专利名称：生产乳过氧化物酶的方法
技术领域：
本发明涉及从乳原料生产高纯度乳过氧化物酶(lactoperoxidase)的方法。本发明要求2004年2月17日提交的日本专利申请No.2004-039704的优先权，其内容并入本文作为参考。
背景技术：
乳过氧化物酶是一种氧化还原酶，其包含在哺乳动物乳液如牛乳，和其它分泌物如唾液(saliva)、泪液(lacrymal fluid)和呼吸道粘液(respiratory tractmucus)中(例如，American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine，U.S.A.Vol.166，2002，p.S57至S61)。乳过氧化物酶是分子量约80,000的蛋白质。乳过氧化物酶具有血红素(heme)作为每一个分子的辅酶。由于此血红素的最大吸收波长(maximum absorption wavelength)为大约412nm，高度纯化的乳过氧化物酶显褐色(例如，British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25)。
据报道，乳过氧化物酶具有各种生物学功能诸如抗细菌性质(antibacterialproperty)、抗病毒活性(antiviral activity)、抗氧化活性(antioxidative activity)、抗癌活性(anticancer activity)和免疫调节活性(immunoregulatory activity)(例如，所述的British Journal of Nutrition，England，Vol.84，2000，p.S19至S25和Life Sciences，England，Vol.43，1988，p.739至745)，而且已显示这是一种与宿主防御(host defense)有关的非常重要的蛋白质。关于所述乳过氧化物酶的工业应用，有公开的技术如乳过氧化物酶、过氧化物供体和硫氰酸盐(thiocyanate)在制造治疗幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)感染的药物中的用途(例如，PCT公开的日文文本No.2000-509367)；加入培养的水生动物的配合饲料中的病原菌传染病预防和治疗剂(例如，日本专利No.3103615)；老化预防剂(例如，日本专利No.3103167)；肝功能改善剂(hepatic function ameliorative agent)(例如，未审查的日本专利申请，第一次公开No.2001-226289)，过氧化物酶的预防和治疗应用(例如，PCT公开的日文文本No.H06-501453)；和用于角膜疾病的治疗剂(例如，日本专利No.2840795)。此外，有本发明人公开的技术如脲酶-失活组合物和饮料(例如，未审查的日本专利申请，第一次公开No.2002-238554)，和肠内菌丛(intestinal flora)改进剂和食品和饮料(例如，未审查的日本专利申请，第一次公开No.2003-246753)。
在Acta Chemica Scandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184；FEBSLetters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204；和Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287中报道了以实验室规模纯化过氧化物酶的方法。
作为其通常方法，有如下已知方法将酸如氢氯酸加入乳，进行等电点沉淀酪蛋白，以便于制备作为上清液的乳清；将得到的乳清与阳离子交换剂接触，以将乳清中带正电荷的乳过氧化物酶吸附到该阳离子交换剂中；接着，用低盐缓冲溶液洗涤此阳离子交换剂，然后用高盐缓冲溶液将乳过氧化物酶解吸。
在实验室规模的纯化方法中，为了改进乳过氧化物酶纯度，通常使用如下方法使用以具有小直径粒子的凝胶形式的阳离子交换剂高密度填充的柱子，和用高压泵实施高速通过(例如，Journal of Chromatography，Holland，Vol.795，1998，p.277至287)。
在另一方面，如果用具有相对大直径粒子的阳离子交换剂填充柱子，并通过自然滴落而不用高压泵实施通过，则花费较多的时间(例如，Acta ChemicaScandinavica，Denmark，Vol.23，1969，p.171至184，和FEBS Letters，Holland，Vol.110，1980，p.200至204)。
连同工业规模的分离技术中近来的进展，可能分离并纯化包含在乳中的高纯度生物活性物质用于大规模生产(mass production)。在大多数情况中，实际上难以将在实验室规模优化的蛋白质纯化方法按照原样放大到工业规模。一个主要的原因是实验室中通常使用的离子交换剂或柱的性能不是必然适于原材料的大规模处理。
此外，由于将添加剂加入乳原料易于改变乳的味道和物理性质，因此使用添加剂来从乳原料中纯化蛋白不是优选的。此外，如果使用大量的添加剂以洗涤阳离子交换剂和/或从该阳离子交换剂解吸蛋白质，那么需要从纯化的蛋白质中去除这些添加剂，因而生产过程变得复杂。
