移植物存储的制作方法

专利名称：移植物存储的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于存储细胞或组织的工具组，以及用于存储细胞或组织的工具组的 用途，例如用于移值或植入。本发明也涉及存储包括角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮 细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞(也就是，皮肤)、或骨髓衍生细胞的细胞或组织的 方法。本发明进一步涉及提供角膜缘细胞移植和提供细胞存储培养基的方法。
背景技术：
角膜起眼睛窗户的作用，并由三层组成，其中最外层称为上皮。在角膜的外围，为 眼睛的半透明部分和白色部分之间的过渡区域，也称为角膜缘，角膜干细胞位于角膜缘上。 这些细胞可遭受影响角膜的不同类型的疾病和危害，导致称为角膜缘干细胞缺陷(limbal stem cell deficiency)的情况。当角膜变得不透明时，这种情况可导致失明。
体外扩增人角膜缘上皮细胞(HLEC)的移植是用于角膜缘干细胞缺陷(LSCD)的治 疗2°_25。HLEC的体外扩增原则是从病人(自体移植物)或存活的相关供体或尸体眼睛(同 种异体移植物)获取的功能性角膜缘组织的活组织检查产生未分化的角膜上皮。HLEC可通 过多种扩展方案(包括角膜缘移植培养26_29、细胞悬浮培养2°’26’3°’31、在完整28’29’32’33或上皮 裸露的26’31—35羊膜(AM)上或其它细胞培养表面进行培养2°’26’36_4°、与致死性照射的3T3纤 维母细胞的共培养2°’22’27’3°和air-lifting23’41)进行离体培养。治疗LS⑶的备选方法是使 用自体同源的口粘膜上皮层42_45。尽管实验方案已示出了好的临床结果，角膜缘上皮干细胞 治疗仍然面对有关外科后勤、组织无菌性、组织运输和组织可用性的挑战。由于多层上皮细 胞的工程化需要3-4周的培养周期，并且组织培养易在培养的建立、培养基变化以及在运 送到手术室的期间受微生物污染的影响，治疗时机选择可变得复杂。当前，角膜缘上皮干细 胞治疗的临床应用限于具有组织工程化所需的知识和实验设备的眼科。
目前，角膜缘上皮细胞的存储中存在几个问题。
首先，角膜缘上皮细胞目前通常通过在羊膜上培养来存储，该羊膜已经缝合在聚 酯膜载体之上。膜载体与羊膜以及培养的上皮细胞随后一起浸入到器官培养基(一般地存 储在加塞的瓶中)。这种方法所带来的问题在于它是费时的，并且需要很费时地将羊膜紧固 在膜载体上。此外，一旦膜载体浸入到培养基中，其就不能在不打开加塞的瓶的情况下进行 微生物评估，而打开瓶塞则会有污染培养基的风险。
第二个问题是角膜缘上皮细胞的存储的机械性质。现有的用于存储上皮细胞的方 法导致载有细胞的羊膜在培养基内自由漂浮。然而，实际上，如果上皮细胞被运送它们将得 不到保护。培养的角膜缘上皮细胞的运送是重要的，因为，在实践中其对于将细胞存储在 “眼库”中然后输送到完成植入过程的医院而言是有效的。此外，培养的角膜缘上皮细胞所 浸入的培养基的深度可影响细胞的存储和发展。因此，允许已经应用有细胞的羊膜在培养 基内自由浮动可使细胞处于次优状态。
在存储培养角膜缘上皮细胞中的第三个问题是它们所存储的温度。紧跟穿透性 角膜成形术的剩余角膜巩膜供体边缘(其为用于培养的角膜上皮的工程化的HLEC源47’5°)一般地在31°C到37°C之间的温度下(欧洲眼库联合目录，2007)存储在OC培养基中，或 在4°C下存储在Optisol-GS52 (Bausch&Lomb，Irvine, CA)。此外，已经示出，角膜缘上皮在 Optisol-GS中的存储在六天后导致95%的基底层细胞活力53。然而，在这种温度下需要特 别装置来存储外植体。
如上所述，HLEC通过获得从供体得来的功能性角膜缘组织的活组织检查而产生。 然而，活组织检查位点的四周位置在现有技术中很少报告。因此先前不知道是否来自某位 置的活组织检查具有提高的质量。
本发明寻求解决上述问题中的一个或多个。
