于SEQ ID NO11的核苷酸序列来编码，而且VL氨基酸序列设定于SEQ ID NO16中并且由设定于SEQ IDNO15的核苷酸序列来编码。
与由LH13细胞系产生的人单克隆抗体相比，把由克隆体4E2产生的组合变体加以改质以在Kabat HCDR3的97位点上具有一个苏氨酸、在KabatLCDR3的91位点上具有一个酪氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位点上具有一个苯基丙氨酸。4E2 VH的氨基酸序列设定于SEQ ID NO12中并由设定于SEQ ID NO11中的核苷酸序列来编码而且VL氨基酸序列设定于SEQ IDNO24中并由设定于SEQ ID NO23的核苷酸序列来编码。
与由LH13细胞系产生的人单克隆抗体相比，把由克隆4H7产生的组合变体加以改质以在Kabat HCDR3的97位点上具有一个苏氨酸、在Kabat LCDR3的91位点上具有一个苯基丙氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位点上具有一个苯基丙氨酸。4H7 VH的氨基酸序列设定于SEQ ID NO12中并由设定于SEQID NO11中的核苷酸序列来编码而且VL氨基酸序列设定于SEQ ID NO26中并由设定于SEQ ID NO25的核苷酸序列来编码。
与由LH13细胞系产生的人单克隆抗体相比，把由克隆4G11产生的组合变体加以改质以在在Kabat LCDR3的91位点上具有一个苯基丙氨酸、以及在Kabat LCDR3的97位点上具有一个苯基丙氨酸。4G11 VH的氨基酸序列设定于SEQ ID NO6中并由设定于SEQ ID NO5中的核苷酸序列来编码而且VL氨基酸序列设定于SEQ ID NO26中并由设定于SEQ ID NO25的核苷酸序列来编码。
与由LH13细胞系产生的人单克隆抗体相比，把由克隆3G4产生的组合变体加以改质以在在Kabat LCDR3的91位点上具有一个酪氨酸、以及在KabatLCDR3的97位点上具有一个苯基丙氨酸。3G4 VH的氨基酸序列设定于SEQID NO6中并由设定于SEQ ID NO5中的核苷酸序列来编码而且VL氨基酸序列设定于SEQ ID NO24中并由设定于SEQ ID NO23的核苷酸序列来编码。
由LH13细胞系产生、结合于赘生性细胞上的人单克隆抗体的功能变体列于表5中且包括(例如)由克隆体Q89L、Q89G、Q89V、Q89F或Q89W产生的抗体片断，其每一个具有一个未经改质的VH和在设定于SEQ ID NO4中的序列的97位点上加以改质的VL，根据Kabat等人的编号系统所述改质在LCDR3的89位点上。由克隆体Q89L产生的抗体片断在如SEQ ID NO28之VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的89位点上具有一个亮氨酸(1uecine)，SEQ ID NO28之VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO27中的核苷酸序列来编码。由克隆Q89G产生的抗体片断在如SEQ ID NO30的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的89位点上具有一个甘氨酸，SEQ IDNO30的VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO29中的核苷酸序列来编码。由克隆Q89V产生的抗体片断在如SEQ ID NO32的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的89位点上具有一个缬氨酸，SEQ ID NO32的VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO31中的核苷酸序列来编码。由克隆Q89F产生的抗体片断在如SEQ ID NO34之VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的89位点上具有一个苯基丙氨酸，SEQ ID NO34之VL氨基酸序列由设定于SEQ IDNO33中的核苷酸序列来编码。由克隆Q89W产生的抗体片断在如SEQ IDNO36的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的89位点上具有一个色氨酸，SEQ ID NO36的VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO35中的核苷酸序列来编码。
由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的其他功能变体也包括由克隆P95aF或P95aR产生的抗体片断，其每一个具有一个未经改质的VH和在设定于SEQID NO4中的序列的103位点上加以改质的VL，根据Kabat等人的编号系统所述改质在LCDR3的95位点上。由克隆P95aF产生的抗体片断在如SEQ IDNO42的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的95位点上具有一个苯基丙氨酸，SEQ ID NO42的VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO41中的核苷酸序列来编码。由克隆P95aR产生的抗体片断在如SEQ ID NO44的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的95位点上具有一个苯基丙氨酸，SEQ IDNO44的VL氨基酸序列由设定于SEQ ID NO43或SEQ ID NO45中的核苷酸序列来编码。
如由克隆N93C所产生的抗体片断所示范，可以把由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的功能变体在SEQ ID NO4中所设定的VL序列的100位点上在LCDR3内加以改质，同时保留未经改质的VH。由克隆N93C所产生的抗体片断在如SEQ ID NO38的VL氨基酸序列中所设定的Kabat LCDR3的93位点上具有一个半胱氨酸并且由设定于SEQ ID NO37中的核苷酸序列来编码。如由克隆N94C所产生的抗体片断所示，由LH13细胞系产生的人单克隆抗体的功能变体可以保留一个未经改质的VH且可以经改质以便在设定于SEQ IDNO40中的VL氨基酸序列的101位点(Kabat LCDR3的94位点)上具有一个半胱氨酸并且由设定于SEQ ID NO39中的核苷酸序列来编码。
通过用乳癌细胞将人脾细胞培养物进行活体外免疫来生成产生本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体的杂交瘤。简要来说，通过把从异源人脾中分离出来的单细胞悬浮液共培养来建立混合淋巴细胞反应(MLR)。随后通过用单层或用乳癌细胞的富集血浆膜培育MLR培养物来富集肿瘤-反应性淋巴细胞。为了提供本发明的人单克隆抗体的持久源，通过用K6H6/B5杂交骨髓瘤细胞系融合或用EBV转化随后用K6H6/B5细胞进行融合使经免疫的淋巴细胞无限增生化。在以下实例中更全面地描述了抗原的特定来源和用以产生本发明的每一种杂交瘤细胞系的无限增生化程序。
本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体也可以通过所属领域的技术人员已知的方法来生成。这些方法包括(例如)肿瘤-反应性淋巴细胞的活体内和活体外富集。例如，带有乳房、肺部或卵巢肿瘤的个体可以拥有表达特异性结合肿瘤特异性抗原的抗体的淋巴细胞，所述抗体包括(例如)LH13、LH11238、H1140、H2420或H935抗原。所述淋巴细胞可以从(例如)外周血或从患者的脾分离出来，并且如下文所述被无限增生化。
所属领域中也熟知利用肿瘤特异性抗原来活体外富集肿瘤-反应性人类淋巴细胞的方法。抗原源可以是(例如)大体上纯净的抗原、肿瘤细胞或肿瘤细胞馏分。可通过所属领域的技术人员熟知的任何方法来制备大体上纯净的抗原，包括(例如)色谱、电泳分离以及免疫隔离。可用于制备本发明的人单克隆抗体的抗原可以是(例如)赘生性细胞。赘生性细胞可以是(例如)直接从肿瘤获得的细胞、经培养的原发肿瘤细胞或经形成的细胞系。所述细胞可以发源于人体的任何器官、组织或液体，包括(例如)乳房、肺部或卵巢。癌症细胞可以是未经处理的、固定的或被生长捕获的。可使用包括(例如)化学固定的被所属领域的技术人员已知的许多方法来进行固定。可用于固定的化学品包括(例如)多具甲醛、戊二醛、甲醇、或丙酮。另一选择为可使用细胞抑制剂来生长-捕获细胞。细胞抑制剂的具体实例为丝裂霉素C。
可用于本发明的制备人单克隆抗体的抗原也可以是肿瘤细胞的馏分。肿瘤细胞馏分可以是(例如)细胞膜、细胞质内容物、或胞核。用于细胞分部分离的方法在所属领域中为人所熟知。用于制备本发明的单克隆抗体的抗原也可以是由肿瘤细胞分泌的抗原。可以通过(例如)使用所属领域中已知的领域分离肿瘤细胞的条件培养基或细胞基质来制备所述抗原。
如上所述来制备的抗原可以用来刺激人体淋巴细胞以生成本发明的肿瘤特异性人体单克隆抗体。可以(例如)从活个体的外周血或从死亡个体或进行外科手术的个体的脾来获得人体淋巴细胞。可以用抗原直接培养淋巴细胞。另一选择为，可以在异源淋巴细胞存在下在混合淋巴细胞反应中用抗原培养淋巴细胞。可以由所属领域的技术人员很容易的决定对特定抗原和淋巴细胞的适当培养条件。
若有需要，如上所述通过活体内或活体外刺激来富集的已接触抗原的(antigen-primed)淋巴细胞可以通过所属领域的技术人员已知的许多程序来进行无限增生化。无限增生化提供了肿瘤特异性人单克隆抗体的持久来源。可以通过(例如)用无限增生的细胞系进行融合来完成淋巴细胞的无限增生化。可用于细胞融合的所述无限增生的细胞系可以是(例如)人骨髓瘤细胞或人类淋巴母B细胞系。融合伙伴也可以是啮齿动物骨髓瘤细胞或人啮齿动物杂交骨髓瘤细胞系。杂交骨髓瘤细胞系可以是(例如)人小鼠异杂交瘤细胞系K6H6/B5。另一选择为，可以使用(例如)病毒经由转化作用来把已接触抗原的淋巴细胞无限增生化。可用于经由病毒转化作用进行无限增生化的病毒是EBV。已接触抗原的淋巴细胞也可以在经由病毒转化作用进行无限增生化后进行融合。随病毒转化作用后进行融合可以是(例如)随EBV转化作用后用K6H6/B5细胞系进行融合。所属领域的技术人员可以很容易的确定用于淋巴细胞融合或病毒转化作用的培养条件。使用所属领域的技术人员已知的免疫测定可以筛检经无限增生化的淋巴细胞以用来生产特异性结合到人体肿瘤细胞的人单克隆抗体。所述免疫测定包括(例如)定量和定性免疫测定。定性免疫测定包括(例如)沉淀素方法、凝集素反应、免疫组织化学、免疫荧光法、免疫点墨法及免疫沉淀反应。定量免疫测定包括(例如)免疫亲合方法，例如放射性免疫测定、FACS分析、及ELISA分析。ELISA分析可以为直接的、夹层的(sandwich)或竞争的。免疫测定使用(例如)经标记的人单克隆抗体可以是直接的。另一选择为所述方法使用(例如)经标记的抗-人二级抗体可以是间接的。标记物可以是(例如)荧光标记物、酶、放射性同位素、或生物素。依免疫测定而定，可以通过分光光度法、X光线照相术或化学发光方法来进行检测。所述方法也可以用来筛检经改进的抗体或其功能片断，它们对赘生性细胞或其抗原具有增强了的亲合性。
也可以在筛检中根据与赘生性细胞或其抗原的已接触抗原来鉴别经改进的抗体或其功能片断。具体来说，可以把经改进的抗体或其功能片断鉴别为其与所衍生于的母抗体相比提高了相关率。使用所述筛检，由于结合速率提高而具有改进的治疗效能的抗体或其功能片断可以从由于结合速率降低对于相同的抗原具有增大Ka的结合多肽区别开来，所述结合速率降低不与治疗效能有相互联系。在这点上，所属领域的技术人员应认识到根据KA＝kon/koff的关系，kon增大或koff减小或者两者同时进行都可以增大KA。
可以在任何非-平衡混合物中测定结合速率，所述混合物包括(例如)通过使抗体或其功能片断与抗原快速接触或通过快速改变含有结合伙伴的溶液温度所形成的混合物。非-平衡混合物可以是预-平衡混合物。可以通过(例如)在检测箱中的总抗原和总抗体或其功能片断的量恒定的条件下，使可溶性抗体或其功能片断与可溶性抗原相接触来形成预平衡混合物。测量在预-平衡混合物中的结合速率可以在格式中进行，所述格式提供将抗体或其功能片断与抗原快速混合并且在毫秒或更快的时间量程上快速检测抗体或其功能片断或者抗原的特性改变。诸如下文所描述的和停止流动和快速猝灭流动的仪器提供了测量非平衡动力学的便利方法。也可以测量非-平衡混合物中的结合速率，该非平衡混合物包括(例如)含有可溶性种类的抗体或其功能片断的溶液、或含有可变浓度的总抗原或者总抗体或其功能片断的溶液。测量在非平衡混合物中的结合速率可以在格式中进行，所述格式提供将抗原附着到在表面上含有抗体或其功能片断的溶液表面及连续流上，或反过来与快速检测抗体或其功能片断、抗原或表面的特性改变相组合，以使得测量在毫秒或更快的时间量程上进行。
用于在预平衡混合物中测量结合速率的格式包括(例如)停止流动动力学仪器和快速猝灭流动仪器。停止流动仪器可用来把含有抗体或其功能片断的溶液和抗原在通过检测池之前从分开的储槽推到混合箱内。接着所述仪器可以检测一个或多个上述特性的改变来监控结合事件的进展。快速猝灭流动仪器可用来把含有抗体或其功能片断的溶液与含有抗原的溶液快速混合随后在经过有限量的时间后猝灭结合反应。接着可以对通过随混合后在不同时间猝灭所产生的猝灭混合物检测一个或多个上述特性的改变。可以通过(例如)冷冻或添加化学猝灭剂来进行猝灭，只要所述猝灭步骤不会抑制为结合率测量所依赖的特性的检测。因此，快速猝灭仪器可用在(例如)不方便进行光谱检测的情况下。可以从例如KinTek Corp.(State College，PA)和Hi-Tech Scientific(Salisbury，UK)的供货商处购得多种仪器。
用于在非平衡混合物中测量结合速率的格式包括(例如)表面等离子共振和衰减波仪器。表面等离子共振和衰减波技术利用附着在一个生物传感器表面的抗原或者抗体或其功能片断。使含有各自的结合伙伴的溶液穿过生物传感器表面而且可以用依赖于时间的方式测量依据结合而发生在芯片表面的溶液折射率的变化。例如，表面等离子共振基于当在金属/液体界面激发表面等离子波时所发生的现象。光线被不和样品相接触的表面定向或从其反射，而且SPR引起在角度和波长的特定组合处被反射的光强度减少。生物分子结合事件引起表面层折射率的变化，其作为SPR信号的变化而被检测。结合事件可以是受体-配位子对之间结合的结合或解离。基本上能够立即测量到折射率的变化而因此允许了测定亲合性常数的个体成分。更具体来说，所述方法使得能够精确测量结合速率常数(kon)和解离速率常数(koff)。所属领域中可用的表面等离子共振仪器包括(例如)BIAcore仪器、IBIS系统、SPR-CELLIA系统、Spreeta、而且等离子SPR和共振波技术可用在Iasys系统中，其描述于(例如)Rich和Myszka，Curr.Qpin.Biotech.1154-61(2000)。
在结合事件过程中，使用(例如)上文所述的方法在一个或多个离散时间间隔(discreet time interval)处通过测量配位子或结合多肽的特性来测定相关率。在结合事件过程中于离散时间间隔测定的测量可被用来决定结合速率的定量测量或结合速率的相对测量。结合速率的定量测量可以包括(例如)结合速率值或kon值。可以从随时间变化的测量的数学分析或图形分析来测定结合速率或kon的定量值。所述分析在所属领域中为人所熟知而且包括用于拟合数据到指数或线性项的总和的运算法则或用于计算机模拟以拟合数据到结合模型，其描述于(例如)Johnson，Cur.Opin.Biotech.987-89(1998)。
如果在反应中算入质量传输的影响，那么使用例如上文所述的数学分析或图形分析可以从含有可溶性种类或可变浓度的全部配位子或全部结合多肽的混合物来测定结合速率。所述领域的技术人员能够通过比较在具有与质量传输相似的限制性的条件下的结合速率或通过根据所属领域中可获得的模型调整计算出的结合速率来计算质量传输，所述模型包括(例如)描述于Myszka等人，Biophys.J.75583-594(1998)中的模型。
用于针对肿瘤反应性进行筛检单克隆抗体的肿瘤特异性抗原不需要同用于使人淋巴细胞免疫的抗原相同。用在筛检中的抗原可以是(例如)大体上经提纯的抗原、活的或经固定的肿瘤细胞单层、活的或经固定的肿瘤细胞悬浮液、肿瘤细胞的馏分、或肿瘤活组织检测的区段，其取决于所用的分析程序。肿瘤细胞可以是(例如)人乳房、卵巢或肺部癌细胞。
