检测肾脏疾病的方法
【专利说明】
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2013年9月5日提交的美国临时专利申请号61 /874，011的权益。
技术领域
[0003] 本公开通常涉及肾功能的测定。更具体地，本公开涉及评估肾小球滤过率以及诊 断、预测和确定肾脏疾病进展的方法。
[0004] 相关技术
[0005] 能够快速和准确地测量肾功能是重要的。例如，药物的剂量必须适合于患有肾机 能不全的患者。由此，准确评估肾功能是临床医学的要求。但是，肾机能不全的诊断受阻于 缺乏肾小球滤过率(GFR)和/或可用诊断测试的可靠标记物。广泛采用的GFR测量方法是菊 粉廓清率，但是该试验繁琐且昂贵，严重降低了其在临床实践中的效用。这对放射性同位素 廓清试验而言同样如此。因此，在临床实践中，血清肌酸酐通常用于评估肾功能。但是，使用 血清肌酸酐会受困于不精确性，因为数据可能遭遇相对高程度的可变性。
[0006] 因此，发明人已经确定在本领域中需要以增加的精确度评估肾功能的方法。
[0007] 发明概述
[0008] 在一方面，本公开涉及评估动物受试者中的肾小球滤过(GFR)率的方法。该方法包 括测量来自受试者的血液样品中的游离SDMA浓度，测量来自受试者的血液样品中的肌酸酐 浓度;并将来自于包括肌酸酐浓度与游离SDM浓度的乘积的等式的值与动物受试者中与肾 小球滤过率相关联的一个或多个标准值进行比较。
[0009] 在本文中描述的方法的各种示例性实施方案中，该等式包含肌酸酐浓度与游离 SDMA浓度的乘积的倒数。同样，肌酸酐浓度和/或游离SDMA浓度可以在计算中加权。可以使 用微处理器来进行比较步骤。该方法还包括通过将受试者的GFR与一个或多个健康受试者 的GFR比较来测定肾功能、肾脏疾病或肾脏功能障碍。
[0010] 在又一实施方案中，本公开涉及诊断动物受试者的肾脏疾病或肾脏功能障碍的方 法。该方法包括测量来自受试者的血清中的游离SDMA浓度;测量来自受试者的血清中的肌 酸酐浓度;并将基于肌酸酐浓度的第一加权值和基于游离SDM浓度的第二加权值的乘积同 与肾脏疾病或肾脏功能障碍相关联的一个或多个标准值比较。
[0011] 在特定的示例性实施方案中，基于肌酸酐浓度的第一加权值和基于游离SDMA浓度 的第二加权值的乘积表示为公式PROD = (CRE)p X (SDMA)Q，其中PROD是乘积，CRE是肌酸酐浓 度，SDM是SDM浓度，P提供式中赋予CRE的权重，并且Q提供式中赋予SDMA的权重。所述一个 或多个标准值可以与该乘积的倒数相关联。
[0012] 本公开的另一方面涉及计算与动物受试者中肾脏疾病或肾脏功能障碍的诊断相 关联的值的方法。该方法包括执行用于计算基于来自受试者的血液样品中的肌酸酐浓度的 第一加权值和基于来自受试者的血液样品中的游离SDMA浓度的第二加权值的乘积的机器 可读指令。
[0013] 在又一方面，本公开涉及测定个体是否患有肾脏疾病的方法。该方法包括测量来 自该个体的血清样品中的SDMA [ SDMA ]和肌酸酐[CRE ]的浓度，计算比值[SDMA ] /SDMAcut，计 算比值[CRE ] /CREoit，计算组合值:C =[ SDMA ] /SDMAcut+ [ CRE ] /CREoit，如果C大于Coit的话确 定该个体患有肾脏疾病，其中，SDMAcut是SDMA的截断值，CRE cut是肌酸酐的截断值，并且Ccut 是该组合值的截断值。
[0014] 本公开的一种方法包括测定个体是否患有肾脏疾病。该方法包括测量来自该个体 的血清样品中的SDMA [ SDMA ]和肌酸酐[CRE ]的浓度，计算比值[SDMA ]/ SDMAcut，计算比值 [CRE]/CREoit，计算组合值:C=[SDMA]/SDMAoit+[CRE]/CRE⑶τ，如果C大于Coit的话确定该个 体患有肾脏疾病，其中SDMA cut是SDMA的截断值，CREcut是CRE的截断值，Ccut是该组合值的截 断值。
[0015] 更进一步地，本公开涉及预测动物受试者中早期死亡的方法，该方法包括测量来 自该受试者的血清中的游离SDMA浓度，测量来自该受试者的血清中的肌酸酐浓度，计算比 值[SDMA]/[CRE]，如果该比值高于截断值的话确定该个体将遭受早期死亡。