本文的实施例1首次报道了用于培养的HLEC的短期眼库存储的方法，其在角膜缘 上皮干细胞治疗中是有用的46。在研究中，3周的HLEC培养物从培养箱转移到具有器官培养 基(OC)的玻璃容器，并在23°C下存储一周，同时保持最初的多层结构和未分化的表型(图 8)。该方法的实验设计具有几个优点。首先，角膜缘表型的保持在确定移植时间中提供弹 性。第二，组织存储允许时间以完成存储培养基的微生物测试，其可增强离体扩增的HLEC 的移植安全性。第三，封闭系统使组织能够从实验室运送到手术室和眼库之间运送，以增加 组织的可用性。最后，在室温下的存储消除了对加热箱的需要。发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种用于存储细胞或组织的工具组，其包括
具有位于其中的开口和包围开口的外围壁的框架；以及
用于容纳框架和容纳液体培养基的可密封容器，可密封容器的一段由弹性部件形 成，以允许通过穿透元件进入容器的内部并随后在撤回穿透元件之后形成密封。
方便地，工具组适于存储用于培养细胞或组织的基材(substrate)。
优选地，基材是平面或弓形基材。
方便地，基材是羊膜、接触镜、胶原凝胶或塑料材料，优选地其中羊膜位于支撑网 上。
优选地，细胞是角膜缘细胞、结膜细胞、内皮细胞、粘膜细胞、视网膜细胞、骨髓衍 生细胞或表皮细胞。
方便地，角膜缘细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞 和骨髓衍生细胞是培养的细胞。
有利地，工具组进一步包括绕外围壁周围布置的伸长或环形弹性部件，以固定平 面基材通过框架中的开口。
方便地，外围壁包含用于容纳伸长或环形弹性部件的环形槽。
优选地，工具组进一步包括至少一个连接到框架以将框架支撑在培养基中的浮 体。
有利地，浮体连接到外围壁的外部。
有利地，框架包括用于容纳浮体的环形凹槽。
优选地，浮体位于外围壁周围，以便当框架位于容器内、浮体支撑培养基中的框架 时，浮体位于外围壁和容器之间。
有利地，浮体的任何部件之间的最大距离形成最大直径，并且最大直径是容器最8小直径的至少80 %，优选地至少90 %。
优选地，至少一个浮体是由撞击吸收材料制成。
有利地，至少一个浮体由能被穿透元件刺穿的可变型材料制成。
有利地，在浮体中提供间隙，以容纳穿透元件。
优选地，浮体位于框架上，使得支撑在框架上的平面基材的位置低于液体培养基 的液面小于2mm，优选地小于1mm。
有利地，工具组进一步包括支撑装置，该支撑装置用于保持容器并允许容器相对 支撑装置的至少一部分自由旋转。
有利地，支撑装置包括万向节。万向节可允许在一个、两个或三个垂直轴线中旋转。
可备选地，支撑装置包括用于保持容器的球形内壳和包括用于容纳内壳的球形凹 槽的外壳，其中，内壳在外壳内旋转。
优选地，容器包括可移动帽。
有利地，可移动帽通过铰链连接到容器。
有利地，弹性部件位于帽中。
优选地，框架在空心圆柱中。
有利地，外围壁包括一个或多个用于允许培养基通过的孔径。
有利地，工具组进一步包括培养基。
优选地，培养基是器官培养基。
可备选地，培养基是无血清培养基CnT-20。
有利地，培养基包括极限必需培养基。
有利地，培养基是血清培养基。
优选地，培养基包括胎牛血清。
可备选地，培养基是无血清培养基。
有利地，无血清培养基包括0ptisol-GS或者PAA-Quantum。
可备选地，无血清培养基包括缓冲剂和极限必需培养基。
优选地，缓冲剂包括HEPES (4- (2-羟乙基)哌嗪乙烷-磺酸)，更优选地浓度为 25mM。
有利地，极限必需培养基包括氨基酸、盐、葡萄糖和维生素。
有利地，盐包括下列成分中的至少一个氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠和 /或维生素包括叶酸、烟酰胺、核黄素和B-12中的至少一种。
有利地，培养基包括碳酸氢钠。
有利地，培养基包括抗生素。
优选地，抗生素是庆大霉素、万古霉素、两性霉素B或其混合物。
有利地，培养基包括至少60%的N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙烷-磺酸缓冲的 Dulbecco改进的Eagle培养基，5 %至15 %的碳酸氢钠、2 %至10 %的胎牛血清、10至 100mg/ml的庆大霉素、20至300mg/ml的万古霉素以及0. 1至5mg/ml的两性霉素B。
方便地，培养基具有10到IOOml的容积。
有利地，容器由塑料材料制成。
方便地，穿透元件是皮下注射针。
优选地，工具组进一步包括适合基材放置的网，优选地，其中网是聚酯网。
根据本发明的另一个方面，提供了根据本发明的用于存储细胞或组织的工具组的 用途。
方便地，使用进一步包括在基材上培养细胞或组织。
有利地，基材是平面或弓形基材。
优选地，细胞外植体位于基材上。
