体(可购自 Sigma-Aldrich)〇
[0163 ]类似物A-D的缀合物可以使用与方案2中所述的类似方法制得。
[0164] 式A-D的类似物与马来酰亚胺活化KLH或马来酰亚胺活化BSA的缀合物可以用作免 疫原以产生显著结合SDMA的抗体（即抗SDMA抗体），并且不显示或基本不显示与ADMA、左旋 精氨酸和/或N-甲基精氨酸的交叉反应性。式(3)的类似物与马来酰亚胺活化KLH或马来酰 亚胺活化BSA的缀合物可以用作免疫原以产生显著结合SDMA的抗体（即抗SDMA抗体）。此类 抗体不显示或基本不显示与ADMA、左旋精氨酸和/或N-甲基精氨酸的交叉反应性。
[0165] 可用于本公开的方法、装置和试剂盒的抗SDMA抗体的特征在于对SDMA的高亲和力 结合和对ADMA、精氨酸和/或单甲基精氨酸具有很少或不具有交叉反应性。因此，本文中描 述的是分离的、重组的、合成的和/或体内产生的抗SDMA抗体，以及制造和使用此类抗体的 方法，包括诊断和治疗组合物、方法和装置。本文中描述的抗SDMA抗体可以例如用作肾功能 如肾损伤、肾机能不足、肾小球滤过率(GFR)、菊粉廓清率和肌酸酐廓清率的诊断标记物，以 及用于肾脏病症/疾病，如慢性肾脏疾病、肾小球肾炎、糖尿病性肾病、间质性肾炎、多囊性 肾脏疾病和高血压性肾脏疾病。
[0166] 在一个实施方案中，生成的抗体能够检测游离SDMA(即并非多肽链的一部分的 SDMA)并且不显示或基本不显示与ADMA、左旋精氨酸和/或N-甲基精氨酸的交叉反应性。如 实施例中所示，基于等浓度的抗原，本文中描述的抗体显示小于I %的与ADMA、左旋精氨酸 和/或N-甲基精氨酸的交叉反应性。如本领域中通常理解的那样，交叉反应性的影响将取决 于该交叉反应的抗原（例如ADMA、左旋精氨酸和/或N-甲基精氨酸)与测试样品中的免疫抗 原（SDMA)相比的相对丰度。例如，如果免疫抗原的浓度比交叉反应抗原的浓度高100倍，高 达50 %的交叉反应性是可以接受的。相反，如果交叉反应抗原的浓度是免疫抗原的100倍， 低至1 %的交叉反应性可能是有问题的。因此，交叉反应性的影响必须在待分析样品中任何 交叉反应抗原和免疫抗原的相对丰度的背景下进行考虑。在本公开的不同方面，交叉反应 性不会影响SDM或SDM类似物与抗SDM抗体的实质性结合。
[0167] 制造抗体的方法可以包括使用一种或多种SDMA缀合物作为免疫原以刺激免疫应 答。该方法包括使用合适的免疫方案向动物施用一种或多种SDMA缀合物，并从该动物的体 液中分离合适的抗体，例如如下文实施例3中所述。或者，该SDMA缀合物可以在噬菌体展示 法中使用以选择在其表面上展示合适的抗体的噬菌体，接着分离编码合适的抗体的至少可 变域区域的核酸序列。噬菌体展示法是本领域技术人员公知的（参见例如Antibody Phage Display!Methods in Molecular Biology，第178卷，0'Brien，Phi Iippa M.；Aitken, Robert (Eds.) 2002)。可以通过本领域通常已知的方法制备针对SDMA的单克隆抗体。
[0168] 本文中描述的SDMA类似物可以连接到标记上以提供用于受体结合测定（如用于 SDMA的免疫分析法)的可检测的缀合物。类似地，抗SDMA抗体可以连接到标记上以提供用于 受体结合测定(如用于SDM的免疫分析法)的可检测的抗SDMA抗体。该SDMA类似物和抗SDMA 抗体可以使用本领域技术人员公知的方法连接到标记上（例如Immunochemi cal Protocols;Methods in Molecular Biology,第295卷，R.Burns编辑（2005))。可检测的 SDMA缀合物或可检测的抗SDMA抗体可以用于各种均相、夹心、竞争性或非竞争性测定格式 中以产生与测试样品中SDM的存在或量相关的信号。
[0169] 在特定实施方案中，该免疫分析方法是用于检测抗SDMA抗体的竞争性免疫分析 法。该竞争性免疫分析法可以以下列说明性方式进行。使可能含有抗SDMA抗体的来自动物 体液的样品与缀合到固体载体上的SDMA类似物接触和与缀合到可检测标记上的抗SDMA抗 体接触。样品中存在的感兴趣抗SDMA抗体与缀合到可检测标记上的抗SDMA抗体竞争与缀合 到固体载体上的SDMA类似物的结合。与固体载体相关联的标记的量可以在将未结合抗体与 固体载体分离后测定。在一种替代实施方案中，以下列说明性方式进行竞争性免疫分析法。 使可能含有抗SDMA抗体的来自动物体液的样品与连接到可检测标记上的SDMA类似物接触 并随后与缀合到固体载体上的抗体接触。样品中的抗SDMA抗体与固体载体上的抗SDMA抗体 竞争以便与连接到可检测标记上的SDMA缀合物结合。在这两种情况下，获得的信号与样品 中存在的感兴趣SDM抗体的量呈负相关。