本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体和功能片断不结合、或最低限度的结合、或被制成仅最低限度的结合到正常细胞抗原上。正常细胞或正常细胞的馏分可被用作对筛检人单克隆抗体的对照。所述正常细胞可以是(例如)活的或经固定的正常组织或经培养的细胞系。可被用作对照的经培养的正常细胞系包括(例如)人纤维原细胞和外周血淋巴细胞。虽然任何正常细胞都可被用作对照，具体对照的选择部分基于被筛检的具体的肿瘤特异性单克隆抗体的特异性。例如，如果针对癌细胞产生并筛检人肿瘤特异性单克隆抗体，接着那么可用作比较的一类正常细胞是正常上皮细胞培养物或细胞系。近似的，如果针对肉瘤细胞产生并筛检人肿瘤特异性单克隆抗体，那么可用作比较的一类正常细胞是正常纤维原细胞或细胞系。来自相同的组织类型或从相同的个体的正常细胞培养物或细胞系也可以提供正常对照。所属领域的技术人员会知道什么是合适类型的正常细胞，其可用作测定特异性结合到具体类型的肿瘤细胞的对照。
可以提纯并定量化肿瘤特异性人单克隆抗体或其功能片断以用于免疫诊断和免疫治疗程序中。所述提纯方法为所属领域的技术人员所熟知而且取决于人单克隆抗体的来源和具体应用。提纯方法可包括(例如)沉淀、电泳、色谱、及免疫亲合提纯。可以使用所属领域中已知的分光光度法或免疫测定将经提纯的抗体定量化与已知的标准对照相对比。
为了进一步表征肿瘤特异人单克隆抗体，也可通过免疫测定法测量单独的重链和轻链多肽的存在来测定它们的种类和亚类。所述免疫测定法包括ELISA测定而且为所属领域的技术人员所已知。本发明还包括本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体的功能片断。人单克隆抗体的功能片断保持例如特异性结合或效应物功能的生物活性。因此功能片断可被有利地用来检测和治疗癌症。
功能片断包括具有与本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体大体相同的重链和轻链可变区的片断。例如，功能片断包括其中至少一条CDR序列由与本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体的CDR序列大体上相同的氨基酸序列组成的功能片断。所述功能片断包括(例如)VL、Fd、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc及CDR片断。例如，功能片断可能具有本发明的人单克隆抗体的VL的三条CDR序列中的一个或多个、VH的三条CDR序列中的一个或多个、或VL和VH CDR的组合。可以由所属领域的技术人员依靠功能片断的所要亲合性和特异性及所希望的用途来决定VL和VH CDR序列的合适数量和组合。
使用所属领域的技术人员熟知的方法可以很容易地产生并分离本发明的人单克隆抗体的功能片断。所述方法包括(例如)蛋白水解方法、重组法及化学合成。用来分离功能片断的蛋白水解方法使用人单克隆抗体作为起始材料。适于蛋白水解人单克隆抗体的酶包括(例如)木瓜蛋白酶、胃蛋白酶及弹性蛋白。依(例如)需要单价片断还是二价片断而定，由所属领域的技术人员能够很容易的选择适当的酶。例如，木瓜蛋白酶分裂得到两个结合抗原和Fc片断的单价Fab1片断。胃蛋白酶(例如)导致二价F(ab′)2片断。可以使用(例如)DTT或β-巯基乙醇进一步还原本发明的F(ab′)2片断亦产生两个单价Fab1片断。
可以通过亲合性和柱色谱程序来提纯由蛋白质水解产生的功能片断。例如，未经消化的抗体和Fc片断往往通过结合到蛋白质A来移除。另外，使用(例如)离子交换和凝胶过滤色谱利用功能片断的电荷和尺寸把它们提纯。所属领域的技术人员熟知所述方法。
用于产生人单克隆抗体的功能片断的重组法开始于免疫球蛋白重链和轻链的所要区域的经分离的核酸。所述区域可以包括(例如)所有或部分的重链和轻链的可变区。所述区域可以具体包括重链和轻链的CDR。
本发明提供编码人单克隆抗体或其功能片断的经分离的核酸，其具有大体上对至少一条下述CDR的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，所述CDR通过选自由以下SEQ ID NO组成的群组的核苷酸序列进行编码1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。本发明还包括对可变区域编码的经分离的核酸，其具有对下述CDR的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列，该CDR通过选自由以下SEQ ID NO组成的群组的核苷酸序列进行编码1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。也提供编码CDR的经分离的核酸，其大体上具有由以下SEQ ID NO编码的CDR氨基酸序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
可以使用所属领域的技术人员已知的方法编码本发明的人单克隆抗体或其功能片断的核酸。用来分离所述DNA的有用程序开始于能够从产生肿瘤特异性特单克隆抗体的杂交瘤细胞的RNA反向-转录的cDNA。用于cDNA合成的方法在所属领域中为人所熟知。使用(例如)聚合酶链反应(PCR)可以放大对重链或轻链的功能片断进行编码的cDNA。PCR技术是美国专利第4,683,195、第4,800,159号、第4,754,065号、及第4,683,202号的主题，所述所有专利以引用的方式并入本文中。用于PCR的适当引子为人所知并且可以由所属领域的技术人员使用位于重链或轻链的具体功能片断侧面的保守序列来决定。适当的PCR条件为人所知并且也可以类似地由所属领域的技术人员来决定。
也可以通过所属领域中已知的低聚核苷酸合成的方法来直接合成编码本发明的人单克隆抗体的功能片断的核酸。另一选择为，使用所属领域中已知的重组法可以合成并连接更小的片断以形成更大的功能片断。
编码本发明的人单克隆抗体的功能片断的核酸可以被克隆到适当的表达载体中而且在适当的宿主中被表达。适当的载体和宿主细胞系统可以允许(例如)重链和轻链的功能片断的共表达及装配。所属领域的技术人员可以决定用于表达抗体片断的适当系统，且其包括(例如)M13抗菌素免疫表达载体。可以使用所属领域中已知的方法来大体上提纯本发明的重组功能片断，所述方法取决于所用的具体载体和宿主表达系统。
也可以调整编码肿瘤特异性人单克隆抗体或功能片断的经分离的核酸以产生具有如亲合性、选择性、活动性、稳定性或生物利用率的最佳特性的抗体。所述改质可以包括(例如)氨基酸残基地添加、删除、或取代或者D-氨基酸或类氨基酸的取代，只要所述片断保持(例如)抗原结合特异性的功能反应性。
此外，本发明提供LH13和LH11238变体的差别库(distinct libraries)。LH13库可以含有在Kabat轻链CDR3(LCDR3)中对应于SEQ ID NO8的88-98位点上具有至少一个氨基酸变动的变体，在Kabat重链CDR3(HCDR3)中对应于SEQ ID NO6的99-107位点上具有至少一个氨基酸变动的变体。LH11238库可以含有在Kabat轻链CDR3中对应于SEQ ID NO4的97-106位点上具有至少一个氨基酸变动的变体。虽然上文所示范的库是基于Kabat等人的编码系统，所属领域的技术人员将能够根据包括(例如)Chothia等人或MacCallum等人的任何CDR定义使用先前所设定的编码系统来产生类似的库。根据先前所设定的编码系统，本发明的库可以含有在对应于一个或多个LH13或LH11238的CDR的区域中具有至少一个氨基酸变动的变体，所述CDR包括HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2或LCDR3。可以使用LH13或LH11238变体的库以筛检具有增加的抗原或赘生性细胞结合反应性的抗体或功能片断，其如下文进一步详细陈述。
可以通过中此项技术中熟知的多种方法来制备具有充足多样性以含有具有增强的结合亲合性的抗体变体或其片断的库。所属领域的技术人员会知道为达到预期的目的，多大的库尺寸和多样性是必需的或充足的。例如，抗体或抗体片断变体库可被制备成含有于母抗体中在一或多条CDR的每一位置上未发现的19种基础氨基酸中的每一种，且筛检出所得群体中具有增强的结合活性的变体。
另一选择为，利用与本文所述抗体相关的结构、生化、及模型信息来制备经集中的库。应了解相关于测定或预测对于本发明的抗体的结合活性或结构完整性或稳定性十分重要的残基或区域的任何信息都可用于设计经集中的库。因此，在经测定或经预测对结合赘生性细胞活其抗原的抗体的结合活性或结构完整性或稳定性十分重要的一个或多个位于一个区域中的氨基酸位具体位置上，组成所述库的抗体变体可以含有氨基酸变动。抗体变体的偏倚组合库(focusedlibrary)提供了降低为鉴别具有增强的结合活性或结构稳定性的变体而需要筛检的变体数量的有利条件。
合成和筛检偏倚组合库的组合途径可以进一步提供鉴别经改进的抗体变体或其片断的时间和效率的有利条件。如实例VIII所示，LH13变体中的多重变化是附加性的。在其它不相关的单克隆抗体中氨基酸变化的附加性在先前已经有报道，其如(例如)Yelton等人，J.Immunol.1551994-2004(1995)，Wu等人，supra(1998)，以及Wu等人，supra(1999)中所描述。通过合成基于从HCDR3库和LCDR3库发现的单氨基酸变化的组合库来鉴别附加的氨基酸组合许可了抗体亲合性以非常有效的方式快速增强。
如实例VIII所示，在第一步中合成由171 HCDR3突变体和209 LCDR3突变体组成的仅为416差异蛋白质变体随后在第二步中合成36个组合变体，由此完成LH13的两步亲合性成熟。相反，证实以影响活性的LCDR3 S97、HCDR3R91及HCDR3 V97三个CDR残基的总随机化将需要含有193或6,859个变体的库的表达。因此，实例VIII中所描述的组合途径提供了对捕获独立突变的附加性的逐步改进，其为简化亲合性成熟过程的有效方法。所属领域的技术人员将从实例VIII的结果了解到通过合成对应于HCDR1和HCDR2以及LCDR1和LCDR2的附加LH13库可以进一步改进本发明的抗体(如经增强的类别转换变体(class-switched variant))亲合性。而且，以组合的方式可使用从这些库中鉴别的有利突变以鉴别对赘生性细胞或其抗原具有提高的亲合性的经改进的抗体或抗体片断变体。
可以通过所属领域中已知的多种方法来测定或预测对于将本发明的抗体结合到赘生性细胞或其抗原十分重要的单独残基或区域，而且其可用于集中抗体或抗体片断变体库的合成。可以在结合相同抗原或近似抗原的抗体之间进行序列(初级结构)或三维结构(三级结构)或这两者组合的结构对比以鉴别用于突变的单独残基或区域。例如，基于抗体第三结构的结构模型能揭示出涉及抗原结合的结合位点或具体CDR的拓扑学、静电学、疏水性或亲水性环境。对结合了普通抗原或结构上相似的抗原的两个或两个以上抗体的结合位点的共有特性进行比对可用以鉴别突变形成的位置或区域。可使用序列对比方法来排列序列并鉴别在具有同源残基或具有分享类似空间、静电、疏水或亲水特性的残基的两个或两个以上抗体中的位置。可以使用初级结构和三级结构对比的组合来鉴别被改动的位置。例如，可以在三级结构分析中鉴别在初级结构中彼此远离的对于结合十分重要的位置，而且所述位置在初级序列中加以着重以用来查询抗体初级序列的数据库或与一种或多种其它抗体初级序列相对比。
所属领域中熟知可用来决定两条序列大体上相同的对比初级序列结构的方法。例如，一种用来决定两条序列是否大体上相同的方法为BLAST，(BasicLocal Alignment Search Tool，局部比对基本搜索工具)，其可以根据描述于Tatiana等人，FEMS Microbial Lett.174247-250(1999)中、或在国家中心关于生物技术信息的网页上ncbi.nlm.gov/BLAST/的缺省参数来使用所述工具。BLAST是一套相似性搜索程序，其被设计用来检测所有可获得的序列数据库而且可以运行以搜索氨基酸或核算序列中的相似性。BLAST搜索提供了具有定义明确的统计描述的搜索分数。而且，BLAST使用启发式运算法则，其寻找局部比对而且因此能够检测仅共享包括(例如)蛋白质域的相似性分离区域的序列间的关系(Altschul等人，J.Mol.Biol.215403-410(1990))。除了原先所述的BLAST(Altschul等人，supra，1990)，已经对运算法则作过修改(Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。一种修改是Gapped BLAST，其允许把空隙、插入或删除两种中的任一种引入比对中。在比对中允许空隙有助于更紧密地反映生物关系。例如，可以使用gapped BLAST在两条或两条以上多肽的相似域内鉴别序列同一性。第二种修改是PSI-BLAST，其为搜索序列同系物的灵敏方法。PSI-BLAST执行初始的Gapped BLAST搜索而且使用来自任何重要比对的信息以构造位置特异分数矩阵，其代替用于下一轮数据库搜索的查询序列。PSI-BLAST搜索往往对微弱但生物学上相关的序列相似性更为灵敏。
可用于决定两个序列是否大体上相同的第二来源是可在ExPASy的全球互联网上获得的PROSITE。PROSITE是测定从染色体组的或cDNA序列翻译的未经特征化的多肽功能的方法(Bairoch等人，Nucleic Acids Res.25217-221(1997))。PROSITE由生物学上有意义的位点和图案的数据库所组成，所述位点和图案可用来鉴别新序列属于哪个(若存在)已知的多肽家族。使用这个或类似的运算法则，可以通过在多肽序列中特定簇氨基酸残基的发生(此可称为图案、花纹、符号或指印)与在参考多肽中的氨基酸残基的特定簇(包括，例如在类似域中发现的那些簇)大体上相同来鉴别大体上与另一多肽相同的多肽。PROSITE使用计算机运算法则以搜索将多肽鉴别为家族成员的图形。PROSITE还维持先前经鉴别的花纹的编辑，其可用以决定一个最近经鉴别的多肽是否为一个已知家族的成员。
序列对比可以包括基因、cDNA或其经表达的产物的全部序列或者可以包括其一个或多个特定区域。可以通过目测序列比对鉴别特定区域以确定相对高的同源性或相似性的区域来鉴别特定区域。如上所述，可以用结构数据交叉参考哪些区域以发现特定结构域和同源性区域之间的相关性。也可以在运算法则中使用参考抗体或其片断的结构模型，该运算法则将包括有(例如)SCOP、CATH或FSSP(在Hadley和Jones，Structure71099-1112(1999)中有评述)和具有特定折叠或构造作为序列对比区域的区域的多肽结构与第二多肽进行对比，以鉴别大体上相似的区域。
除抗体的结构模型以外，可以使用生化数据来测定或预测对于结合赘生性细胞或其抗原十分重要的抗体位置或区域和这些在制备抗体变体的偏倚组合库中被瞄准的位置或区域。在这点上，关于结合率常数(kon)、解离速率常数(koff)或平衡结合亲合性常数(Kd或Ka)的母抗体或其变体的表征可用来鉴别对结合到赘生性细胞或其抗原十分重要的区域。为了生成抗体变体库，可以单独或组合使用不同类型的信息以测定或预测对结合到赘生性细胞或其抗体十分重要的氨基酸序列的区域。例如，可以把基于结构模型和生化分析的信息(如比较对于在结构上保守的位置上具有变化的变体的亲合性)加以组合以测定对结合活性十分重要的抗体的氨基酸序列区域。因为可以把通过多种方法获得的信息加以组合来预测对结合十分重要的区域，所属领域的技术人员应了解到所述区域自身代表近似而非严格的界线。结果是可以在被测定或预测为直接与抗原相合的区域以外的位置改动抗体变体库。例如，骨架区可能对抗体或其片断的结构稳定性十分重要或可能通过长程或经由影响结合位点特性的空间相互作用来影响结合亲合性。类似地，结合赘生性细胞或其抗原的抗体或其片断的变体可以在CDR或本文中所鉴别出直接与结合有关的其它区域之外具有氨基酸变动。
应进一步理解基于所用的预测方法和所对比的结构，被预测出对结合活性十分重要的氨基酸位置的数量或所在地会变动。例如，如上文所述，可以使用不同的CDR定义来对比抗体序列。所述领域的技术人员应理解可以使用相同的CDR定义来鉴别在两个或两个以上抗体结构之间所要比较的区域或位置。例如，可以用实例VII中所述的Kabat等人的CDR3定义来对比两个或两个以上抗体并示于表V中。可基于抗体的初级结构或三级结构来决定用于评价抗体的适当CDR定义。类似地，可以基于每一抗体结构的最初观察和对最适合所对比的所有结构的定义的鉴别来决定用于对比两个或两个以上抗体结构的CDR定义。在选择适当的CDR定义中也可能考虑进其它因素，包括(例如)母抗体或其变体的功能特性。所属领域的技术人员可以使用不同的CDR定义来执行相同抗体的分开对比并且因此根据在分开对比中发现区域或位置相似或同源的频率来鉴别所变动的区域或位置。
