一种简易角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及干细胞体外培养领域，尤其涉及一种简易角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]角膜病是目前主要的致盲性疾病之一，角膜上皮组织尤其是角膜缘组织移植治疗角膜表面顽固性疾病可以获得良好的术后效果。但是由于角膜供体非常有限，不能满足患者的治疗需求。此外，同种异体角膜上皮具有较强的免疫源性，手术后免疫排斥发生率高，也是一个问题。利用自体角膜缘干细胞为种子细胞，通过体外培养并构建组织工程角膜，然后再移植回患者眼睛是目前研究治疗角膜病的一个重要方向。角膜缘干细胞是一种特殊类型的细胞，位于角膜缘上皮基底层，具有分化度低、生命周期长、高度增生潜能和自我更新的能力，在角膜上皮更新和创伤愈台中起重要作用。
[0003]原代角膜缘干细胞分离和体外培养对研究角膜缘干细胞及其分化机理以及角膜上皮组织尤其是角膜缘组织移植治疗角膜性疾病具有重要的意义。然而，现行的原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法比较复杂，成功率低，重现性也差，所获干细胞增值能力差甚至丧失增值能力。为了克服上述问题，本发明开发了一种简易角膜缘干细胞分离及体外培养试剂盒。使用该试剂盒进行兔角膜缘干细胞分离和体外培养，操作简单，干细胞得率高，所得原代干细胞状态好，增值能力强，体外培养成功率高，重现性好。
【发明内容】
[0004]本发明涉及一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，所述试剂盒包括:组织清洗液、冷消化液、热消化液和培养液。
[0005]本发明还涉及一种原代角膜缘干细胞分离用组织清洗液，所述组织清洗液含有但不限于:50-500IU/ml青霉素，50_500IU/ml链霉素及0.1%氟康唑。
[0006]本发明还涉及一种原代角膜缘干细胞分离用冷消化液，所述冷消化液含有但不限于:0.2-2.4U/ml中性蛋白酶(Neutral Protease)。所述中性蛋白酶包括分散酶,如:Dispase II。
[0007]本发明还涉及一种原代角膜缘干细胞分离用热消化液，所述热消化液含有但不限于:0.05-0.25% 胰蛋白酶(Trypsin)。
[0008]本发明还涉及一种原代角膜缘干细胞体外培养液，所述培养液含有但不限于:2-10% FBS,5-20ng/ml EGF, l-10ug/ml胰岛素，0.l_2ug/ml氢化可的松，及无血清基础培养液，如=KSFM0
[0009]本发明还涉及一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法，包括下述步骤:角膜缘组织提取，消化和体外培养。
[0010]本发明所述的角膜缘组织提取包括:沿角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜后，划痕深度达0.l_3mm，环形切取角膜缘外0.2-2 mm、角膜缘和角膜缘内0.2-3 mm的角膜上皮组织。
[0011]本发明所述的消化步骤包括冷消化和热消化。所述冷消化包括:将所切取的板层角膜组织用清洗液漂洗后，置于中性消化液中，在1-8°C，摇动或震荡1-5小时；所述热消化包括:取出冷消化后的角膜板层组织，刮剥上皮层，弃去结缔组织，加入蛋白酶消化液，30_40°C温育2-15分钟；加入培养液终止消化，用移液枪反复吸打使细胞分散，吸取细胞悬液并转移到冻存管或培养皿。为获取更多细胞，可向沉淀组织中再加入适量培养液，吸打，吸细胞悬液与第一次细胞悬液合并，然后将仍存留的沉淀弃用。
[0012]本发明所述的体外培养包括:用培养液调细胞密度至lX104/ml-10X104/ml，接种至培养板，置于37°C,5% CO2的恒温培养箱中培养,24-72小时后换液,此后，隔日换液。
[0013]本发明的优点和积极效果:
使用本发明所述的简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法进行角膜缘干细胞分离和体外培养，操作简单，干细胞得率高，所得原代干细胞损伤少，增值能力强，体外培养成功率高，重现性好。
【附图说明】
[0014]原代培养兔角膜缘干细胞图。按本发明所述方法提取和培养的兔角膜缘干细胞，左半图和右半图分别为经3天和7天培养后原代兔角膜缘干细胞生长情况，经7天培养原代角膜缘干细胞融合度约达70%。
【具体实施方式】
[0015]本发明通过下述实施例来进一步阐述本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。
[0016]实施例1:一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，所述试剂盒包括:组织清洗液100ml、冷消化液50ml、热消化液50ml和培养液1000ml，其制备方法分述如下:
I)组织清洗液:将青霉素和链霉素溶解在0.1%氟康唑注射液中，配成100毫升终浓度分别为:100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素和0.1%氟康唑的液体，无菌过滤后冷藏。
[0017]2)冷消化液:用PBS缓冲液调配中性蛋白酶Dispase II至浓度为1.2U/ml的溶液50ml,无菌过滤后冷藏。
[0018]3)热消化液:用生理盐水调配胰蛋白酶(Trypsin)至浓度为0.125%的溶液50ml，无菌过滤后冷藏。
[0019]4)培养液:在900ml基础培养液KSFM中添加适量牛胎儿血清(FBS) 100ml，上皮生长因子(EGF)20ug，胰岛素5mg，氢化可的松0.5mg (终浓度:10%FBS，20ng/ml EGF, 5 μ g/ml胰岛素,0.5 μ g/ml氢化可的松),搅拌均勻后无菌过滤后冷藏。