[0016] 在一个实施方案中，本公开涉及测定与肾脏疾病相关的死亡率的方法。该方法包 括测量来自患者(例如犬科动物或猫科动物)的血液样品中的游离SDMA，并且当该患者具有 大于阈值水平的血液SDMA浓度时确定该患者具有增加的与肾脏疾病相关的死亡可能性。该 方法可以进一步包括测量血液样品中的肌酸酐并计算比值[SDMA]/[CRE]的步骤，其中当该 患者具有大于阈值水平的血液[SDMA]/[CRE]比值时该患者具有增加的与肾脏疾病相关的 死亡可能性。
[0017] 在另一方面，本公开还涉及一种用于测定动物受试者的肾功能的装置。该装置包 括具有结合到其上的SDMA类似物，或SDMA特异性抗体的第一固相，所述SDMA特异性抗体不 具有或基本不具有与选自不对称二甲基精氨酸(ADMA)、左旋精氨酸和N-甲基精氨酸的一种 或多种化合物的交叉反应性;和具有结合到其上的肌酸酐检测试剂（sensing reagent)或 肌酸酐特异性抗体的第二固相。
[0018] 在又一方面，本公开涉及用于测定动物受试者的肾功能的试剂盒。该试剂盒包括 一种或多种肌酸酐检测试剂和一种或多种SDM检测试剂，并任选包括基于来自动物的一个 或多个血液样品中的肌酸酐浓度和SDMA浓度的乘积的一组与肾功能相关联的一个或多个 标准值。
[0019] 更进一步地，本公开涉及一种具有包含软件指令的存储器的计算装置，所述软件 指令在执行时计算肌酸酐浓度与游离SDMA浓度的乘积的倒数。该存储器还包括用于将计算 结果与表示动物受试者的肾小球滤过率的一个或多个标准值进行比较的软件指令。
[0020] 附图概述
[0021] 包含以便进一步理解本公开的附图结合在本说明书中并构成本说明书的一部分， 例示本公开的实施方案，并与详述一起用于解释本发明的原理。并未试图显示与基本理解 本发明和实施本发明的各种方式所必需的相比更为详细的本发明的结构细节。
[0022]图1是比较用质谱法检测SDMA的ELISA方法的结果的图。
[0023] 图2是健康狗和患有癌症、心脏疾病或心脏-肾脏疾病的狗体内SDMA浓度的曲线 图。水平横条代表截断值(测定为平均SDM浓度+来自健康狗种群的2标准偏差）。
[0024] 图3是健康猫和患有肾脏疾病或癌症的猫体内SDMA浓度的曲线图。水平横条代表 截断值(测定为平均SDM浓度+来自健康猫中青年的2标准偏差）。
[0025]图4是280纳米处的吸光度vs. SDMA胱酰胺（cystamide)蛋白质缀合物的洗脱馏分 数(fraction number)的曲线图，其中该蛋白质是KLH( ?)或BSA( )，如实施例中所述来自 Sephadex G-25M凝胶过滤柱。
[0026]图5是如实施例6中所述的一组犬科动物血清样品的肌酸酐浓度vs .GFR的曲线图。 [0027]图6是如实施例6中所述的一组犬科动物血清样品的SDMA浓度vs .GFR的曲线图。 [0028]图7是如实施例6中所述的一组犬科动物血清样品的[肌酸酐]* [ SDMA] vs. GFR的曲 线图。
[0029] 图8显示了如实施例6中所述的一组犬科动物血清样品的肌酸酐vs.GFR、l/SDMA vs.CGF和1/[肌酸酐mM/TSDMA^hs.肌酸酐的使用线性拟合的曲线图。
[0030] 图9是如实施例7中所述的一组猫科动物血清样品的SDMA浓度vs .GFR的曲线图。
[0031] 图10是如实施例7中所述的一组猫科动物血清样品的肌酸酐浓度vs.GFR的曲线 图。
[0032]图11是如实施例7中所述的一组猫科动物血清样品的[肌酸酐]* [ SDMA ] V s. GFR的 曲线图。
[0033]图12显示了如实施例7中所述的一组犬科动物血清样品的[肌酸酐]vs.GFR、l/ SDM vs. CGF和1 /[肌酸酐1 ·2 ] * 1 /[ SDMtx 39] vs.肌酸酐的使用线性拟合的曲线图。
[0034]图13是显示在测定肾脏疾病的方法中改进的特异性和灵敏性的图。
[0035]图14显示了在狗体内在SDMA(微克/分升)与肌酸酐(毫克/分升)之间的相关性。 [0036]图15显示了在猫种群中的肌酸酐与SDMA的血清浓度。
[0037]图16显示了经几年的时间在猫体内的肌酸酐与SDMA的血清浓度。
[0038]图17显示了经几年的时间在猫体内的肌酸酐与SDMA的血清浓度。