用于制作含有多样化群体的各种类型分子(如肽、peptoid和peptidomimetics)的库在所属领域中已为人所熟知(例如参看Ecker和Crooke，Biotechnology13351-360(1995)，及Blondelle等人，Trends Anal.Chem.1483-92(1995)，以及其中所引用的文献；还参看Goodman和Ro，Peptidomimetics for Drug Design，于“Burger′s Medicinal Chemistry and DrugDiscovery”中，第1卷(ed.M.E.Wolff；John Wiley & Sons 1995)，第803-861页，及Gordon等人，J.Med.Chem.371385-1401(1994))。当分子为肽、蛋白质或其片断时，所述分子可在活体外直接产生或者可以从能在活体外产生的核酸表达。合成肽化学的方法在所属领域中已为人所熟知。
可以(例如)通过构造编码抗体变体的核酸表达库来产生抗体变体库。用于生产所述库的方法在所属领域中已为人所熟知(例如参看Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(1989)；Sambrook等人，Molecular CloningA LaboratoryManual.第三版，Cold Spring Harbor Press，Plainview，New York(2001)；Ausubel等人Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley & Sons，New York(1999))。编码抗体变体的核酸库可由DNA、RNA或其类似物组成。可以(例如)通过化学合成RNA分子来构造含有RNA分子的库。可以通过使用者想要的任何方式来生成编码抗体或抗体片断变体的核酸库。所属领域的技术人员会知道可用何种方法来生成编码抗体或抗体片断变体的核酸库。例如，使用所属领域的技术人员所熟知的方法(Sambrook等人，supra(1989)；Sambrook等人，supra(2001)；Ausubel等人，supra(1999))可以通过对编码诸如LH13或LH11238的母抗体的核酸进行诱变来生成抗体变体库。可随机化编码本发明的抗体或抗体片断变体的核酸库以使其具有充足多样性以含有在一个或多个CDR的每一个氨基酸位置上的编码每一个可能自然发生的氨基酸的核酸。另一选择为，可以制作核酸库使其含有仅在位于CDR区域内的位置上的每一个氨基酸处编码每一个可能自然发生的氨基酸的核酸，所述CDR区域如实例VIII中所述经预测或测定为对于结合到赘生性细胞或其抗原是十分重要的。
使用(例如)位点定点(site-directed)诱变(参看Wu(Ed.)，Meth.In Enzymol.Vol.217，San DiegoAcademic Press(1993)；Higuchi，″Recombinant PCR″inInnis et al.(Ed.)，PCR Protocols.San DiegoAcademic Press，Inc.(1990)，其每一篇以引用的方式并入本文中)可以把一种或多种突变引入编码抗体或抗体片断变体的核酸分子中以产生经改质的核酸分子。可以使用所述诱变以引入特定的、所想要的氨基酸变动。因此，可以制作在一个或多个经测定对结合活性十分重要的区域中含有氨基酸变动的差别库以及在几个或所有区域中含有突变的单一库。
可如Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，956037-6042(1998)；Wu等人，J.Mol.Biol..294151-162(1999)；及Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82488-492(1985)先前所述，使用低聚核苷酸-定向的诱变来完成抗体或抗体片断变体的有效合成和表达。低聚核苷酸-定向诱变为人所熟知且有效的用来系统性地引入突变(不依赖于它们的显型)的程序，且因此理想地适合于蛋白质工程的定向进化途径。为了执行低聚核苷酸-定向诱变，使编码想要的突变的核酸库杂交到野生型序列的单链含尿嘧啶的模板上。所述方法很灵活，允许不使用限制酶而引入精确的突变，而且如果使用基于密码子的诱变合成低聚核苷酸则所述方法相对便宜。使用所属领域中已知的方法，通过使编码特定氨基酸的核酸密码子突变可以引入氨基酸取代。只要片断保留功能活性，可以改动单个或多个密码子。用于制造和筛检多个同时发生的变化的快速方法在所属领域中为人所熟知而且可用来产生对含有所有可能的或所有想要的变化的核酸进行编码并接着表达和筛检保留功能的人单克隆抗体或片断库的库。所述方法包括(例如)基于密码子的诱变、随机低聚核苷酸的合成以及部分退化的低聚核苷酸合成。
基于密码子的诱变是美国专利第5,264,563号和第5,523,388号的主题而且有利于上述程序，因为它允许在低聚核苷酸内生产在任何以及所有特定密码子位置上的经编码的氨基酸残基的基本上任何以及所有想要的频率。所述想要的频率包括(例如)所有二十个氨基酸或其指定的子集真正随机的合并以及一个或多个特定氨基酸的预定偏向的合并以合并与其它经合并的氨基酸残基相比所述经偏向的残基的更高或更低频率。
可近似把随机低聚核苷酸的合成用于产生和筛检功能上等价的氨基酸变化。然而，由于遗传密码的退化，所述方法能在想要的氨基酸位置合并冗余(例如参看美国专利第5,723,323号)。随机低聚核苷酸的合成包括在密码子内于每一个核苷酸位置处耦合所有四个核苷酸。也存在其它合成的随机方法，其可导致退化的或部分退化的低聚核苷酸或编码完全随机的氨基酸序列的低聚核苷酸(例如参看美国专利第5,723,323号)。
部分退化的低聚核苷酸合成是耦合在(例如)最初的两个核苷酸位点的所有四个核苷酸的平等部分与在第三位置的两个核苷酸的平等部分。可以发现这些后来的合成方法都描述于(例如)Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876378-6382，(1990)和Devlin等人，Science249404-406，(1990)。
可对上文所述的用于产生各种若干变体序列的基于密码子的合成加以修改，其可用于产生本文所述的抗体或抗体片断变体库。这个修改是基于使合成偏向于母序列的上述的两容器方法而且允许使用者将变体分成含有确定数量密码子位置(其具有随机密码子变化)的群体。
简要来说，通过把反应容器在每一个密码子位置的合成后分开到两个新的容器来执行这项合成。分开后，从第二个容器开始，混合来自每一个连续对的反应容器的反应产物。混合把具有相同数量的带有随机变化的密码子位置反应的混合物带到一起。通过接着将第一和最后的容器的产物与来自每一个连续对的反应容器的新被混合的产物分开并且重新分开到两个新的容器中来继续进行合成。在新容器的其中一个里合成母密码子并且在第二个容器中合成随机密码子。例如，在第一密码子位置的合成使一个反应容器承担母密码子的合成而且第二个反应容器承担随机密码子的合成。对于在第二密码子位置的合成而言，最初的两个反应容器每一个都被分开到两个容器中产生两对容器。对每一对而言，在其中一个容器中合成母密码子而且在第二个容器中合成随机密码子。当按线性排列时，把第二和第三容器中的反应产物混合以将在单一密码子位置处具有随机密码子序列的那些产物带到一起。这项混合也使产物群减少到三个，它们是用在下一轮合成中的起始群。类似地，对于第三、第四和每一个残余的位置，把用于前述位置的每一个反应产物群分开并合成母密码子和随机密码子。
随基于密码子的合成的上述修改后，可以很方便地分离在一个、两个、三个及四个位置以及其它位置上含有随机密码子变化的群，而且所述群可基于个体的需要来使用。而且，这项合成流程也允许在母序列上富集用于受随机化的序列群，因为仅含有母序列合成的容器被类似地从随机密码子合成中分离出来。可使用这个方法来合成编码抗体变体的核酸库，所述抗体变体在一个或多个被预测为对于结合到赘生性细胞或其抗原十分重要的CDR中具有氨基酸变动。
另一选择为，也可以使用基因混排来生成编码抗体或抗体片断变体的核酸库。基因混排或DNA混排是用于通过重组生成多样性的定向演变的方法(例如参看Stemmer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9110747-10751(1994)；Stemmer，Nature370389-391(1994)；Crameri等人，Nature391288-291(1998)；Stemmer等人，美国专利第5,830,721号，1998年11月3号颁发)。基因混排或DNA混排是使用活体外同源重组经选择的突变基因池的方法。例如，可以使用特定基因的点突变池。例如，使用Dnase将基因随机性的打碎，并由PCR重新装配。若须要，可以使用来自不同生物体的同源基因进行DNA混排以生成多样性(Crameri等人，supra，1998)。若有须要可以执行多轮破碎和重新装配。所得经重新装配的基因组成可以用在本发明组合物和方法中的抗体或抗体片断变体库。
对于某些治疗和诊断应用而言可能更好使用具有相同的抗原特异性但具有不同的同型或异型决定因素的抗体或其片断。所述抗体可能具有(例如)降低的致免疫性、增加的稳定性、或更多最佳的效应物功能。因此，本发明的功能片断可能包括那些通过把本发明的人单克隆抗体的CDR序列克隆到不同的骨架区所获得的功能片断。可以从不同种类、不同人个体、或来自相同或不同个体的重链或轻链类来获得所述不同的骨架区。所述CDR移植法为所属领域的技术人员所熟知。在实例VIII中描述了从IgM免疫球蛋白移植CDR序列到IgG骨架区的一个实例。如实例VIII所示，活体外亲合性成熟可以允许实质上任何抗体的改进，包括具有基本上胚系序列的低亲合性IgMs。
可以通过上述用于测定人单克隆抗体的免疫活性的方法来评价本发明的抗体或抗体片断变体的功能活性。用于测定片断功能活性的特别有用的方法包括竞争放射性免疫测定和竞争ELISA测定。所述方法可用于筛检对赘生性细胞或其抗原亲合性经改进的变体。依所筛检的变体数量而定，可以不同的严格度使用所述方法。也可基于筛检所进行的循环次数或反复次数来调整严格度。例如，在早期筛检步骤中可使用低严格度且在稍后的筛检步骤中提高严格度。可以在筛检抗体库中使用低严格度的亲合性标准以放大所探测的多样性而不需创作更大的库或筛检更大数量的克隆而且可以导致从先前所筛检的Ig组成部分中发现新颖的抗体。
本发明提供含有本发明的人单克隆抗体或功能片断和医药载剂的医药组合物。可用所述组合物以投予人单克隆抗体或片断以减少赘生性细胞的增生或存活能力。也可以使用所述组合物以检测赘生性细胞。用于本发明方法的适当医药载剂为人所熟知且包括(例如)诸如生理学缓冲盐水的水溶液，以及其他溶剂或培养基，如乙二醇、甘油、油类或可注射的有机酯。医药载剂可含有生理学上可接受的化合物，其用作稳定或增加医药组合物的可溶性。所述生理学上可接受的化合物可以是(例如)碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或右旋糖苷；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷光甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；或另一种稳定剂或赋形剂。包括稳定剂和防腐剂在内的医药载剂描述于(例如)Martin，Remington′s Pharm.Sci..第15版(Mack Publ.Co.，Easton，1975)，其以引用的方式并入本文。所有上述的医药载剂和培养基可能为在所属领域中定义为医药级，其意味着它们具有充足的纯度和质量以用于人体中并且区别于研究级剂型中的可比试剂。
所属领域的技术人员会知道选择医药培养基和适当制备所述组合物将取决于想要的用途和投药的模式。
本发明提供具有CDR的多种重链域或其功能片断，所述CDR具有选自由以下SEQ ID NO组成之群组的序列的CDR的实质性CDR序列2、6、10、12、和14。本发明还提供具有CDR的可变轻链域或其功能片断，所述CDR具有选自由以下SEQ ID NO组成之群组的序列的CDR的大体CDR序列4、8、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。本发明也提供具有实质上为选自由以下SEQ ID NO组成之群组的CDR的氨基酸序列的CDR或其功能片断2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。
可以通过所属领域中已知且如上文所述的方法来产生本发明的CDR或其功能片断。例如，可通过重组法或化学合成来产生本发明的CDR。可有利的使用本发明的CDR(例如)以生成选择性地结合本发明的肿瘤特异性人单克隆抗体的抗独特型抗体。产生和使用用于诊断和治疗目的的抗独特型抗体的方法在所属领域中为人所熟知。
本发明的抗体片断可以是可变重链域或可变轻链域。使用本文所述的方法或各种所属领域中已知的其他方法可以在重组系统中表达所述片断。例如，对蛋白质抗原具有亲合性的可变重链域(其类似于那些所期望的单克隆抗体对于蛋白质抗原的亲合性)的表达在所属领域中已知如在(例如)Ward等人，Nature341544-546(1989)和Williams等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA865537-5541(1989)。中的描述。可以(例如)通过合并能在两个所述经改质的片断之间形成分子间交联的半胱氨酸残基来改质本发明的片断以产生多化合价的结合片断，其针对可变重链域描述于williams等人，supra(1989)。也可以(例如)通过表达CDR域使其在构象上受限制来产生具有结合活性的CDR片断。在(例如)Ditzel等人，The J.Immunol.157739-749(1996)中描述了对构象上受限制的CDR的表达，所述CDR是通过添加能形成二硫键并对母抗体的抗原具有特异性的两个半胱氨酸来形成的。可通过本文中所述的对氨基酸或其它部分(如标记物)的各种添加、删除或取代中的任何一种来改质本发明的抗体片断。
本发明还提供通过向细胞投予有效量的人单克隆抗体或功能片断(其由选自由H1140、H2420及H935组成的群组中的细胞系来产生)来减少赘生性细胞增生的方法。还提供通过向细胞投予有效量的人单克隆抗体或功能片断来减少赘生性细胞增生的方法，所述人单克隆抗体或功能片断具有至少一个CDR，其大体上具有选自由以下SEQ ID NO组成的群组中的序列的CDR的氨基酸序列2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。用于减少赘生性细胞增生的人单克隆抗体或功能片断可以进一步包括如细胞毒素剂或细胞抑制剂的标记物，而且可与医药载剂相组合。
用于减少赘生性细胞增生的抗体或其功能片断的有效量为已知的或者可以由所属领域的技术人员使用活体外方法或可靠的动物模型来很容易的决定。活体外方法可以包括(例如)决定用于减少赘生性细胞生长或赘生性细胞转移的组合物的有效量。在用于检测生长或转移的减少的活体外方法中所用的赘生性细胞可以是(例如)肿瘤细胞系或肿瘤的体外(ex vivo)培养物。细胞系或肿瘤可以是(例如)起源于乳房、肺部或卵巢组织的细胞系或肿瘤。用于抑制赘生性细胞生长的有效量可以为(例如)抑制DNA合成、抑制细胞分裂、诱发凋亡、诱发非凋亡性灭活、或抑制血管生成的有效量。用于抑制赘生性细胞转移的有效量可为(例如)用于抑制细胞运动性、细胞迁移、细胞附着、细胞入侵或细胞增生。
也可以从啮齿动物中人肿瘤的异种移植物来决定用于减少赘生性细胞增生的抗体或其功能片断的有效量。所述啮齿动物可以是(例如)大鼠或小鼠。小鼠可以是(例如)正常的或免疫失调的。免疫失调的小鼠可以是(例如)裸鼠或重度联合免疫缺陷小鼠(scid mouse)。所述种类在所属领域种为人所熟知而且可以从商业来源获得。可以通过包括经皮下、经静脉、及经腹腔的大量路线将人癌细胞引入动物中。
随着肿瘤确立后，可将所述动物用不同剂量的本发明的一种分子来治疗，而且可以决定肿瘤质量或体积。功效可以作为肿瘤的部分或完全衰退来测量。用于治疗癌症的有效剂量导致肿瘤更多的部分及完全衰退。