[0020]将上述组织清洗液、冷消化液、热消化液及培养液组合包装便是本发明所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒。
[0021]实施例2:—种简易原代兔角膜缘干细胞分离和体外培养方法，所述方法包括下述步骤:
I)兔角膜缘组织提取:用3%戊巴比妥钠40mg / kg腹腔麻醉动物，侧卧位固定。用组织清洗液冲洗结膜囊，眼周用碘伏消毒，2%利多卡因点眼球表面麻醉，沿角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜后，环形切取角膜缘外I mm、角膜缘和角膜缘内2 mm的角膜上皮组织(深约150 μ m);将切取的板层角膜组织放入盛有1ml组织清洗液的管中，置于冰盒暂存；
2)冷消化:取板层角膜组织置于1ml冷消化液中，4°C，旋转摇床90rpm消化2h ；
3)热消化:取出冷消化好的角膜板层组织放入培养皿，加入5mlPBS缓冲液，在超净台显微镜下，用显微有齿镊固定板层一端，用白内障隧道刀刮剥上皮层；将剥下来的上皮组织吸到新的无菌离心管中，冰镇5分钟；加入1ml组织清洗液，悬浮上皮组织，静置待上皮组织沉淀于离心管底部时，缓慢吸弃上清液，加入5ml热消化液，37°C静置温育5分钟，加入20ml培养液，终止消化；用移液枪反复吸打细胞液20次使细胞分散，制成细胞悬液；
4)体外培养:计数细胞悬液中细胞数，用培养液调细胞密度至2.5X 14个/ml，接种至六孔培养板，每孔Iml悬液；置于37°C ,5% CO2的恒温培养箱中,静置培养72h后换液，以后隔日换液，每日在倒置相差显微镜下观察细胞的生长情况。
[0022]体外培养结果:如附图所示，所获兔角膜缘干细胞原代培养3天和7天生长状态良好，7天培养后细胞融合度约达70%。所获细胞经细胞免疫荧光染色鉴定，显示为P63+/AE5-,确认为兔角膜缘干细胞。
【主权项】
1.一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，其特征是所述试剂盒包括:组织清洗液、冷消化液、热消化液和培养液。
2.根据权利要求1所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，其特征是所述组织清洗液含有50-500IU/ml青霉素和50_500IU/ml链霉素，溶解在0.1%氟康唑注射液中。
3.根据权利要求1所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，其特征是所述冷消化液含有0.2-2.4U/ml中性蛋白酶(Neutral Protease)的溶液。
4.根据权利要求1所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，其特征是所述热消化液是含有0.05-0.25%胰蛋白酶(Trypsin)的溶液。
5.根据权利要求1所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒，其特征是所述培养液含有2-10% FBS,5-20ng/ml EGF, l-10ug/ml胰岛素，0.l_2ug/ml氢化可的松，溶解在基础培养液，如KSFM中。
6.一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法，其特征是所述方法包括下述步骤:角膜缘组织提取，消化及体外培养。
7.根据权利要求6所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法，其特征是所述角膜缘组织提取步骤包括:沿角膜缘环形剪开球结膜和结膜下筋膜，划痕深度0.l_3mm，环形切取角膜缘外0.2-2 mm、角膜缘和角膜缘内0.2-3 mm的角膜上皮组织。
8.根据权利要求6所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法，其特征是所述消化步骤包括冷消化和热消化；所述冷消化包括:将所切取的板层角膜组织用清洗液漂洗后，置于中性消化液中，在1_8°C，低速摇动或震荡1-5小时；所述热消化包括:取出冷消化后的角膜板层组织，刮剥上皮层，弃去结缔组织，加入蛋白酶消化液，30-40°C温育2-15分钟；加入培养液终止消化，用移液枪反复吸打使细胞分散，吸取细胞悬液并转移到冻存管或培养皿。
9.根据权利要求6所述的一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法，其特征是所述体外培养步骤包括:用培养液调细胞密度至lX104/ml-10X104/ml，接种至培养板，置于37°C ,5% CO2的恒温培养箱中培养，24-72小时后换液，此后，隔日换液。
【专利摘要】本发明涉及一种简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法。所述简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒包括：组织清洗液、冷消化液、热消化液和培养液。所述简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养方法包括下述步骤：角膜缘组织提取、消化、体外培养。使用本发明所述的简易原代角膜缘干细胞分离和体外培养试剂盒及方法进行角膜缘干细胞分离和体外培养，操作简单，干细胞得率高，所得原代干细胞损伤少，增值能力强，体外培养成功率高，重现性好。
【IPC分类】C12N5-074
【公开号】CN104862271
【申请号】CN201410062366
【发明人】马蕾, 程潇, 于花
【申请人】山西医科大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2014年2月22日