有利地，角膜缘上皮移植存储在3°C到37°C之间，优选地在3°C到30°C之间，优选 地在18°C到之间，更优选地在20°C到25°C之间，更优选地在22°C到之间，更优选 地在22°C到23°C之间的温度，更优选地至少一天、二天、三天或四天，更优选地至少七天的 时间。
根据本发明的另一个方面，提供一种存储细胞或组织的方法，包括将细胞或组织 保持在3°C到37°C之间的温度下，其中，细胞或组织包括角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜 内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞或骨髓衍生细胞。
这允许存储细胞而基本上不增加细胞分化。
优选地，角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮 细胞或骨髓衍生细胞是培养的细胞。
根据本发明的另一个方面，提供一种存储角膜缘上皮细胞的方法，其中，在细胞分 化中基本上不增加。
优选地，角膜缘上皮细胞是培养的角膜缘上皮细胞。
在一些实施方案中，“在细胞分化中基本上不增加”指的是在存储结束时与在存储 开始时一样，有至少80%、90%、95%或99%的未分化细胞。
有许多测试可用来确定是否在细胞分化中基本上不增加。例如，通过分析细胞中 不同免疫组织化学的标记来确定。例如标记p63、K19和波形蛋白分别可用来指示细胞未分 化。对于没有分化的另一个测试是对于标记Κ3的表达，细胞呈阴性。另一个测试是标记 Cx43、K5、Kl和/或整联蛋白β 1低的或阴性表达。
也应注意到的是，当细胞被培养和分化时，它们所位于其中的培养基一般地每2 至3天更换，但在本发明的实施方案中，这种培养基的更换不发生。
有利地，该方法包括将细胞或组织保持在3°C和37°C之间的温度下。
优选地，该方法进一步包括在两个位置之间运送角膜缘上皮细胞的步骤。
有利地，该方法包括将细胞或组织保持在以下温度3°C和30°C之间，优选地在 18°C和之间，优选地在20°C和25°C之间，优选地在22°C和之间，优选地在22°C或 23 °C。
优选地，该方法包括将浸没在无血清培养基中至少一天的细胞或组织存储在18°C 和之间的温度下。
实际上，根据本发明的一个特定方面，存储细胞或组织的方法包括将浸没在无血 清培养基中至少一天的细胞或组织保持在18°C和之间的温度下，其中，细胞或组织包 括角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞或骨髓衍生 细胞，优选培养的细胞。该方法允许存储细胞而基本上不增加细胞的分化。
有利地，该方法进一步包括将细胞或组织放置在基材上的步骤，优选地为平面或 弓形基材。
优选地，基材是羊膜、接触镜、胶原凝胶或塑料材料。
有利地，基材是羊膜，并且细胞是上皮细胞，并且其中细胞的位置使得上皮侧面向羊膜。
优选地，羊膜包括完整的羊膜上皮细胞。
有利地，该方法进一步包括将基材连接到聚酯网的步骤。
优选地，细胞或组织包括角膜缘上皮细胞并且是从供体眼睛的区域中获得的，该 区域包括从眼睛顶端位置向每一侧张开30°的扇形。
有利地，该区域包括从眼睛顶端位置向每一侧张开15°的扇形。
有利地，该方法包括将细胞或组织保持在所述温度下至少一天，优选地至少两天， 更优选地至少三天，更优选地至少四天，更优选地至少七天。
优选地，细胞或组织浸在液体培养基内。
有利地，液体培养基包括极限必需培养基。
有利地，液体培养基是血清培养基。
优选地，液体培养基包括胎牛血清。
可备选地，液体培养基是无血清培养基。
方便地，无血清培养基包括0ptisol-GS或PAA-Quantum。
可备选地，无血清培养基包括缓冲剂和极限必需培养基。
优选地，缓冲剂包括HEPES (4- (2-羟乙基)哌嗪乙烷-磺酸)，更优选地浓度为 25mM。
优选地，极限必需培养基包括氨基酸、盐、葡萄糖和维生素。
方便地，盐包括氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠中的至少一种，和/或维生 素包括叶酸、烟酰胺、核黄素和B-12中的至少一种。
有利地，液体培养基包括碳酸氢钠。
方便地，液体培养基包括抗生素。
优选地，抗生素是庆大霉素、万古霉素、两性霉素B或其混合物。