可以通过所属领域的技术人员来决定本发明分子的有效量，而且所述有效量将取决于如个体的年龄、体重、性别及医疗状况、以及投予治疗剂的特定路线的因素。投予本发明的组合物以治疗癌症的有用路线包括(例如)肌肉、肿瘤内、血管内、腹膜内、皮下或鼻内路线。可由所属领域的技术人员来决定对癌症患者的具体治疗的功效。例如，可使用如下文所述的活体内或活体外诊断方法来测定肿瘤已经复原或接受治疗后被消除了。此外，可使用正常的预兆性标志，如对于癌症患者的存活率和增加的生命质量。
本发明提供通过使样品与人单克隆抗体或功能片断(其由选自由H1140、H2420及H935所组成的群组的细胞系来产生)相接触来检测赘生性细胞，并检测人单克隆抗体或功能片断对该样品的特异性结合的方法，其中与正常细胞相比较，存在或增加的含量的人单克隆抗体或功能片断表示存在癌症或易患癌症的体质。本发明也提供通过使样品与具有选自由SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44所组成的群组中的序列的CDR氨基酸序列的人单克隆抗体或功能片断相接触来检测赘生性细胞，并检测人单克隆抗体或功能片断对该样品的特异性结合的方法，其中与正常细胞相比较存在或增高的含量的人单克隆抗体或功能片断的表示存在癌症或易患癌症的体质。
本文所用术语“样品”用来指任何生物学的流体、细胞、组织、器官或其一部分，其包括或潜在地包括赘生性细胞。生物学流体可以是(例如)血液或淋巴液。组织可以是(例如)乳房、卵巢或肺部。样品可以是活体内或活体外样品。活体外样品可以是(例如)组织切片、由活组织检测获得的标本、或替代入或适应于组织培养物的细胞。可以由所属领域中已知的、适合于检测方法的具体格式的方法来制备样品。
可以使样品与本发明的人单克隆抗体或功能片断相接触而且可以检测人单克隆抗体对样品的特异性结合。如所属领域的技术人员根据所用检测方法的格式所决定的，所述连接可以是活体内或活体外的。可以由上述的免疫测定来测定人单克隆抗体对样品的特异性结合。所述免疫测定包括(例如)活体内和活体外免疫测定。活体内免疫测定包括(例如)辐射成像(radioimaging)。所述方法包含将个体内的样品与本发明的单克隆抗体相接触，并通过(例如)射线照相成像来检测特异性结合。活体外免疫测定及包括定性测定也包括定量测定，诸如(例如)上文所述的免疫组织化学、免疫荧光法、放射性免疫测定、FACS分析、免疫点墨法、免疫沉淀及ELISA分析。
可以通过确定本发明的经特异性结合的人单克隆抗体或功能片断与正常细胞相比较存在或处于增加的含量来确定存在赘生性细胞。如上所述，所属领域的技术人员可能会确定适当的正常细胞用来与特定类型的赘生性细胞相比较。
本发明进一步提供大体上纯净的人肿瘤特异性抗原。术语“肿瘤特异性抗原”用来指被人肿瘤细胞择优表达的抗原。术语“被人肿瘤细胞择优表达的”用来指由人肿瘤细胞表达并且由正常人体细胞以大体上更低的水平表达的肿瘤特异性抗原。所述表达本发明的肿瘤特异性抗原的肿瘤细胞可以是(例如)乳房、肺部或卵巢组织源的肿瘤细胞。
本发明的人肿瘤特异性抗原与本发明的人单克隆抗体特定反应。所述抗原可与(例如)由LH11238、LH13、H1140、H2420或H935杂交瘤细胞系所产生的人单克隆抗体或功能片断进行特定反应。所述抗原也可以与具有至少一个具有选自由下列SEQ IDNO组成的群组的序列的CDR氨基酸序列的CDR的人单克隆抗体或功能片断进行特定反应2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，或者与具有至少一个大体上具有SEQ ID NO6或SEQ ID NO8的CDR氨基酸序列进行特定反应。与LH11238人单克隆抗体或其片断的变体反应的抗原是与正常人纤维原细胞、外周血淋巴细胞、黑素瘤细胞或肺部癌细胞相比较存在于细胞表面和在乳房及卵巢癌细胞的溶酶体间室中的蛋白质。与LH13人单克隆抗体反应的抗原是由与正常纤维原细胞或黑素瘤细胞相比较的乳房、肺部及卵巢癌细胞产生的分泌型糖蛋白。在实例中描述了LH11238和LH13抗原进一步的特性。
本发明的人肿瘤特异性抗原可有利地用于癌症的治疗和诊断中。例如，可使用所述抗原以生成用在治疗和诊断程序中的特异性结合人肿瘤特异性抗原的额外结合剂。所述结合剂能(例如)抑制或刺激肿瘤特异性抗原的功能、或调节免疫系统，以使赘生性细胞受生长-捕获或灭活。也可以使所述结合剂共轭到诸如(例如)细胞毒素剂或细胞抑制剂的标记物上，其引起肿瘤细胞的死亡或捕获。结合到本发明的肿瘤特异性抗原的有用试剂包括(例如)配位子、受体拮抗剂及抗体。也可以在癌症治疗中通过对患有癌症或具有发展出癌症危险的患者用有效量的抗原进行预防接种来使用大体上纯净的肿瘤特异性抗原。随预防接种之后，个体的免疫系统将能够预防、减少表达所述抗原的赘生性细胞的增生或消除该赘生性细胞。
也可以在检测肿瘤特异性结合剂(如本发明的人单克隆抗体或功能片断)的结合的方法中有利地使用本发明大体上纯净的肿瘤特异性抗原。例如，可以在如竞争ELISA的免疫测定中使用所述抗原。
可以使用所属领域中熟知的免疫亲合性程序，通过(例如)筛检一板(panel)人肿瘤细胞来鉴别出用于分离本发明大体上纯净的抗原的适当起始材料。例如，如实例II所述，可以使用ELISA分析以确定用于随后提纯作用的抗原的有用细胞源。抗原的有用细胞源可以是(例如)乳房、卵巢或肺部恶性肿瘤。用于提纯肿瘤特异性抗原的特别有用的启示材料为H3396乳癌细胞系。
用于分离大体上纯净的抗原的适当方法取决于所述抗原的细胞定位。例如，可以在赘生性细胞的分泌型培养基、细胞表面膜、液胞膜、细胞质、或细胞核中主要表达本发明的抗原。可以通过(例如)所属领域中的免疫测定来确定抗原的细胞定位。例如，如实例IV和VI所述，可以使用间接免疫荧光法和ELISA分析来建立抗原的主要定位。
可以通过所属领域中已知的免疫亲合性程序来监控对抗体的提纯。监控提纯的尤其有用的方法包括(例如)ELISA分析和免疫点墨法。
可以通过所属领域中熟知的生化程序从特定来源提纯肿瘤特异性抗原。例如，提纯可包括离心法、色谱分析法、电泳法及免疫亲合性方法，而且其可由所属领域的技术人员依据特定抗原的特征来进行选择。可以使用离心法来集中或富集含有丰富量的抗体的亚细胞部分。所述亚细胞部分程序在所属领域中为人所熟知。色谱分析法在所属领域中也为人所熟知，且包括基于抗原的尺寸或对特定树脂的不同亲合性将其从污染物中分离的方法。所述树脂可包括(例如)尺寸排斥树脂、离子交换树脂、及凝集素柱。如实例VI所述，用于提纯本发明的抗原的尤其有用的树脂是Q SEPHAROSE FAST FLOW琼脂糖树脂。电泳法在所属领域中也为人所熟知，且包括经由(例如)丙烯酰胺或琼脂糖凝胶的一维和二维电泳。免疫亲合性方法在所属领域中也为人所熟知且包括经共轭到本发明的人单克隆抗体的化合物。为免疫亲合性提纯肿瘤特异性抗原而共轭到抗体上的有用化合物包括色谱树脂和蛋白质A。
因此，跟随熟知的生化程序，所属领域的技术人员能很容易的分离本发明的大体上纯净的肿瘤特异性抗原以用于治疗和诊断程序中。
也可以通过所属领域的技术人员熟知的重组法从编码本发明的肿瘤特异性抗原的核酸制备本发明的大体上纯净的肿瘤特异性抗原。
本发明提供编码人肿瘤特异性抗原的经分离的核酸。可通过所属领域的技术人员熟知的方法来分离编码人肿瘤特异性抗原的核酸。所述方法包括(例如)使用本发明的单克隆抗体来筛检表达库。
其它方法包括(例如)使用退化的低聚核苷酸作为杂交探针来筛检cDNA或染色体组库。可通过将本发明的经分离的肿瘤特异性抗原或其片断微序列化来确定所述退化的低聚核苷酸序列。用于产生肿瘤特异性抗原的核酸的所属领域的技术人员所熟知的其它方法包括(例如)使用从本发明的肿瘤特异性抗原的氨基酸序列所获得的退化的低聚核苷酸引子来进行的聚合酶链反应(PCR)。可以依靠PCR从仅仅单个基因拷贝开始按指数规律放大想要的序列。上述方法为所属领域的技术人员所知且描述于(例如)Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory ManualCold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1992)以及其中所引用的文献和Ansubel等人，Current Protocols inMolecular Biology.John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1989)；以及Harlow等人，AntibodiesA Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1989)。这些文献和其中所引用的出版物以引用的方式并入本文中。
应理解本文所提供的本发明的定义范围内也包括大体上不影响本发明的多种实施例的活性的改质。因此，下列实例用来说明而非限制本发明。
实例I产生肿瘤特异性人单克隆抗体这个实例显示了分泌与肿瘤细胞特定反应的人单克隆抗体的杂交瘤的生产。描述了一种在无限增生化作用之前用肿瘤细胞或细胞膜使正常淋巴细胞活体外免疫化的程序。这项程序允许对产生新颖肿瘤-活性人单克隆抗体的淋巴细胞进行富集。这些人单克隆抗体将有利于癌症免疫治疗和免疫诊断程序。
如下列步骤制备淋巴细胞。将脾组织从意外受害者分离出来、打碎、并强行通过no.50金属网线筛(Bellco，Vineland，NJ)。通过在250xg上离心10分钟来收集细胞并由氯化铵溶解来移除RBC。剩余的细胞经洗涤、在冷冻剂(40％RPMI、50％FCS及10％DMSO)中以100到300×106个细胞/ml的浓度再悬浮、以1.5-ml等分量经冷冻，以及在液氮中贮藏。粘附细胞和淋巴细胞两者都通过这个程序来分离。
接着如下述建立经混合的淋巴细胞反应(MLR)。将来自两种不同供体的经冷冻的单胞脾细胞制剂(如上所述)通过在37℃下轻微摇晃来解冻、用RPMI洗涤两次、以及通过在250xg上离心10min来收集。在第二次洗涤后，将来自每一个来源的3×106个脾细胞组合到含有pH 7.4的1.5mM HEPES(FisherScientific)、10％FBS(HyClone)、2mM L-谷氨酰胺、非基础氨基酸、1mM丙酮酸钠、及100μg/ml庆大霉素硫酸盐的2ml RPMI中，并且被放置在24-孔组织培养皿中。这项MLR连同抗原性刺激(如下所述)从内部产生了所要的淋巴因子。
接着用经丝裂霉素处理的H3396肿瘤细胞、来自H3396细胞的质膜制剂、或经多聚甲醛固定的H3922肿瘤细胞刺激MLR培养物。H3922和H3396是从人乳腺癌的移位变化来建立的经培养的细胞系，其可在培养物中移植并保存。每一个细胞系都衍生自不同的移植。
按下文制备经丝裂霉素处理的H3396细胞。将H3396细胞放置到24-孔组织培养皿中、生长至融合、且用0.1μg/ml丝裂霉素C处理12-15h。这个浓度用大约几天来捕获肿瘤细胞系中的细胞分裂。经12-15h培育后，移除含有丝裂霉素C的培养基而且将细胞用2ml磷酸生理食盐水(PBS)洗涤。
在移除培养基后，通过在25℃下在2％多聚甲醛的PBS溶液中培育细胞15min来制备经多聚甲醛固定的H2922肿瘤细胞。接着在使用前用PBS洗涤所述细胞四次。
如下文分离来自H3396细胞的质膜。将十个汇合的H3396细胞的150-mm盘的每一个用10ml冰冻的(Tris缓冲液)TBS漂洗两次并在含有1μg/ml亮肽素、1μg/ml抑胃肽、及2mM AEBSF的(Tris生理盐水)的2ml/150-mm盘中收获。在15ml杜恩斯均质器(Dounce homogenizer)中使用A型捣锤用40次敲击将细胞打破。在4℃下以800xg将溶解产物离心5min以移除未被打破的细胞和细胞核。保留上清液并将球粒在0.5体积的TS缓冲器中再悬浮、均匀化以及在800xg离心。将上清液与第一上清液组合并在4℃下以10,000xg离心2h。抛弃上清液且将球粒再悬浮于2ml水中。使用2ml杜恩斯均质器和B型捣锤以再悬浮薄膜球粒。在6.4％聚合物系统中在冰上通过将2.56ml20％右旋糖苷、1.28ml 40％的聚乙二醇、pH 7.2的0.20ml 0.2 M磷酸钾、0.8ml1M蔗糖、2.16ml水进行混合来进行膜的相分离。向这个混合物中添加1ml薄膜而且将试管颠倒翻转20次。通过在4℃下以800xg离心5min来分离各相。排出上层相并将其与从空白(水)样品恢复的低层相。同样地，将包括在界面的材料在内的低层相与从空白样品恢复的上层相混合。将两相混合、颠倒翻转20次、并在4℃下以800xg离心5min来进行分离。将从两个样品的上层相恢复的材料组合，用TBS把体积调整到21ml，通过在4℃下以10,000xg离心2h来收集膜。抛弃上层液并用2ml杜恩斯均质器和B捣锤在1-2ml含有蛋白酶抑制剂的TS缓冲液中再悬浮球粒。在4℃下贮藏所述膜12h，之后通过在4℃下以800xg离心10min来从上层液分离不溶性物质。在1-2ml含有蛋白酶抑制剂的TS缓冲液中第二次悬浮所述球粒且将其作为悬浮液在4℃下贮藏。将所述上层液称为部分1而把经再悬浮的微粒物质称为部分2。通过测量5′-核苷酸酶或磷酸二酯酶活性来确定把部分1中的质膜富集到大于10倍。所述制剂具有最小的依赖于琥珀酸酯的细胞色素C还原酶(线粒体)活性、或依赖于NADPH的细胞色素C还原酶(内质网)活性。
通过用以下物质中的一种培育三天来使MLR培养物活体外免疫经丝裂霉素C处理的H339S细胞单层、经多聚甲醛固定的H3922细胞单层、5mg来自H3396细胞的质膜部分1、或10mg来自H3396细胞的质膜部分2。
通过两种可供选择的方法中任一种来使经活体外免疫的淋巴细胞无限增生化。在第一种方法中，用K6H6/B5杂交瘤细胞融合淋巴细胞。在RPMI和DMEM的Iscoves改质物的1∶1混合物中搅拌培养来供养K6H6/B5细胞，所述混合物用10％FCS、1％非基础氨基酸、2mM谷氨酰胺、及1mM丙酮酸钠。将大约4×106个淋巴细胞与2×106对数相K6H6/B5细胞组合并用RPMI洗涤两次。经1min添加35％聚乙二醇(大约m.w.1450)和7.5％DMSO的混合物1ml，接着用RPMI逐渐稀释到4ml且接着用补充了10％FCS的RPMI稀释到16ml。接着把淋巴细胞浓度调整到5×104个细胞/ml，而且在含有HAT(13.6μg/ml次黄嘌呤，3.8μg/ml胸腺嘧啶脱氧核苷，1μg/ml偶氮丝氨酸)和1.0μM乌巴因(ouabain)的杂交瘤培养基(用10％FCS、非基础氨基酸、2 mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、pH 7.4的15mM HEPES、及0.1mg/ml庆大霉素来补充的RPMI)中将0.2ml细胞接种到96-孔培养皿中以挑选出未经融合的细胞如下文所述筛检的反应性，并且放大所关心的克隆。使用这种一步的无限增生化方法，每106经融合的淋巴细胞产生10-50个杂交瘤细胞；然而，经过三轮细胞培养后仅有5％所关心的克隆是稳定的。由这项无限增生化程序获得了杂交瘤细胞克隆H1140、H2420及H935。
在致力于提高克隆稳定性的过程中，评价了用于使经活体外免疫的淋巴细胞无限增生化的第二种两步方法，其涉及首先用EBV转化细胞且接着用K6H6/B5杂交瘤细胞融合所关心的克隆。将等体积的淋巴细胞(8×104个细胞/ml)和经EBV转化的1A2/C7细胞(8×106个细胞/ml)组合而且通过添加杂交瘤培养物使总体积加倍。添加次黄嘌呤、胸腺嘧啶脱氧核苷及偶氮丝氨酸以使得它们的最终浓度分别为13.6μg/ml、3.8μg/ml、及1μg/ml。在96-孔细胞培养皿的每一个孔中沉积两百微升的所述细胞混合物以在每一个孔中产生最终总共4000个的淋巴细胞和1×105个1A2/C7细胞。每三天用杂交瘤培养基-HAT饲养所述细胞且在2周后能看见细胞群体时测定抗体产物(描述于下文)。
用EBV转化淋巴细胞生成比用杂交骨髓瘤细胞系融合淋巴细胞所获得的分泌抗体克隆更高百分比的抗体分泌克隆(每106个淋巴细胞50-100个分泌抗体克隆)。然而，类淋巴母克隆一般分泌更低水平的抗体(小于10μg/ml)，而且如用杂交瘤所观察到的，其显示出很差的长程稳定性(经过三轮放大所关心的初始克隆约5％是稳定的)。为处理这些局限性，在多轮放大前，如上所述用K6H6/B5细胞来融合肿瘤反应性类淋巴母克隆。
从类淋巴母细胞形成杂交瘤细胞提高了稳定性以使得在融合后经过三轮放大40％的类淋巴母克隆保持稳定。跟随用杂交骨髓瘤细胞系进行的融合作用之后的EBV转化作用的组合导致与单独利用任何一个途径所获得相应淋巴细胞的的无限增生化频率更高的无限增生化频率。此外，这些克隆一般分泌出大于20μg/ml的抗体。通过这个两步无限增生化方法产生出杂交瘤克隆LH11238和LH13。