[0039]图18显示了经几年的时间在猫体内的肌酸酐与SDMA的血清浓度。
[0040] 图19是Kaplan-Meier生存曲线，其显示了具有小于14微克/分升的血清SDMA浓度 的猫存活比具有大于14微克/分升的浓度的猫长大约1.6倍。
[0041 ] 图20是Kaplan-Meier生存曲线，其显示了具有小于14微克/分升的血清SDMA浓度 的狗存活比具有大于14微克/分升的浓度的狗长大约2.6倍。
[0042]发明详述
[0043] 在其不同方面，本公开涉及肾脏疾病和与肾脏疾病相关的死亡率的测定、诊断、进 展和预后。本公开包括用于测定动物的肾功能，特别是评估肾小球滤过率(GFR)的方法。GFR 可用于诊断和治疗肾脏疾病或功能障碍。
[0044] 在各个方面，本公开涉及来自动物，特别是猫和狗的血液样品中的游离对称性二 甲基精氨酸(SDMA)和肌酸酐用于测定肾小球滤过率和肾脏疾病的用途。在一方面，来自动 物的血液样品中的肌酸酐与游离SDMA的浓度的乘积可能与GFR和肾脏疾病相关。例如，使用 肌酸酐与游离SDM的乘积的倒数(例如1/[肌酸酐][SDMA])，并预料不到地获得了与使用单 独的任一种测量结果相比高得多的肾小球滤过率测量的准确度。因此，本公开包括以下方 法：测量来自动物受试者的血液样品中的游离SDMA浓度；测量来自动物受试者的血液样品 中的肌酸酐浓度;并通过将肌酸酐浓度与游离SDMA浓度的乘积的倒数与动物受试者的肾小 球滤过率的一个或多个标准值进行比较来测定该动物受试者的肾小球滤过率。本公开的其 它方面包括单独的SDMA浓度或SDMA浓度对肌酸酐浓度的比用于如本文中所述测定肾脏疾 病的用途。
[0045] SDMA是内源性一氧化氮合成酶(NOS)抑制剂非对称性二甲基精氨酸(ADM)的结构 异构体。ADMA和SDMA衍生自左旋精氨酸残余物的核内甲基化，并在蛋白酶解后释放到细胞 质中。SDMA由蛋白-精氨酸甲基转移酶5(PRMT 5)和PRMT 7制造。携带甲基精氨酸的蛋白质， 如SDMA、单甲基精氨酸和ADMA，在RNA加工、蛋白质穿梭和信号转导中起作用（Bedford和 Richard,Mol.Cell ,2005年4月29日，18(3):263-72)。来自于此类甲基化蛋白质的降解的游 离SDMA主要通过肾脏排泄来消除，而ADM在很大程度上被代谢。ADMA与冠状动脉疾病(CAD) 如高血压、高胆固醇血症、高同型半胱氨酸血症、胰岛素抵抗、年龄和平均动脉压的风险因 素强相关。SDMA与肾功能的参数如肾小球滤过率(GFR)、菊粉廓清率和肌酸酐廓清率相关。
[0046] 因此，本公开的一个方面涉及通过使用血清中的游离SDMA浓度与肌酸酐浓度的值 评估动物受试者的肾小球滤过率的方法。所述值的乘积的倒数(1/[肌酸酐][SDMA])与单独 的肌酸酐浓度或SDM浓度相比更精确地与GFR线性相关。
[0047] 下面定义了一些术语：
[0048] Ab是抗体。
[0049] ADMA是不对称二甲某精氛酸。ADMA的结构是：
[0050]
[00511 BUN是血液尿素氮。
[0052] BSA是牛血清白蛋白。
[0053] CMIA是化学发光磁性免疫分析法。
[0054] DCM是二氯甲烷。
[0055] DIPEA是N，N-二异丙基乙胺。
[0056] DMF是二甲基甲酰胺。
[0057] EIA是酶免疫分析法。
[0058] ELISA是酶联免疫吸附测定法。
[0059] ESI-MS是电喷雾离子化质谱法。
[0060] FPIA是荧光偏振免疫分析法。
[0061 ] GFR是肾小球滤过率。
[0062] HATU是（1H-7-氮杂苯并三唑-1-基）-1，1，3,3_四甲基脲六氟磷酸酯 methanamininium〇
[0063] KLH是钥孔虫戚血兰素。
[0064] MEIA是微粒子酶免疫分析法。
[0065] NOS是一氧化氮合成酶。
[0066] PBS是磷酸盐缓冲盐水。
[0067] RIA是放射免疫分析法。
[0068] SDMA是对称性二甲基精氨酸。SDMA的结构是：
[0069]
[0070] 游离SDMA指的是并非作为多肽链的一部分的SDMAt3SDMA的一个或多个氨基酸残基 可以存在于多肽中。
[0071] SLE是系统性红斑狼疮。
[0072] TFA是三氟乙酸。
[0073]精氨酸的结构是：