有利地，液体培养基包括至少60%的N-2-羟乙基哌嗪-N'-乙烷-磺酸缓冲 的Dulbecco改进的fegle培养基，5%至15%的碳酸氢钠、2%至10%的胎牛血清、10至 100mg/ml的庆大霉素、20至300mg/ml的万古霉素以及0. 1至5mg/ml的两性霉素B。
方便地，液体培养基的体积在10到IOOml之间。
有利地，该方法进一步包括调整液体培养基上的气体的成分的步骤。
优选地，细胞或组织存储至少3天，更优选地至少7天，更优选地至少2周，更优选 地至少3周。
有利地，细胞或组织存储在密闭系统中。
有利地，该方法进一步包括在存储之前培养细胞或组织的步骤。
优选地，培养细胞或组织的步骤包括在下述条件下保存细胞或组织在35°C和 39°C之间的温度，优选地为37°C ；在一定气氛下浸入适于细胞培养的液体培养基中，该气氛 包含90%和99%之间的氧和10%和之间的二氧化碳，优选地95%的氧和5%的二氧化碳。
方便地，该方法使用本发明的工具组。
根据本发明的另一个方面，提供一种提供角膜缘细胞外植体的方法，该方法包括 仅从供体眼睛中包括自眼睛顶端位置向每一侧张开30°的扇形的区域内取出角膜缘上皮 细胞。在这个方面，供体的眼睛的剩余部分保持在原位置。
优选地，该方法包括仅从供体眼睛中包括自眼睛顶端位置的每一侧张开15°的扇 形的区域内取出角膜缘上皮细胞。
有利地，供体是尸体。
根据本发明的另一个方面，提供一种包括HEPES缓冲剂和浓度在20mM和30mM之 间，优选25mM的极限必需培养基的细胞存储培养基。
优选地，细胞存储培养基进一步包括抗生素，优选地为庆大霉素。
在本说明书中，所指的“细胞”指包括这种细胞的“组织”。
在本说明书中，用语“培养”用于细胞和组织中，以说明细胞或组织已经经受“离体 扩增”，并且用语可互换使用。例如，在角膜缘细胞外植体中，组织从供体中取出，其中组织 通常仅包括2个或3个干细胞(残余细胞是分化细胞)。外植体在含95%的氧气和5%的 二氧化碳的环境下在激素上皮培养基中在37°C下进行培养。每隔二天替换培养基。由于干 细胞的复制，培养或离体扩增过程导致外植体中的未分化细胞的数量增加。培养的细胞通 常缺乏未培养细胞的结缔组织，并包括很少细胞层。培养细胞比直接从供体取得的组织更 适于移植。
角膜缘细胞可通过参考特定细胞质/细胞核，以及细胞表面标记定性，后者例如 描述在文献"Schl δ tzer-Schrehardt U.等，Experimental Eye Research,第 81 卷第 247-264页，2005年9月3日”中。示例性干细胞标记在表1中提供。
表1-人眼睛表面上皮中的干细胞标记的半定量免疫组织化学定位
权利要求
1.存储细胞或组织的方法，其包括将细胞或组织保持在3°C到37°C之间的温度下，其 中所述细胞或组织包括角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、 表皮细胞或骨髓衍生细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述角膜缘上皮细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、 视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞或骨髓衍生细胞是培养的细胞。
3.存储角膜缘上皮细胞或包含角膜缘上皮细胞的组织的方法，其中在细胞分化中基本 上无增加。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述角膜缘上皮细胞是培养的角膜缘上皮细胞。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其包括将所述细胞或组织保持在3°C和37°C之间 的温度下。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其进一步包括在两个位置之间运送所述 角膜缘上皮细胞或组织的步骤。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将细胞或组织保持在如下温度 3°C和30°C之间，优选地在18°C和之间，优选地在20°C和25°C之间，优选地在22°C和 24 V之间，优选22 °C或23 °C。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将浸没在无血清培养基中至少一天 的细胞或组织存储在18°C和之间的温度下。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括将所述细胞或组织放置在基 材上的步骤，所述基材优选地为平面或弓形基材。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述基材是羊膜、接触镜、胶原凝胶或塑料材料。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基材是羊膜，所述细胞或组织包括上皮细 胞，并且其中所述细胞的位置使得上皮侧面向羊膜侧。