用于产生杂交瘤细胞系H1140、H2420、H935 LH11238及LH13的免疫化和无限增生化条件总结于表2中。
表2用于生成产生肿瘤特异性人单克隆抗体的杂交瘤细胞系的免疫化和无限增生化条件

最初使用ELISA测定筛检了来自经无限增生化的淋巴细胞的培养物上清液对活的原生肿瘤细胞单层的反应性。这保证了反应性抗体识别出表面抗原，而且也避免了与筛检固定细胞相关联的人工产物。在96-孔细胞培养皿中沉积肿瘤细胞，其细胞浓度足以在12-24h后产生90-95％的汇合单层。刚好在使用前移除培养基并将来自杂交瘤细胞或经EBV转化的细胞的50μl上清液添加到孔中且在4℃下培育2h。用50μl新鲜的杂交瘤培养基培育对照孔(背景)。
随培育之后，吸出上清液且用200μl PBS漂洗细胞三次。接着用已在1％BSA-PBS中稀释1000倍的50μl山羊抗-人1g(H+L)碱性磷酸酯共轭体培育细胞1-2h。吸出检测抗体而且如上述轻柔漂洗细胞四次。在25℃下通过添加50μl 10mM酚酞单磷酸盐的0.2 M 2-胺基-2-甲基-1-丙醇溶液、pH 10.2的0.5MTris、0.1％叠氮化钠调成来培养此等盘1h。通过添加pH 10.2的50μl 30mMTris、15mM EDTA来终止该反应并在560nm处测定吸光度。这项测定的背景值一般为A560＜0.060。选择具有4倍于背景或更大的克隆体用于进一步进行表征。
还分析了展示出与H3396细胞的反应性的抗体用来结合经固定的HF235正常人纤维原细胞。在移除培养基后，在2％多聚甲醛的PBS溶液中在25℃下固定HF235细胞。接着在使用前用PBS洗涤所述细胞四次。对于用经固定的纤维原细胞的ELISA背景值一般为A560＜0.080。把与纤维原细胞的最小反应性定义为在背景上小于2倍的结合性。
为了确定由杂交瘤产生的同型抗体，用0.5μg/ml的山羊抗-人IgM或山羊抗-人IgG涂覆微量滴定盘。用山羊抗-人Ig碱性磷酸盐共轭体来检测抗体结合性。当上清液用捕获抗体的一个产生一个正信号时终止测定的进行。同样地，通过用适当的重链试剂捕获抗体并用山羊抗-人γ或κ链特异碱性磷酸酶共轭。
类似地进行免疫球蛋白的定量，除了连续稀释含有未知量的Ig的上清液直到无法检测出反应性。从落在标准曲线的线性范围内的稀释液值来计算出Ig浓度，由在0.01到2.0μg/ml范围内使用的经提纯的多克隆人IgM的标准样品来定义该标准曲线。
通过在800xg离心10min和通过经0.45μm醋酸纤维素过滤器过滤来进行的分类，从LH11238杂交瘤上清液中沉淀出免疫球蛋白。将上清液放置在透析管(Mr分离点12-14kDa)中并通过用敌草快(Aquacide)(Calbiochem)涂覆该管并在4℃下放置6-8h将其浓缩两到四倍。移除多余的敌草快，漂洗透析袋，并相对冰冻蒸馏水的多重变化而透析样品12-24h。通过在10,000xg离心30min来收集经沉淀的抗体。移除上清液并在最小体积的经浓缩10倍的暖PBS中再悬浮球粒。在溶解大多数球粒后，把缓冲液浓度调整到PBS而且通过在10,000xg离心30min来移除不可溶物质。可能类似地在低离子强度缓冲液中沉淀抗体H1140、H2420及H935。因此，为了获得经浓缩的抗体，利用YM-30膜以Amicon仪器来减少经澄清的上清液体积。通过此项途径将抗体浓缩大于50倍。
百分之五的经筛检的杂交瘤(372/7216)结合了大于背景四倍的肿瘤表面抗原。这些372个克隆体中的55个(15％)产生了明显不结合纤维原细胞的抗体。虽然从未用肿瘤细胞或膜部分培育的的对照MLR中分离出大量分泌抗体的杂交瘤，这些抗体中没有一个显示出优先肿瘤反应性。产生出显示肿瘤特异性的抗体的大约20％(11/55)的杂交瘤经过在培养物中的多重放大是稳定的。这些克隆体中的五个分泌出大于20μg/ml的抗体。表2中总结了这些克隆体的特性。所有这五个抗体是IgM同型的而且表现出如测定在H3396细胞经固定的单层所确定的免疫反应性。从所使用的每一个培养物条件和无限增生化程序中生成至少一个抗体。进一步(下文)表征了表现出最大免疫反应性的两个抗体LH13和LH11238。
由杂交瘤细胞系H1140、H2420、H935 LH11238及LH13所产生的肿瘤特异性人单克隆抗体的特性总结于表3中。
表3肿瘤特异性人单克隆抗体的特征

a分泌水平为从最终培养物的上清液所获得的标准值b免疫反应性(AA560/[(μg Ig)(min)]在汇合的经多聚甲醛固定的H3396单层上测定并将其规格化到H1140的免疫反应性c沉淀作用表示能(+)或不能(-)在低离子强度缓冲器中沉淀抗体总之，这个实例表示未经激发的人免疫组成部分(来自非荷瘤患者的脾细胞)可用于生成与新颖的肿瘤抗原反应的人单克隆抗体。用全部肿瘤细胞或衍生自肿瘤细胞的膜部分的任一种经由刺激MLR培养物来达到这个目的。通过生成肿瘤特异性抗体以及通过缺乏来自未经肿瘤细胞或膜部分处理的培养物的肿瘤特异性抗体而展示出抗原刺激的特异性。
实例IILH13和LH11238抗体的免疫反应性这个实例显示了LH13和LH11238抗体与一板人肿瘤细胞的免疫反应性。
为了将LH13和LH11238抗体用于免疫诊断和免疫治疗的目的，需要鉴别表达相应抗体的肿瘤类型的范围。肿瘤细胞系为相应肿瘤类型的代表，而正常的纤维原细胞为非-赘生性细胞组织的代表。从黑素瘤、肺癌、卵巢癌和乳房癌衍生出肿瘤细胞系。测试了本发明的人单克隆抗体与人癌细胞系和正常纤维原细胞两者的免疫反应性。
H3396、H3464、H3477及H3922是从人乳腺癌的移位变化建立的经培养的细胞系，它们被移植并保存于培养物中。H2981和H2987是从人肺癌建立的经培养的细胞系，它们被移植并保存于培养物中。H3639和H3723是从人卵巢癌建立的经培养的细胞系，它们被移植并保存于培养物中。每一个细胞系衍生自不同的外植体。通过用经固定的肿瘤细胞单层培育宽范围的抗体浓度，由上述的ELISA程序来测定免疫反应性。用饱和量的检测抗体来测量抗体结合性。在测定的线性范围内以AA560/[(μg Ig)(min)]测量抗体结合性。肿瘤特异性人单克隆抗体针对一板肿瘤和正常细胞的免疫反应性示于表4中。
表4针对肿瘤和正常细胞的人单克隆抗体LH13和LH11228的免疫活性


a所示大体的免疫反应性依据用0.1％毛地黄皂苷进行的细胞渗透作用如表4中所示，LH13在肿瘤细胞板上显示出具有高(H3723和H3396)、中(H2981和H3464)、及低(H3477)免疫反应性的宽阔的交叉-反应性。LH13抗原在无损伤的正常纤维原细胞(HF285)、黑素瘤(H2669和H3774)上缺乏或以无法检测的水平存在，而且测试了几个无损伤的癌(H3922、H2987、及H3639)。缺乏与H3922细胞的反应性尤其令人吃惊，因为LH13是从已经用H3922细胞刺激过的淋巴细胞中分离出来的。为了更进一步检测这个结果，用0.1％毛地黄皂苷渗透每一个细胞系并重新检测它们的反应性。当测定完整细胞时完全为阴性的的两个细胞系H3922和H3639在抗体可以到达细胞内间室的条件下结合LH13抗体。而且，当非-渗透条件下进行测定时，具有中等LH13免疫反应性的H2981细胞在渗透条件(免疫反应性大于7.0)下具有高反应性。在0.1％毛地黄皂苷的存在和缺乏下，由于在培育过程中从细胞培养皿细胞损失有差异，所获关于免疫反应性的数据不能直接加以比较。
LH11238显示出相似的反应性分布，虽然它的免疫反应性程度总是大大小于LH13抗体的免疫反应性程度。用无损伤的H3396、H3464、H3477、H3639、及H3723观察反应性。其它受测试的细胞是阴性的，包括纤维原细胞和癌细胞系。基于用LH13和LH11238对每一个细胞系所制作的免疫反应性测定，这些抗体看起来不可能识别出相同的表位。例如，LH13显示出与H2981肺部癌细胞系中等的免疫反应性而没有检测出LH11238对此细胞系的结合。同样地，LH11238结合了无损伤的H3639卵巢癌细胞，虽然不可能在同样的培育条件下检测出LH13的结合性。
实例IIILH13和LH11238人单克隆抗体的结合活性此项实例显示了人单克隆抗体LH13和LH11238与正常细胞和肿瘤细胞的结合活性。
为了测定人单克隆抗体与肿瘤细胞和正常细胞的免疫反应性，使用了流式细胞测量术(FACS分析)。选择了H34S4乳癌细胞是因为通过ELISA分析它们既表达了LH13又表达了LH11238抗原而且作为单细胞悬浮液很容易被分离出来。也检测正常的外周血淋巴细胞来代表正常组织。Facs分析额外地允许关于抗原表达的细胞群异质性。
用胰蛋白酶或乙二胺四乙酸钠(EDTA)从培养皿中移除H3464细胞，将其用PBS洗涤、在肿瘤培养基中以2×106个细胞/ml再悬浮，且在37℃下恢复2h。用1×106个肿瘤细胞以50μl的总体积于冰块上在5.0μg/ml培育抗体30min。将细胞用1.0ml冰冻PBS洗涤一次，用稀释于1％BSA-PBS的经2μg/ml FITC标记的山羊抗-人IgM在冰块上培育30min，并且再用1.0ml冰冻PBS洗涤一次。用Becton Dickinson FACSort分析结合到细胞上的抗体。与ELISA结果相一致，用LH11238和经FITC标记的抗人IgM来培育的H3464细胞表现出相对于不相干的对照人IgM移动的染色图案(图1A)。受测试的大于90％的细胞结合了LH11238，尽管所观察到的宽范围荧光强度与抗原在这些肿瘤细胞的异源表达水平相一致。用H935、H2420、及H1140也观察到相似的FACS染色分布。
令人惊讶的是，如ELISA所测定(表4)在H3464细胞上比LH11238反应性大23倍的LH13抗体几乎不表现出移位(图1B)。为了确定LH13抗原是否对用于分离分析用(胰蛋白酶)的肿瘤细胞的蛋白水解作用条件尤其敏感，允许细胞随分离之后有更长的恢复时期或者利用非-蛋白水解的细胞分离方法，如乙二胺四乙酸钠(EDTA)释放。这两种方法都没有导致肿瘤细胞显著更大的染色。
正常人细胞的Facs分析(如外周血淋巴细胞)对每一个受测试的抗体是阴性的，其与用正常纤维原细胞所获得的ELISA结果相一致。
实例IVLH11238抗原的表征这个实例描述了LH11238抗原的亚细胞表征。上文所述对活细胞的ELISA筛检和FACS分析都表现出LH11238抗原在肿瘤细胞质膜上的表达。然而，这些途径没有检测抗原在癌衍生细胞的细胞内结构上的分布。使用了免疫荧光法分析以检测LH11238抗原的细胞内定位。
在使用前一天在12-mm圆盖玻片上接种了H3464细胞单层并将其用2％多聚甲醛的PBS溶液在25℃下固定15min。将细胞用PBS漂洗两次并用稀释于1％BSA-PBS(未经渗透的)或含有0.1％毛地黄皂苷的1％BSA-PBS(经渗透的)的50μl/ml抗体在4℃下来培育细胞2h。将细胞用PBS漂洗两次并接着在暗处在与原发抗体相同的缓冲液中以1∶500稀释的经FITC标记的山羊抗-人IgM来培育该细胞。用PBS漂洗细胞4次而且将盖玻片安装在Fluoromount-G(Southern Biotechnology)。用装配有表面荧光(epifluorescent)的光学器件和Olympus Splan 40X(NA 0.70)物镜的Olympus显微镜来使细胞显像。用LH11238抗体染色的未经渗透的、经多聚甲醛固定的H3464细胞显示出与定位到质膜相一致的表面染色。与FACS分析相一致，大于70％的经固定的H3464细胞结合了LH11238。当H3464细胞经过渗透以允许到达细胞内结构时，观察到点状的、细胞核外周围的染色。结合到H3464细胞的LH11238是特异性的，因为用不相关同型和浓度匹配的人抗体进行的对照培育没有染色未破损的或经0.1％.毛地黄皂苷渗透的细胞。在经渗透的细胞上观察到的点状的、细胞核外周围的染色暗示了抗原在溶酶体中的定位。为验证这个结论，将细胞用对一种已知的溶酶体糖蛋白CD63的抗体染色。用对CD63的抗体培育H3464细胞所染色的细胞内结构类似于那些用LH11238标记的细胞内结构，其与细胞内LH11238的溶酶体定位相一致。
基于这些结果得出结论LH11238抗原既存在于质膜上又存在于H3464细胞的溶酶体中。
实例VLH11238抗原的内在化这个实例显示LH11238抗原从质膜内在化到溶酶体间室。
上文所述的免疫荧光法实验表明LH11238抗原既存在于细胞表面又存在于肿瘤细胞的溶酶体中。可能由在溶酶体和细胞表面共表达的LH11238抗原或由被内在化到核内体/溶酶体间室而产生了双重定位。为了确定LH11238抗原是否被内在化，进行了免疫荧光定位程序的修改。
把活H3464细胞单层速冻在冰上30-60min以完全抑制胞吞作用。接着将细胞洗涤、用LH11238抗体培育、再次洗涤、并用经FITC标记的山羊抗-人IgM抗体培育。在所有进行的步骤中一直保持细胞的温度在4℃下以保证完全抑制胞吞作用。接着用预暖过的细胞培养基将细胞转移到37℃下。在不同的时间间隔处将细胞转移回4℃下并用2％多聚甲醛加以固定。最初观察到扩散的表面染色，其与用未经渗透的固定细胞所观察到的一样。在37℃下10min后，观察到LH11238抗体在细胞表面的多个位点的簇集。用更长的培育时间，LH11238首先定位到细胞表面的几个位点上，且接着开始进行内在化。如果用不相关的原发抗体培育细胞、仅用二级抗体培育细胞，或者如果在实验过程中将细胞维持在4℃下那么没有观察到这些染色图案。这些结果与LH11238结合并通过H3464细胞被内在化的LH11238相一致。
总的来说，首先基于未破损细胞的ELISA分析、活细胞的FACS分析、及使用未经渗透的细胞进行的免疫定位来表征LH11238抗体。然而，用经渗透的细胞进行的进一步免疫定位研究说明这种抗体的一部分还定位于点状的细胞核外周围间室。用经抗-CD63抗体(一种溶酶体蛋白质)培育的细胞观察到相似的染色。这个结果与LH11238抗原在质膜和在溶酶体中的双重定位相一致，说明结合到活细胞表面的抗体被内在化了。先前已经观察到肿瘤抗原对质膜和溶酶体的双重定位。例如，BR96抗体在未破损肿瘤细胞的表面上结合与溶酶体相关联的膜蛋白质lamp-1，尽管lamp-1通常是主要位于溶酶体间室的完整膜蛋白质。另外，也已经证明了从肿瘤细胞分泌出升高水平的可溶性蛋白质，如组织蛋白酶(cathespin)B、D、及L。分泌出的组织蛋白酶D的一部分被甘露糖6-磷酸盐受体结合并内在化。目前还不清楚LH11238是否可溶或是完整的膜蛋白质。然而，在细胞抽提物的TX-114相分离的可溶性部分中发现了该抗原，这和LH11238与膜相关联相一致而与完整的膜蛋白质相反。
实例VILH13抗原的表征这个实例显示了LH13抗原的定位。
当如上文所述，在经固定的由癌衍生的细胞系单层上通过ELISA分析LH13抗体时，其展示出有效的免疫反应性。然而，FACS分析暗示出LH13仅很少地结合到细胞表面上。进一步的ELISA分析说明LH13抗原主要存在于当用0.1％毛地黄皂苷处理细胞时仅可到达抗体的间室内。为进一步检测LH13抗原在亚细胞间室内或在分泌出培养基中的表达，采用了免疫荧光分析和直接ELISA分析。
为了检测LH13抗原的亚细胞定位，在如上文所述的经多聚甲醛固定的H3464细胞上进行免疫荧光法。用未经渗透的H3464细胞培育LH13抗体(如上文所述使用LH11238抗体)导致细胞表面的轻微染色，其与通过FACS分析所观察到的微小移位相一致。用经渗透的H3464细胞通过免疫荧光法来培育LH13抗体结果检测不到染色。可能是几乎没有LH13与H3464细胞的细胞内结构相关联或是LH13的细胞内形式没有被这个细胞系中的抗体识别到。
这些结果也不能说明主要分泌LH13抗原。为了观察分泌出的LH13抗原，将恒量的LH13抗体(0.01ug/ml)稀释于已经从H3396细胞的汇合单层中移除出来的增加量的培养基中(条件培养基)。接着检验条件培养基对经固定的H3396单层的结合性。增加条件培养基的浓度观察到LH13抗体对该单层的结合性适当减少(大约15％)(图2A)，其与存在于所述培养基中的LH13抗原相一致。
使用了直接ELISA格式以观察在H3396细胞的条件培养基中的LH13抗原。将条件培养基在96-孔细胞培养皿中于4℃下培育10-12h、移除出来，并且对于LH13抗体结合性检验经洗涤的孔。存在于从H3396细胞所获得的条件培养基中的抗原结合到培养皿而且很容易检测(图2B)。通过用细胞培养孔培育LH13抗体来展示出抗体结合的特异性，所述细胞培养孔已经用以下物质预处理过(1)来自表达不可检测量的LH13的肿瘤系(H3922)的条件培养基，(2)新鲜培养基(培养基)，或(3)无物质(空白)。这些预培育条件都没有导致结合到该孔的可检测到的LH13(图2B)。
总之，LH13抗原的表征说明这种抗体大多数被发现在条件培养基中。基于这一观察，总结出LH13是从肿瘤细胞分泌出来的。