[0170] 当然，测量游离SDMA的其它方法可以在本文中描述的方法中使用。SDMA本身可以 可以预测疾病(参见图2和3)。
[0171] 血清中的肌酸酐浓度可以如本领域技术人员已知那样以多种方式测量。例如，可 以使用具有适于测试肌酸酐的干载玻片的Catalyst Dx? Chemistry Analyzer或 'VbtTe.St?:Chemistry Analyzer，例如，可购自 IDEXX Laboratories的那些。也可以使用其 它分析仪和载玻片，如可获自Ortho Clinical Diagnostics的VlTROSOi^SO分析仪和 VITROS? CREA载玻片。酶促湿法测定也可以使用。例如，本领域技术人员可以在Integra 800分析仪上使用酶促湿化学法。一种特定的测定基于肌酸酐酶/肌酸脱水酶/肌氨酸氧化 酶体系，在552纳米下检测，吸光度消隐(blanking)在659纳米。本领域技术人员还可以使用 比色法，例如，基于苦味酸盐的那些，如Jaff e测定。本领域技术人员已知的其它方法，如美 国专利公开号2005/0266574和美国专利号4,818,703(其各自经此引用并入本文）中描述的 那些，也可用于测量肌酸酐浓度。在某些实施方案中，使用同位素稀释质谱法进行肌酸酐浓 度的测量。
[0172] 测定GFR的几种方法是已知的。例如，可以如Perrone等人，Am.J.Kidney Disease， 第 16卷，第224-35页（1990)和Levey等人，J.Am. Soc .Nephrol ·，第4卷，第 1159-71页（1993) 中所述(其各自经此引用全文并入本文），作为125I-碘酞酸盐的肾脏清除率来测定GFR。其它 基于尿液收集的方法也可以使用，包括测量其它外源物质的肾脏清除率，例如 51Cr-EDTA、 "Tc-DTPA、碘海醇或菊粉。通过任意这些方法获得的GFR值可以与大约同时收集的样品的肌 酸酐和游离SDM的浓度的倒数乘积相关，以提供用于本文中描述的方法的校准曲线或标准 值。
[0173]提供以下内容仅用于例示目的，并非意在限制上文中以广义描述的本发明的范 围。本公开中引用的所有参考文献经此引用并入本文。 实施例
[0174] 实施例1:合成SDMA胱酰胺(3)和SDMA胱酰胺盐酸盐(4)
[0175] 按照方案1中描述的合成路线制备SDMA胱酰胺(3)。
[0176] (BOC)3-SDMA(I):在室温下在搅拌的情况下在30分钟内向4.36克(20毫摩尔）二碳 酸二叔丁酯(Boc 2O)在20毫升二氧杂环己烷中的溶液中滴加溶解在10毫升5.ON NaOH中的 550毫克（2.0毫摩尔）的N，N-二甲基精氨酸二盐酸盐（SDMA)(可购自Gibbstown，NJ的EMD Chemicals Inc.)。所得反应混合物搅拌过夜。随后向反应混合物中加入30毫升二氯甲烷 (DCM)和30毫升水，并用乙酸(AcOH)将pH调节至6.5。将DCM层分离，用盐水洗涤并经无水 Na2SO4干燥。随后在减压下除去DCM以提供固体。所得固体用10毫升己烷洗涤2次。该固体随 后在真空下干燥，得到800毫克的浅黄色固体。随后的反应不需要进一步提纯。通过质谱法 表征该固体。ESI-MS: 525.7(M+Na) +，503.6(M+1 )+,403.5(M-Boc+l ) + ,303.5(M-2Boc+l) +。
[0177] (Boc)3-SDMA-胱胺树脂(2):向 600毫克（I. 2毫摩尔）的(Boc)3-SDMA(I)和627 毫克 (i . 6毫摩尔）的2-(1Η-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯甲铵(HATU) 在15毫升二甲基甲酰胺(DMF)中的混合物中加入420微升(2.4毫摩尔）的N，N-二异丙基乙胺 (DIPEA)。所得混合物随后在干燥的N 2气氛下搅拌20分钟。单独地，将胱胺4-甲氧基三苯甲 基树脂（I. 〇克）（可购自Gibbs town，NJ的EMD Chemicals，Inc.)溶胀并使用DMF洗涤。溶胀的 树脂随后添加到反应混合物中，并将反应混合物在N2气氛下温和摇振三小时。随后通过过 滤收集树脂，并用5毫升DMF、5毫升甲醇和5毫升DCM连续洗涤。