12.根据权利要求9至11任一项所述的方法，其进一步包括将所述基材连接到聚酯网 的步骤。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织包含角膜缘上皮细 胞并且是从供体眼睛的区域中获得的，该区域包含从眼睛顶端位置向每一侧张开30°的扇 形。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述区域包含从眼睛顶端位置向每一侧张开 15°的扇形。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其包括将所述细胞或组织保持在所述温 度下至少一天，优选地至少两天，更优选地至少三天，更优选地至少四天，更优选地至少七天。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织浸在液体培养基内。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述液体培养基包含极限必需培养基。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述液体培养基是血清培养基。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述液体培养基包含胎牛血清。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述液体培养基是无血清培养基。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述无血清培养基包含Optisol-GS或 PAA-Quantum0
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述无血清培养基包含缓冲剂和极限必需培养基。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述缓冲剂包含HEPES(4- (2-羟乙基)-1-哌嗪 乙烷-磺酸)，优选地浓度为25mM。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述极限必需培养基包含氨基酸、盐、葡萄 糖和维生素。
25.根据权利要求M所述的方法，其中盐包含氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠中 的至少一种，和/或维生素包含叶酸、烟酰胺、核黄素和B-12中的至少一种。
26.根据权利要求8或16至25中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括碳酸氢钠。
27.根据权利要求8或16至沈中任一项所述的方法，其中所述液体培养基包括抗生素。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗生素是庆大霉素、万古霉素、两性霉素B 或其混合物。
29.根据权利要求16所述的方法，其中所述液体培养基包含至少60%的N-2-羟乙基 哌嗪-N'-乙烷-磺酸缓冲的Dulbecco改进的fegle培养基、5%至15%的碳酸氢钠、2% 至10%的胎牛血清、10至100mg/ml的庆大霉素、20至300mg/ml的万古霉素以及0. 1至 5mg/ml的两性霉素B。
30.根据权利要求16至四中任一项所述的方法，其中所述液体培养基的体积在10到 IOOml之间。