实例VII提纯和进一步表征LH13抗原这个实例描述了LH13抗原的提纯和进一步表征。
如上所述，LH13抗原从乳房肿瘤细胞分泌出来并显示出对细胞培养皿惊人的高亲合性。这些观察说明可能会很容易地从H3396条件培养基中提纯LH13抗原，利用其对培养皿的结合作为监控其提纯的方式。一旦LH13抗原经提纯后，可以很容易测定其对各种试剂的敏感性以进一步表征其特性。
作为富集LH13抗原的第一步，使H3396细胞系适应于在用最小量的蛋白质补充的无血清的培养基[用TCH(Celox，规定的血清替代品)、2mM L-谷氨酰胺、非基础氨基酸、及1mM内酮酸钠补充的Iscove培养基]中生长。在这些条件下培养的细胞分泌出与在血清存在下培养的细胞相当水平的抗原。将条件培养基收集、统筹，而且用水把250ml稀释到1升以减少离子强度。将经稀释的培养基以3ml/min施加到已经用经浓缩0.25-倍(0.25X)的PBS均衡的Q SEPHAROSE FAST FLOW琼脂糖树脂的11cm×1.5cm柱上。由流过的部分缺乏反应性所示，大多数抗原结合到柱上。在用200ml 0.25X PBS洗涤该柱后，用从100％0.25X PBS至70％0.5M NaCl的0.25X PBS溶液的线性梯度以6ml/min的流速洗堤蛋白质。
用使用BSA作为标准的BCA蛋白质测定来测定柱馏分的蛋白质浓度。如下测定柱馏分的LH13抗原。将每个馏分在水中稀释10倍并将50μl/孔转移到无菌96-孔细胞培养皿中在4℃下培养12h。用PBS洗涤该盘两次并用稀释于1％BSA-PBS中的10μg/ml LH13抗体在37℃下培育2h。接着将该盘用PBS洗涤四次、用稀释1000倍到1％BSA-PBS中的山羊抗-人Ig碱性磷酸酶共轭在25℃下培育1h，并如上文所述进行发展。
大多数蛋白质在150mM和250mM NaCl中洗堤出来(图3，闭合环)，而大多数LH13抗原在250mM NaCl以上洗堤出来(图3，空心环)。顶点抗原馏分的特异活性(ELISA信号/[蛋白质])比起始物质大200倍。作为对照，用NaCl浓度范围(50mM到400mM)来稀释LH13抗原以测定离子浓度是否影响了对细胞培养皿的结合。为从柱上结合并洗堤LH13所施加的NaCl浓度范围不影响结合到细胞培养皿的抗原。因此，直接ELISA精确地反映了抗原在多种柱馏分中的分布。
通过在4-20％SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶上进行电泳来进一步分解柱馏分。考马斯亮蓝染色(Coomassie blue staining)揭示出在大多数反应馏分中的单一主要蛋白质，但各柱馏分的西方墨点(Western blot)不能将此鉴别为LH13-反应性抗原。
为了进一步表征LH13抗原，使用直接ELISA法检测其对各种处理的敏感性。如上所述将LH13抗原涂覆在细胞培养皿上并将其在各种条件下进行培育。用5mg/ml胰蛋白酶在37℃下培育LH13抗原30min。另一选择为，通过在用2U/ml唾液酸酶(Oxford GlycoSystems)、400U/ml糖苷内切酶-F/肽-N-糖苷酶F(Endo F，PNGase F)(Oxford GlycoSystems)、60mU/ml内-α-N-乙酰基半乳糖胺酶(O-聚糖酶)(Oxford GlycoSystems)、或2U/ml唾液酸酶加60mU/ml内-α-N-乙酰基半乳糖胺酶(唾液酸酶，O-聚糖酶)在37℃下处理24h前，用10％SDS+2％β-巯基乙醇在37℃下处理30min使LH13抗原变性。将培养皿用PBS洗涤三次并如上文所述估计LH13抗体结合性。将每一次处理的影响与在相同条件下单独用缓冲液处理的对照样品相比较(图4)。
用10％SDS+2％β-巯基乙醇、唾液酸酶、或内-α-N-乙酰基半乳糖胺酶(O-聚糖酶)处理LH13抗原对抗体的最终结合性几乎没有影响。在处理前使抗原变性或同时用两种糖苷酶进行处理不会影响抗原对用唾液酸酶和O-聚糖酶所作的处理的抵抗力。在直接ELISA中通过用胰蛋白酶(79％，图4)或用糖苷内切酶-F/肽-N-糖苷酶F(36％，未经显示)进行处理降低了抗体的结合性。抗体对在用糖苷内切酶-F/肽-N-糖苷酶F处理前用10％SDS+2％β-巯基乙醇变性的LH13的结合被进一步减小，与未经处理的样品相比较结合性减小75％(图4)。
由于糖苷内切酶-F/肽-N-糖苷酶F的特异性范围宽，不可能根据碳水化合物的结构来得到具体的结论。然而，LH13抗体的结合性完全不受用唾液酸酶所作的处理(其移除了N-酰基或O-酰基，非还原末端唾液酸)的影响。用内-α-N-乙酰基半乳糖胺酶所作的处理(其移除与丝氨酸或苏氨酸相关联的Galβ1-3GalNAc)、或用唾液酸酶和内-α-N-乙酰基半乳糖胺酶的组合所作的处理也不影响抗体结合。结合到抗原的抗体的胰蛋白酶敏感性说明该表位与蛋白质成分相关联。
总之，使用离子交换色谱法从不含H3396血清的条件培养基中提纯大于200倍的LH13抗原。初步研究表明经提纯的LH13抗原被排除在Superdex 75凝胶过滤柱外，其与大于70kDa的抗原相一致。用各种试剂处理结合到细胞培养皿的LH13抗原提供了证明说明碳水化合物和蛋白质成分都存在，且与表位对LH13抗体的结合或将LH13抗原结合到组织培养皿有关。目前不可能在这两种可能性之间作出区分。
实例VIII活体外抗体成熟这个实例展示了对抗体可变区的克隆、含有被克隆的可变区的变体的Fab库的合成、及用以鉴别具有改进的亲合性的变体的筛检。
LH13和LH11238的DNA排序展示出两种抗体的H链和L链与人胚系序列高度同源。LH11238 VH与胚系序列DP-63(VH4.21)相同而LH13 VH与DP-10/hv1051(Vh1-69)相同。而且，LH11238 VL与胚系序列DPK21/humkv328h5相同而LH13 VL与DPL16/VL3.1高度同源，在V-J连接处含有单核苷酸变化。抗体和胚系序列之间的高度同源表明抗体可能没有在细胞培养物中进行明显的亲合性成熟。为了通过蛋白质工程快速提高LH13和LH11238抗体的物理属性，如下所述将抗体克隆到细菌表达系统中。
如下文来克隆抗体VH和VL可变区域。从每一克隆体的5×107个细胞分离出总RNA而且制备出第一股cDNA。由PCR使用下组与人信号序列同源的5′引子和对应于人CH1的3′引子(5′-AGACGAGGGGGAAAAGGGTT-3′，SEQ IDNO47)来放大H链可变区ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGG(SEQ ID NO48)，ATGGACTGGACCTGGAG(G/C)(A/T/GJTC(SEQ ID NO49)，ATGAA(A/G)CA(C/T)CTGTGGTTCTT(SEQ ID NO50)，ATGGGGTCAACCGCCATCCTC(SEQ ID NO51)，ATGGGATGGAGCTGTATCATC(SEQ ID NO52)，ATGTCTGTCTCCTTCCTCATC(SEQ ID NO53)，及ATG(A/G)AC(C/A)TACTTTGTT(G/C)C(SEQ ID NO54)。使用一组对信号序列编码的5′引子(CT(C/T)CT(G/C)(G/T)(G/T)(G/C)CTCCTGCT(A/G)CTCTGG，SEQ ID NO55 和CT(C/T)CT(G/C)(G/T)(G/T)(G/C)CT(C/G)CT(G/A)(C/G/A/T)T(A/G)CTCTGG，SEQ ID NO56)和对应于恒定区氨基酸117-122的3′引子(CATCAGATGGCCGGGAAGAT，SEQ ID NO57)来放大K轻链可变区。类似地，使用一组编码信号序列的5′引子(ATG(A/G)CCTG(C/G)(A/T)C(C/T)CCTCTC(C/T)T(C/T)CT(C/G)(A/T)(C/T)C，SEQ ID NO58)和对应于恒定区氨基酸115-124的3′引子(CTCCTCAGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGAC，SEQ ID NO59)来放大λ轻链可变区。随PCR放大后，在琼脂糖凝胶上提纯DNA片断并将其克隆到pCR2.1载体(Invitrogen，Carlsbad CA)中。通过荧光二脱氧核苷酸终止法使用M13前置引子和反置引子(Perkin-Elmer，Foster City，CA)将每一个样品的多克隆体在两股上都进行排序。在一个序列中的特定位置上核苷酸之间的削减用以显示这些核苷酸在此位置上的等摩尔混合物。
为了将IgM转换成更有用的治疗性mAb，通过将H链可变区直接移植到γ1恒定区而使所述同型从IgM转换到IgG1。进行了活体外类别转换以提高对抗体效应物功能的控制并开发用于治疗性mAb的更好特征化的表达、生产、及提纯方法。通过杂交诱变将LH11238抗体的经克隆的VH和VL区域克隆到构造于人IgG CH1和KCL序列中的噬菌体载体M13IX104CS(描述于Wu等人J.Mol.Biol.294151-162(1999)和Kristensson等人，Vaccines 95.ColdSprings Harbor Laboratory Press，Cold Springs Harbor，NY第39-43页(1995))上(描述于Rosok等人，J.Biol.Chem.27122611-22618(1996))。将LH13抗体克隆到相同的载体上，该载体中K CL已经被λCL序列所取代。
为了在活体外快速提高抗体的亲合性，同时将改变表位特异性的潜在性最小化，合成和筛检了与母序列紧密相关的HCDR3和LCDR3变体库。在活体内存在多个机理，通过它们使引入HCDR3和LCDR3的多样性程度大于抗体的其它CDR中的多样性，其与这些在抗原识别中充当关键作用的区域相一致。而且，在未经相关的mAb的先前活体外亲合性成熟过程中，通常最大数量的有利突变位于HCDR3和LCDR3中。因此，初始库集中在H链和L链以及由单一氨基酸变化而从母序列变动的变体的第三CDR中。
使用Kabat等人supra的编号体统，为诱变LH13 CDR而选择的残基是L链CDR3(LCDR3)中Asn89至Va197和H链CDR3(HCDR3)中Glu95至Tyr102且为诱变LH11238 CDR而选择的残基是LCDR3中Gln89-Thr97和HCDR3中Glu95-Tyr102。如Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA956037-6042(1998)所述基于有利的LCDR3和HCDR3突变来合成初始库和组合LH13库且示于表5中。
表5序列抗体库 克隆体 重链CDR3轻链CDR3LH13 HCDR3 野生型EDS S G W Y H YS97G GS97T TS97N NLCDR3 野生型 NS R D S S G N P V VR91Y YR91F FV97Y YV97F F组合4DS TY4E2 TY F4H7 TF F4G11 F F3G4Y FLH1238 LCDR3 野生型 Q Q Y N N W P P Y T
Q89L LQS9G GQ89V VQS9F FQ89W HN93C CN94C CP95aFFP95aRR在这些偏倚组合库中的抗体变体每一个含有单个突变，而且在两个CDR的每个残基上引入所有20个氨基酸。因此，LH11238库含有228个(HCDR3)和190个(LCDR3)独特的非野生型变体而LH13库含有171个(HCDR3)和209个(LCDR3)个独特的变体。
如Wu等人，supra(1999)中所述在大肠杆菌(E.coli)XL1-蓝色细胞(Stratagene)中表达Fab而且如Watkins等人，Anal.Biochem，25337-45(1997)中所述从周缘空间分离出Fab并将其定量。在ELISA格式中筛检可溶性Fab。用山羊抗-人λ链碱性磷酸酶共轭检测了可溶性LH13 Fab对经部分提纯的LH13抗原的结合。如实例VII中所述部分地提纯LH13抗原。如Watkins等人，supra(1997)所述使用经固定的H3396肿瘤细胞来测定LH11238 Fab结合性。
如图5中(空心环)所示，经细菌表达的LH13和LH11238 Fab在ELISA中显示出相对低的反应性，其说明抗体没有在活体内进行显著性的抗体成熟作用。这些结果进一步与IgM分子的结合很大程度上受多价驱使的观察相一致。如图5A和5B中的空心环与空心方块的比较所示，偏倚组合库的筛检鉴别出含有单氨基酸变化的每个抗体的多个变体并显示出比野生型抗体大差不多100倍的结合性。在HCDR3和LCDR3中鉴别出了LH13抗体的有利突变。如图5A所示，克隆体S97N(填充环)和克隆体R91Y与LH13母体相比具有提高的结合性。如图5B所示，在包括克隆体N94C(填充方块)、克隆体N93C(空心三角)及克隆体P95aR(填充环)在内的LH11238的LCDR3中也鉴别出多个有利突变。
将显示出提高的结合性的变体排序以鉴别导致更高的亲合性的突变，且其也列在表5中。显示出最高结合活性的LH13变体(图5A，空心方块)在LCDR3中含有R91Y突变并具有约1.8nM的Kd。在亲合性上显示出最大增加量的LH11238突变体(图5B，空心方块)是LCDR3中Q89W突变的结果并具有约11nM的Ka。所述库的有限筛检鉴别出显示提高大于2倍的结合性的七个LH13变体和九个LH11238变体，他们全部都列在表5中。在HCDR3的S97与LCDR3的R91和V97处鉴别出LH13 CDR的有利突变，而改进的LH11238变体在LCDR3的Q89、N93、N94、及P95a处含有有利变化。这些结果说明在LH13的LCDR3中单一氨基酸变化提高了大于50倍的亲合性而LH11238的LCDR3中单一氨基酸变化提高了大于35倍的亲合性。合成出在LH13的HCDR3和LCDR3中都鉴别出的有利突变的组合库以组合个体突变和进一步提高抗体亲合性。该库含有个体突变的每一种可能的组合或在三个CDR位置(HCDR3的S97和LCDR3的R91与V97)的每一处的野生型氨基酸，其产生含有36个独特变体的库。如图5A中组合突变体4H7(填充方块)与LCDR3变体R91Y(空心方块)或HCDR3变体S97N(填充环)的比较所示，很容易鉴别出比含有单氨基酸变化的变体显示出更高亲合性的组合克隆体。组合突变体4H7具有约1.1nM的Kd。组合克隆体的DNA排序表明所有克隆体含有至少两个突变体(如表5所示)，而且两个克隆体(克隆体4E2和4H7)含有三个突变。所有的五个组合克隆体显示出比任何含有单一突变的变体更大的结合活性。
这个实例展示了通过在两步骤中合成仅有416个独特蛋白质变体来完成的LH13的亲合性成熟。如上文所陈述，第一步由筛检171个HCDR3突变体和209个LCDR3突变体组成接着在第二步中筛检36个组合变体。与之相反，在这项研究中显示出影响活性的三个CDR残基(LCDR3 S97、HCDR3 R91、及HCDR3 V97)的总随机化可能需要含有193、或6,859个变体的库表达。因此，本文所描述的结果表明亲合性的逐步提高夺取了独立突变的附加性并进一步提供了亲合性成熟的有效方法。
贯穿本申请案参考了多篇公开案。在本申请案中这些公开案的揭示内容以引用的方式全文并入本文中以便更充分地描述本发明在所属领域中的位置。
虽然已经参考所揭示的实施例来描述了本发明，所属领域的技术人员应轻易地了解到所祥述的具体实验仅为本发明的例证。应理解可作出多种修改而不背离本发明的精神。因此，本发明仅受上文所述权利要求的限制。
序列表<110>应用分子发展公司<120>肿瘤特异性单克隆抗体<130>66797-162(IX 5518)<140>PCT/US02/37134<141>2002-11-19<150>US 09/989,901<151>2001-11-19<160>59<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>417<212>DNA<213>类人<220>
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Leu Glu Ile Lys Arg115<210>4<211>117<212>PRT<213>类人<400>4Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>5<211>354<212>DNA<213>类人<220>