[0178] SDMA胱酰胺(3):向修饰的树脂中加入15毫升90%的三氟乙酸(TFA)，所得混合物 温和摇振两小时并过滤。树脂用3毫升TFA/DCM(1:1 (v/v))洗涤两次。将滤液和洗液合并，加 入到200毫升冷乙醚中以提供沉淀物。离心收集所得沉淀物并在减压下干燥以提供300毫克 SDMA胱酰胺(3)。该SDMA胱酰胺(3)通过质谱法表征。EIS-MS:262·4(Μ+1) +，132·0(Μ+2) +。
[0179] SDMA胱酰胺盐酸盐(4) :SDMA胱酰胺(3)(300毫克)在5毫升I.ON HCl中重构，将所 得混合物冻干以提供泡沫形式的浅黄色固体。
[0180]上述相同的一般程序可用于制备其它SDMA类似物。
[0181 ] 实施例2:用马来酰亚胺活化蛋白缀合SDMA胱酰胺(3)
[0182] A.用马来酰亚胺活化KLH缀合SDMA胱酰胺(3)的一般程序：
[0183] 1 ·缓慢打开马来酰亚胺活化KLH(可购自Sigma-Aldrich St · Louis，M0(目录号 K0383))的小瓶以释放真空。
[0184] 2.用1毫升水重构小瓶的内容物，以提供在含有230mM NaCl、2mM EDTA和80mM蔗 糖，pH 6.6的20mM磷酸钠缓冲液中的5毫克/毫升马来酰亚胺活化KLH溶液。
[0185] 3.通过用10毫升水重构缀合缓冲液(可购自Sigma-Aldrich St.Louis,M0(目录号 C3957))制备含有IOOmM EDTA和80mM蔗糖，pH 6.6的20mM磷酸钠缓冲液的缀合缓冲溶液。
[0186] 4.在0.5毫升缀合缓冲液中溶解大约0.8毫克半抗原（即SDMA胱酰胺(3))。保留50 微升所得肽溶液用于测定偶联效率(hap-total)。保留的半抗原溶液储存在2-8°C下。
[0187] 5.步骤4的半抗原溶液立即与步骤2的马来酰亚胺活化KLH溶液在装有搅拌棒的反 应瓶中混合。所得混合物在搅拌的同时在温和的氮气流下脱气大约1 -2分钟。
[0188] 6.将反应瓶封盖并在室温下持续搅拌2小时或在2_8°C下持续搅拌过夜。
[0189] 7.保留100微升来自步骤6的缀合反应物(hap-free)用于测定偶联效率。
[0190] B:用马来酰亚胺活化BSA缀合SDMA胱酰胺(3)的一般程序：
[0191 ] 1 ·缓慢打开马来酰亚胺活化BSA(可购自Sigma-Aldrich St · Louis，M0(目录号 B7542))的小瓶以释放真空。
[0192] 2.用1毫升水重构小瓶的内容物，以提供在含有230mM NaCl、2mM EDTA和80mM蔗 糖，pH 6.6的20mM磷酸钠缓冲液中的5毫克/毫升马来酰亚胺活化BSA溶液。
[0193] 3.在0.5毫升缀合缓冲液(如上述步骤A3所述制备）中溶解5毫克半抗原（即SDMA胱 酰胺(3))。保留50微升所得肽溶液用于测定偶联效率(hap-total)。保留的半抗原溶液储存 在2 _8 C下。
[0194] 4.步骤3的半抗原溶液立即与步骤2的马来酰亚胺活化BSA溶液在装有搅拌棒的反 应瓶中混合。所得混合物在搅拌的同时在温和的氮气流下脱气大约1 -2分钟。
[0195] 5.将反应瓶封盖并在室温下持续搅拌2小时或在2_8°C下持续搅拌过夜。
[0196] 6.保留100微升来自步骤5的缀合反应物(hap-free)用于测定偶联效率。
[0197] C:分离KLH或BSA缀合物：
[0198] 1 ·将磷酸盐缓冲盐水包(PBS)包装的内容物(可购自Sigma-Aldrich St · Louis，M0 (目录号P3813))溶解在1升水中。
[0199] 2.在烧杯上支承Sephadex G-25M凝胶过滤柱(可购自 Sigma-Aldrich St .Louis, M0(目录号B4783))。
[0200] 3.从柱顶部除去顶盖，切开柱的下部尖端，令过量液体流过。不允许柱干涸。