31.根据权利要求16或30所述的方法，其进一步包括调整液体培养基上的气体的成分 的步骤。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织存储至少3天，优选 地至少7天，更优选地至少2周，更优选地至少3周。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织存储在密闭系统中。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其进一步包括在存储之前培养所述细胞 或组织的步骤。
35.根据权利要求34所述的方法，其中培养所述细胞或组织的步骤包括在下述条件下 保持细胞或组织在35°C和39°C之间的温度，优选地为37°C ；在一定气氛下浸入适于细胞 培养的液体培养基中，该气氛包含90%和99%之间的氧和10%和之间的二氧化碳，优 选地95 %的氧和5 %的二氧化碳。
36.用于存储细胞或组织的工具组，其包括具有位于其中的开口和包围所述开口的外围壁的框架；以及用于容纳所述框架和容纳液体培养基的可密封容器，该可密封容器的一段由弹性部件 形成，从而允许通过穿透元件进入容器的内部并且随后在撤回穿透元件之后形成密封。
37.根据权利要求36所述的工具组，所述工具组适于存储用于培养细胞或组织的基材。
38.根据权利要求37所述的工具组，其中所述基材是平面或弓形基材。
39.根据权利要求37或38所述的工具组，其中所述基材是羊膜、接触镜、胶原凝胶体或塑料材料，优选地其中所述羊膜位于支撑网上。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的工具组，其中所述细胞或组织包含角膜缘 细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞或骨髓衍生细胞。
41.根据权利要求40所述的工具组，其中所述角膜缘细胞、结膜细胞、角膜内皮细胞、 视网膜细胞、粘膜细胞、表皮细胞和骨髓衍生细胞是培养的细胞。
42.根据权利要求36至41中任一项所述的工具组，其进一步包括可绕外围壁周围布置 的伸长或环形弹性元件，以固定基材通过框架中的开口。
43.根据权利要求42所述的工具组，其中所述外围壁含有用于容纳该伸长或环形弹性 部件的环形槽。
44.根据权利要求36至43所述的工具组，进一步包括至少一个连接到框架以将框架支 撑在培养基中的浮体。
45.根据权利要求44所述的工具组，其中所述浮体连接到外围壁的外部。
46.根据权利要求45所述的工具组，其中所述框架包括用于容纳浮体的环形凹槽。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的工具组，其中所述浮体位于外围壁周围，以 便当框架位于容器内、浮体支撑培养基中的框架时，浮体位于外围壁和容器之间。
48.根据权利要求47所述的工具组，其中所述浮体的任何部件之间的最大距离形成最 大直径，并且该最大直径是容器最小直径的至少80%，优选地至少90%。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的工具组，其中所述至少一个浮体是由撞击吸 收材料制成。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的工具组，其中所述至少一个浮体由能被穿透 元件刺穿的可变形材料制成。
51.根据权利要求44至50中任一项所述的工具组，其中在浮体中具有间隙以容纳穿透 元件。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的工具组，其中所述浮体位于框架上，使得支 撑在框架上的基材的位置比液体培养基的液面低小于2mm，优选小于1mm。
53.根据权利要求36至52中任一项所述的工具组，进一步包括支撑装置，该支撑装置 用于保持容器并允许容器相对支撑装置的至少一部分自由旋转。
54.根据权利要求53所述的工具组，其中所述支撑装置包括万向节。
55.根据权利要求53所述的工具组，其中所述支撑装置包括用于保持容器的球形内壳 和包括用于容纳内壳的球形凹槽的外壳，内壳可在外壳内旋转。
56.根据权利要求36至55中任一项所述的工具组，其中所述容器包括可移动帽。
57.根据权利要求56所述的工具组，其中所述可移动帽通过铰链连接到容器。
58.根据权利要求56或57所述的工具组，其中所述弹性部件位于帽中。
59.根据权利要求36至58中任一项所述的工具组，其中所述框架为空心圆柱。
60.根据权利要求36至59中任一项所述的工具组，其中所述外围壁包括一个或多个用 于允许培养基通过的孔。
61.根据权利要求36至60中任一项所述的工具组，进一步包括培养基。