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20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat agc agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Ser Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>6<211>118<212>PRT<213>类人<400>6Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Ala Arg Glu Asp Ser Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>7<211>333<212>DNA<213>类人<220>
<221>CDS<222>(1)...(333)<400>7tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tet gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>8<211>111<212>PRT<213>类人<400>8Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser 6ly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>9<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(354)<400>9cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat ggt agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>10<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>10Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Gly Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>1l<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(354)<400>11cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Ash Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95
gcg aga gaa gat act agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Thr Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>12<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>12Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Thr Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>13<211>354<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体
<221>CDS<222>(1)...(354)<400>13cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg tcc48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc acg att acc gcg gac gaa tcc acg agc aca gcc tac240Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gaa gat aat agt ggc tgg tat cac tac tgg ggc cag gga acc336Ala Arg Glu Asp Asn Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110ctg gtc acc gtc tcc tca354Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>14<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>14Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Asp Asn Ser Gly Trp Tyr His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser115<210>15<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>15tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45
ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tat gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc 333Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>16<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>16Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>17<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>17tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc ttt gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>18<211>111
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>18Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>19<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>19tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg tat ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>20<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>20Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Tyr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
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<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>21tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc cgg gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
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<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>23tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30
agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tat gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>24<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>24Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95
Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>25<211>333<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(333)<400>25tct tct gag ctg act cag gac cct gct gtg tct gtg gcc ttg gga cag48Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15aca gtc agg atc aca tgc caa gga gac agc ctc aga agc tat tat gca96Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30agc tgg tac cag cag aag cca gga cag gcc cct gta ctt gtc atc tat144Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45ggt aaa aac aac cgg ccc tca ggg atc cca gac cga ttc tct ggc tcc192Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60agc tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act ggg gct cag gcg gaa240Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc ttt gac agc agt ggt aac ccc288Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95gtg ttt ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt cag ccc333Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110
<210>26<211>111<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>26Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln1 5 10 15Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala20 25 30Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr35 40 45Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu65 70 75 80Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Phe Asp Ser Ser Gly Asn Pro85 90 95Val Phe Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro100 105 110<210>27<21l>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>27ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96
Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ttg cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Leu Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>28<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>28Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Leu Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>29<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>29ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ggt cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gly Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>30<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>30Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gly Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>31<211>351<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>31ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gtg cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Val Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>32<211>117<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>重组变体<400>32Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Val Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>33<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>33ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144
Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ttt cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Phe Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>34<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>34Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95Phe Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>35<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>35ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc age agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95tgg cag tat aat aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336