[0201] 4.用30毫升PBS平衡该柱。
[0202] 5.将来自实施例2A或2B的反应混合物施加至该柱。
[0203] 6.用PBS洗脱该柱，使用大约10毫升的总体积并收集大约0.5-1.0毫升的馏分。通 过在280纳米下测量各馏分的吸光度来监控馏分中蛋白质的存在。
[0204] 7 ·将含有蛋白质的馏分合并。图4图示了蛋白质KLH( ?)和BSA( )的吸光度vs ·示 例性洗脱曲线的馏分数。
[0205] 8.将含有蛋白质的馏分分为小的等分试样，其在-20 °C下冷冻储存。
[0206] D.测定偶联效率的检测：
[0207] 1.半胱氨酸标准检测-为了评估类似物对半胱氨酸肽的偶联效率，使用已知浓度 的半胱氨酸制备标准曲线。该检测基于5，5 二硫代双(2-硝基苯甲酸）（DTNB或El Iman ' s试 剂)的反应，所述试剂与巯基基团在pH 8.0下反应以产生在412纳米处具有最大吸收的发色 团。遵循下列程序：
[0208] a.通过将 DTNB 缓冲剂（可购自 Sigma-Aldrich St.Louis，M0(目录号 D4179))的小 瓶内容物溶解在10毫升水中来制备DTNB缓冲液。
[0209] b.随后将DTNB试剂（可购自 Sigma-Aldrich St .Louis，M0(目录号D8130))溶解在5 毫升来自步骤a的DTNB缓冲液中。
[0210] c.在即将使用前，在1毫升水中溶解32毫克L-半胱氨酸盐酸盐一水合物（可购自 Sigma-Aldrich St .Louis，M0(目录号C7880))来制备半胱氨酸溶液。所得L-半胱氨酸盐酸 盐溶液用水连续稀释以提供〇. 4-0.04毫克/毫升范围内的稀释原液。立即使用该稀释原液。 [0211] d.向标记的试管中加入50微升稀释原液。含有50微升水的试管用作空白样。
[0212] e.随后向各试管中加入〇. 1毫升水、〇. 75毫升DTNB缓冲液(pH8.0)，并立即加入0.1 毫升DTNB试剂溶液(1毫克/毫升）以提供体积为1毫升的最终半胱氨酸标准测定溶液。
[0213] f.混合各试管的内容物。
[0214] g.在412纳米下测定各半胱氨酸标准测定溶液的吸光度。如果吸光度高于1.4,将 该样品稀释并重复该测定。
[0215] h.将412纳米处的吸光度相对于半胱氨酸浓度(毫克/毫升)进行绘图以提供标准 曲线。该标准曲线的线性部分(半胱氨酸浓度范围为2-20微克/毫升)用于测定hap-total和 hap-free〇
[0216] 2.半抗原测定-备注：如果样品生成高于半胱氨酸标准测定中最高的半胱氨酸标 样的值，将该样品稀释并重复该测定。
[0217] a.向适当标记的试管中添加50微升的下列溶液：
[0218] (i)DTNB缓冲液（空白样）
[0219 ] (i i)稀释的肽样品(hap-to ta 1，来自实施例2的KLH缀合步骤A4)
[0220] (iii)半抗原-KLH(hap-free，来自实施例2的KLH缀合步骤A7)
[0221 ] (iv)稀释的肽样品(hap-total，来自实施例2的BSA缀合步骤B3)
[0222] (V) hap-BSA (hap-f ree，来自实施例 2 的 BSA 缀合步骤 B6)
[0223] b .向来自步骤（a)的各标记试管中加入0.1毫升水、0.75毫升DTNB缓冲液（pH 8.0)，并立即加入0.1毫升DTNB试剂溶液（1毫克/毫升），以提供体积为1毫升的最终半抗原 测定溶液。
[0224] c.混合各试管的内容物。
[0225] d.在412纳米下测定各标记试管中的溶液的吸光度。如果吸光度高于1.4,将该样 品稀释并重复该测定。
[0226] e.随后使用如上文Ih部分中所述获得的标准曲线，由实测的吸光度确定hap-total的浓度 。对试管 （ i i)和试管 （ iv)测得的 吸光度分别用于测定 KLH 和 BSA 的 hap-total 。 对试管（iii)和试管(V)测得的吸光度分别用于测定KLH和BSA的hap-free。随后如下文所述 计算未稀释溶液中的肽浓度和偶联效率。
[0227] 3.计算
[0228] 为了评估肽浓度和偶联效率，如上所述使用已知浓度的半胱氨酸制备标准曲线 (半胱氨酸标准测定）。在该计算中，一摩尔半胱氨酸等价于一摩尔含有巯基的半抗原。
[0229] 采用