[0074]
[0075] N-MMA是N-单甲基精氨酸，或简单地为N-甲基精氨酸。N-单甲基精氨酸的结构是：
[0076]
[0077] 本文中所用的术语"类似物"通常是指其中一个或多个的个别原子已经替换为不 同原子或不同官能团的化合物。例如，类似物可以是分析物的修饰形式，其可以与用于受体 的分析物竞争，该修饰提供了分析物连接至另一部分如标记或固体载体的手段。该分析物 类似物可以以类似于分析物的方式结合到抗体上。
[0078] 本文中所用的术语"抗体"通常是指由B淋巴细胞响应暴露于抗原产生的糖蛋白并 特异性结合至该抗原。术语"抗体"以其最宽泛的含义使用，并明确覆盖单克隆抗体(包括全 长单克隆抗体）、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体），以及抗体片段，只要它们 表现出所需的生物活性。
[0079] 本文中使用的"抗SDMA"、"抗SDMA抗体蛋白"或"抗SDMA抗体片段"和/或"抗SDMA抗 体变体"等等包括含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分，例如但不限于重链的一个互补 决定区(CDR)或轻链稳定区、框架区或其任意部分的分子的任何蛋白质或肽。
[0080] 本文中所用的术语"抗体片段"是指全长抗体的一部分，通常是其抗原结合域或可 变域。具体而言，例如，抗体片段可以包括?&13、？ &13'、？(&13'）2和?￥片段;双体;线型抗体;单 链抗体分子;和来自抗体片段的多特异性抗体。
[0081] 本文中所用的术语"抗原"通常是指在适当条件下能够与对该抗原为特异性的抗 体发生反应的物质。
[0082] 本文中所用的术语"分析物"通常是指被检测和/或被测量的样品中的物质或物质 的集合。
[0083] 本文中所用的术语"动物"通常是指任何动物，例如人类，或非人类动物如猫、狗或 马。
[0084] 本文中所用的术语"血液样品"通常是指任何衍生自血液的流体样品，包括但不限 于全血、血浆和血清。为了提供用于本公开的方法的血清，一种或多种血清样品获自动物受 试者。该血清样品可以例如以血液样品形式获自动物受试者，随后分离以提供血清。在某些 实施方案中，可以在不从血液中分离的情况下对血清进行测量。本领域技术人员将认识到， 单次获得的样品可以分开或以其它方式用于进行两种浓度测量。或者，可以从动物受试者 获取多个样品，（至少)一个样品测量肌酸酐浓度，（至少)一个样品测量游离SDMA浓度。在某 些此类情况下，样品大致同时(例如在另一样品的60分钟内、30分钟内或甚至10分钟内）获 自该动物。
[0085] 本文中所用的术语"交叉反应性"通常是指抗体的个别抗原结合部位与超过一个 抗原决定簇反应的能力或抗体分子种群与超过一种抗原反应的能力。通常，交叉反应的产 生是由于（i)该交叉反应抗原共享与免疫抗原共有的表位，或（ii)其具有在结构上与免疫 抗原上的相类似的表位(多特异性）。
[0086] 本文中所用的术语"免疫分析法"通常是指使用抗体和抗原复合物产生可测量的 响应的测试。"抗体:抗原复合物"可以与术语"免疫复合物"互换使用。通常，免疫分析法包 括非竞争性免疫分析法、竞争性免疫分析法、均相免疫分析法和非均相免疫分析法。在"竞 争性免疫分析法"中，通过未标记分析物(或抗原)在免疫分析法中与标记抗原竞争的能力 来测量测试样品中的未标记分析物(或抗原）。未标记抗原阻断标记抗原结合的能力，因为 该抗体上的结合部位已经被占据。在"竞争性免疫分析法"中，测试样品中存在的抗原的量 与该标记产生的信号量负相关。相反，在"非竞争性免疫分析法"一一也称为"夹心"免疫分 析法中，分析物结合在两个高度特异性的抗体试剂之间形成复合物，抗原的量和与该复合 物相关的信号量成正比。需要分离结合的抗体:抗原复合物的免疫分析法通常称为"非均相 免疫分析法"，不需要分离抗体:抗原复合物的免疫分析法通常称为"均相免疫分析法"。本 领域技术人员将容易地理解各种免疫分析格式。
[0087] 本文中所用的术语"免疫复合物"通常是指通过抗原与抗体分子的结合形成的复 合物，具有或不具有补体结合。当抗体或抗原之一被标记时，该标记因抗原与抗体之间的结 合而与该免疫复合物相关联。因此，当抗体被标记时，标记因结合变得与抗原相关联。类似