Trp Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>36<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>36Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Trp Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>37<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS
<222>(1)...(351)<400>37ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat tgt aac tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Cys Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>38<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体
<400>38Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Cys Asn Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>39<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>39ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192
Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat tgt tgg cct ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Cys Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110etg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>40<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>40Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Cys Trp Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg
115<210>41<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>41ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg ttt ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351
Leu Glu Ile Lys Arg115<210>42<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>42Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro15 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>43<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>43ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48
Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg cgg ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>44<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>44Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg
20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>45<211>351<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>重组变体<221>CDS<222>(1)...(351)<400>45ctc tgg ctc cca gat acc act gga gaa ata gtg atg acg cag tct cca48Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg96Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30gcc agt cag agt gtt agc agc aac tta gcc tgg tac cag cag aaa cct144Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc tat ggt gca tcc acc agg gcc act192Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc agt ggg tct ggg aca gag ttc act240
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80ctc acc atc agc agc ctg cag tct gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt288Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95cag cag tat aat aac tgg cgt ccg tac act ttt ggc cag ggg acc aag336Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110ctg gag atc aaa cga351Leu Glu Ile Lys Arg115<210>46<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>重组变体<400>46Leu Trp Leu Pro Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg20 25 30Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro35 40 45Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr50 55 60Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr65 70 75 80Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Arg Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys100 105 110Leu Glu Ile Lys Arg115<210>47
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>47agacgagggg gaaaagggtt20<210>48<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>48atggagtttg ggctgagctg g 21<210>49<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>18<223>n＝g和c的摩尔混合物。
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<220>
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<223>引物<400>51atggggtcaa ccgccatcct c 21<210>52<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>52atgggatgga gctgtatcat c 21<210>53<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物
<400>53atgtctgtct ccttcctcat c 21<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>4<223>n＝a和g的摩尔混合物。
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<223>引物<221>misc_feature<222>3<223>n＝c和t的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>6，9<223>n＝g和c的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>7，8
<223>n＝g和t的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>18<223>n＝a和g的摩尔混合物。
<400>55ctnctnnnnc tcctgctnct ctgg 24<210>56<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>3<223>n＝e c和t的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>6，9，12<223>n＝g和c的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>7，8<223>n＝g和t的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>15，18<223>n＝g和a的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>16<223>n＝c，g，a，和t的摩尔混合物。
<400>56ctnctnnnnc tnctnntnct ctgg 24<210>57<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>引物<400>57catcagatgg ccgggaagat20<210>58<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<221>misc_feature<222>4<223>n＝a和g的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>9，24<223>n＝c和g的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>10，25<223>n＝a和t的摩尔混合物。
<221>misc_feature<222>12，19，21，26<223>n＝c和t的摩尔混合物。
<400>58atgncctgnn cncctctcnt nctnnnc27<210>59<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>59ctcctcagag gagggcggga acagagtgac 30
权利要求
1.一种经分离的人单克隆抗体或其功能片断，其包含具有大体上选自由下列SEQ ID NO所组成的群组的CDR的氨基酸序列的互补决定区10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中所述人单克隆抗体或其功能片断特异性地结合赘生性细胞或其抗原。
2.根据权利要求1所述的经分离的人单克隆抗体，其中所述功能片断选自由Fv、Fab、Fab′、或F(ab′)2组成的群组。
3.根据权利要求1所述的经分离的人单克隆抗体或功能片断，进一步包含标记物。
4.根据权利要求3所述的经分离的人单克隆抗体或功能片断，其中所述标记物含有细胞毒素剂或细胞抑制剂。
5.一种医药组合物，其包含根据权利要求1所述的经分离的人单克隆抗体或功能片断和医药载剂。
6.根据权利要求1所述的经分离的人单克隆抗体或功能片断，其包含三个互补决定区，它们具有大体上所陈述的在选自由下列SEQ ID NO所组成的群组的序列中的10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44。
7.根据权利要求1所述的经分离的人单克隆抗体或功能片断，进一步包含生理学上可接受的化合物。
8.一种经分离的CDR或其功能片断，包含大体上选自由下列SEQ ID NO所组成的群组的CDR的氨基酸序列10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44，其中所述CDR或其功能片断特异性地结合赘生性细胞或其抗原。
9.一种编码人单克隆抗体或其功能片断的经分离的核酸，其包含大体上编码如下CDR的氨基酸序列的核苷酸序列，该CDR经选自由以下SEQ ID NO所组成的群组的核苷酸所编码9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
10.根据权利要求9所述的经分离的核酸，其中所述功能片断是选自由Fv、Fab、Fab′、或F(ab′)2所组成的群组。
11.根据权利要求9所述的经分离的核酸，其包含大体上对所陈述的在选自由以下SEQ ID NO所组成的群组的序列中三个CDR的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
12.一种编码CDR或其功能片断的经分离的核酸，其包含大体上对经选自由以下SEQ ID NO所组成的群组的核苷酸序列编码的CDR的氨基酸序列进行编码的核苷酸序列9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43及45。
13.一种减少赘生性细胞增生的方法，其包含向所述细胞投予有效量的根据权利要求1所述的人单克隆抗体或功能片断。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述赘生性细胞是选自由乳癌、肺癌及卵巢癌细胞所组成的群组。
15.一种检测样品中的赘生性细胞的方法，其包含(a)使样品与根据权利要求1所述的人单克隆抗体或功能片断相接触；以及(b)检测所述人单克隆抗体或功能片断对所述样品的特异性结合，其中与正常细胞相比存在或具有增高含量的所述人单克隆抗体或功能片断在所述样品中存在赘生性细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述赘生性细胞是选自由乳癌、肺癌及卵巢癌细胞所组成的群组。
全文摘要
本发明提供肿瘤特异性人单克隆抗体和功能片断。还提供编码肿瘤特异性人单克隆抗体和功能片断的核酸。还提供了一种用于减少肿瘤细胞增生的方法。该方法由投以有效量之肿瘤特异性人单克隆抗体或功能片断来组成。还提供了一种检测样品中的肿瘤细胞的方法。该方法由使细胞与肿瘤特异性单克隆抗体或功能片断相接触并检测人单克隆抗体或功能片断对样品的特异性结合来组成。
文档编号A61K39/395GK1615315SQ02827095
公开日2005年5月11日 申请日期2002年11月19日 优先权日2001年11月19日
发明者J·D·瓦特金斯 申请人:应用分子发展公司