62.根据权利要求61所述的工具组，其中所述培养基是无血清培养基CnT-20。
63.根据权利要求61所述的工具组，其中所述培养基是器官培养基。
64.根据权利要求61所述的工具组，其中所述培养基包括极限必需培养基。
65.根据权利要求64所述的工具组，其中所述培养基是血清培养基。
66.根据权利要求65所述的工具组，其中所述培养基包括胎牛血清。
67.根据权利要求61或64所述的工具组，其中所述培养基是无血清培养基。
68.根据权利要求67所述的工具组，其中所述无血清培养基包括=Optisol-GS或者 PAA-Quantum0
69.根据权利要求67所述的工具组，其中所述无血清培养基包括缓冲剂和极限必需培养基。
70.根据权利要求69所述的工具组，其中所述缓冲剂包括HEPES(4- (2-羟乙基)-1-哌 嗪乙烷-磺酸)，优选地浓度为25mM。
71.根据权利要求69或70所述的工具组，其中所述极限必需培养基包括氨基酸、盐、葡 萄糖和维生素。
72.根据权利要求71所述的工具组，其中盐包括氯化钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸二氢钠 中的至少一种和/或维生素包括叶酸、烟酰胺、核黄素和B-12中的至少一种。
73.根据权利要求61至72中任一项所述的工具组，其中所述培养基包括碳酸氢钠。
74.根据权利要求61至73中任一项所述的工具组，其中所述培养基包括抗生素。
75.根据权利要求74所述的工具组，其中所述抗生素是庆大霉素、万古霉素、两性霉素 B或其混合物。
76.根据权利要求61所述的工具组，其中所述培养基包括至少60%的N-2-羟乙基哌 嗪-N‘-乙烷-磺酸缓冲的Dulbecco改进的Eagle培养基，5 %至15 %的碳酸氢钠、2 %至 10%的胎牛血清、10至100mg/ml的庆大霉素、20至300mg/ml的万古霉素以及0. 1至5mg/ ml的两性霉素B。
77.根据权利要求61至76中任一项所述的工具组，其中所述培养基具有10到IOOml 的体积。
78.根据权利要求36至77中任一项所述的工具组，其中所述容器由塑性材料制成。
79.根据权利要求36至78中任一项所述的工具组，其中所述穿透元件是皮下注射针。
80.根据权利要求36至79中任一项所述的工具组，其中所述工具组进一步包括适合基 材放置的网，优选地其中网是聚酯网。
81.根据权利要求36至80中任一项所述的工具组在存储细胞或组织中的用途。
82.根据权利要求81所述的用途，进一步包括在基材上培养细胞或组织。
83.根据权利要求82所述的用途，其中所述基材是平面或弓形基材。
84.根据权利要求82或83所述的用途，其中所述细胞外植体位于基材上。
85.根据权利要求81至84中任一项所述的用途，其中所述角膜缘上皮移植物存储在 3 V到37 °C之间，优选地在3 V到30 V之间，优选地在18 °C到28 V之间，更优选地在20 V到 25 °C之间，更优选地在22 °C到M V之间，更优选地在22 °C到23 °C之间的温度，更优选地至 少一天、二天、三天或四天，更优选地至少七天的时间。
86.根据权利要求1至35中任一项的方法，其使用权利要求36至80中任一项的工具组。
87.提供角膜缘细胞外植体的方法，该方法包括仅从供体眼睛中包括自眼睛顶端位置向任一侧张开30°的扇形的区域内取出角膜缘上皮细胞。
88.根据权利要求87所述的方法，该方法包括仅从供体眼睛中包括自眼睛顶端位置向 任一侧15°的扇形的区域内取出角膜缘上皮细胞。
89.根据权利要求87或88所述的方法，其中所述供体是尸体。
90.一种细胞存储培养基，其包括HEPES缓冲剂和浓度在20mM和30mM之间，优选25mM 的极限必需培养基。
91.根据权利要求90所述的细胞存储培养基，进一步包括抗生素，优选地为庆大霉素。
全文摘要
提供了一种用于存储细胞或组织的工具组(1)。该工具组包括具有开口和包围开口的外围壁的框架(7)。也提供了一种用于容纳框架(7)和容纳液体培养基(6)的可密封容器(2)。可密封容器(2)的一段由弹性部件形成(5)，以允许通过穿透元件进入容器(5)的内部并且随后在撤回穿透元件之后形成密封。
文档编号A01N1/02GK102036555SQ200880020735
公开日2011年4月27日 申请日期2008年4月28日 优先权日2007年4月26日
发明者S·雷德, T·P·乌特姆 申请人:梅丁诺娃公司