作为在从乳原料生产高纯度蛋白质中解决这些问题的生产方法，本申请人已提出了用于生产高纯度牛乳铁蛋白的方法(例如，已审查的日本专利申请，第二次公开No.H06-13560)关于乳过氧化物酶的工业生产方法，公开了如下方法在美国专利No.4667018的说明书中，公开了用于从乳或其乳衍生物中纯化蛋白如乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法。在此方法中，公开了如下方法将乳或其乳衍生物与包含阳离子多糖的阳离子交换剂接触；用低盐溶液洗涤该阳离子交换剂；然后用高盐溶液从阳离子交换剂解吸蛋白质。然而，由于在此专利文献中描述的方法中产生的蛋白质以混合物获得，所以纯度不高，而且存在不能生产高纯度乳过氧化物酶的问题。
在日本专利No.2985158中，公开了回收具有高活性的乳烃素级分(lactenin fraction)的方法。在此专利文献描述的此方法中，由于乳过氧化物酶作为构成乳烃素的一种组分获得，并包含在蛋白质混合物中，所以也存在不能生产高纯度乳过氧化物酶的问题。
在欧洲专利No.0518448的说明书中，作为从乳中分离蛋白质的方法，公开了使用金属螯合物载体(metal chelate carrier)的方法。在此方法中，由于分离的蛋白质是包含免疫球蛋白、乳铁蛋白和乳过氧化物酶的混合物，所以存在不能生产高纯度乳过氧化物酶的问题。
在日本专利No.3403066中，公开了从乳或乳衍生物中回收细胞增殖因子或含有一种或多种类型的细胞增殖因子的组合物的方法。然而，由于在此方法中得到的组合物是混合物，因此也存在该方法不能生产高纯度乳过氧化物酶的问题。
在日本专利No.2710283中，作为从乳清(whey)中选择性提取金属蛋白的方法，公开了包括以下步骤的方法将乳清与用含有羧基或磺酸基的葡聚糖涂覆的无机多孔粒子(二氧化硅粒子)接触。此方法中生产的乳过氧化物酶的纯度最高为大约50％，并且存在的问题是为了产生高纯度乳过氧化物酶，需要通过另一个步骤增加纯度。
在日本专利No.2553180中，公开了从乳清中提取乳过氧化物酶和乳铁蛋白的纯级分的方法。在此方法中，作为解决由阳离子交换剂的体积变化而引起的堵塞问题的手段，使用微滤的乳清作为乳原料。在此方法中，由于除了乳清之外不能使用其它乳原料，所以存在应用范围窄的问题。此外，也要求将微滤作为乳原料的预处理，这使生产步骤变得复杂。而且，将强阳离子交换剂作为阳离子交换剂，而且乳过氧化物酶和乳铁蛋白被具有不同盐浓度的缓冲溶液选择性解吸。此方法要求，为了洗涤阳离子交换剂和选择性解吸蛋白质，需要调节缓冲溶液的pH，因此使用大量的添加剂来制备所述的缓冲溶液。而且，存在各种问题以至于必需从纯化的蛋白质中去除添加剂，这成为进一步使步骤复杂的因素。
在日本专利No.2686831中，公开了使用强阳离子引入磺基的多糖亲和性载体(strongly cationic sulfone group-introduced polysaccharides affinity carrier)作为阳离子交换剂来分离和纯化铁结合蛋白的方法。在此方法中，产生了相对高度纯化(纯度85％)的乳过氧化物酶。然而，洗涤吸附处理之后的阳离子交换剂步骤中，用pH调节至5或更低的缓冲溶液进行洗涤处理是必须的。而且，为了选择性解吸乳过氧化物酶和乳铁蛋白，需要具有各自不同的盐浓度的pH 5或更低的缓冲溶液。
在未审查的日本专利申请，第一次公开No.H05-202098中，作为从乳原料中生产生物活性物质的方法，公开了可以使用具有磺基的强阳离子交换剂和具有羧基的弱阳离子交换剂中任一种的方法。然而，在此方法中，还存在需要pH5或更低的缓冲溶液以在吸附处理后能够洗涤阳离子交换剂并选择性解吸乳过氧化物酶的问题。
在美国专利No.5596082中，公开了从乳和乳制品中分离乳铁蛋白和乳过氧化物酶的方法，在此专利中，为了使得以高流速通过乳和乳制品，将具有大直径粒子的物理稳定的凝胶用作阳离子交换剂。在此方法，也存在需要使用缓冲溶液调节pH以在吸附处理后洗涤阳离子交换剂并选择性解吸乳过氧化物酶的问题。由于此专利中没有生产的乳过氧化物酶纯度的描述，所以不确定是否能够生产高度纯化的乳过氧化物酶。
如上所述，在生产乳过氧化物酶的大多数常规方法中，从乳原料回收的乳过氧化物酶是作为其与其它蛋白质的混合物得到，而纯度并不是足够高。而且，为了增加乳过氧化物酶的纯度，需要其它纯化步骤，于是为此需要时间和生产成本。
而且，即使在乳过氧化物酶的纯度相对较高的生产方法中，还存在需要以下问题在各步中调节pH以选择性吸附乳原料中含有的乳过氧化物酶，洗涤该阳离子交换剂，和选择性解吸蛋白质，从而需要使用大量添加剂。
发明内容
本发明人经过认真地研究，从而解决了上述问题。结果，发现了一种方法，其通过使用离子交换方法和超滤膜方法进行处理步骤，能够直接从乳原料工业化生产高纯度乳过氧化物酶，而在全部生产步骤中不进行pH调节，并由此完成了本发明。
即，本发明的生产乳过氧化物酶的方法，其包括步骤(1)将一种或多种乳原料与具有弱酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂接触，由此实现吸附处理；步骤(2)洗涤所述吸附处理之后的阳离子交换剂；步骤(3)将所述洗涤的阳离子交换剂与洗脱乳过氧化物酶的浸出溶剂接触，由此得到乳过氧化物酶洗脱进入所述浸出溶剂的浸出溶液；步骤(4)通过超滤膜浓缩所述浸出溶液，由此实现在浓缩的浸出溶液中的沉淀；和步骤(5)通过从浓缩的浸出溶液中去除沉淀得到乳过氧化物酶溶液。
具体实施例方式
下面是本发明优选实施例的详述。然而，本发明不限于如下优选的实施例，并且可以在本发明的范围内自由地改变。
本发明考虑了常规技术的问题和情况，旨在提供生产乳过氧化物酶的方法，其能够以比常规方法更简单的步骤，用更短的时间，更低的成本生产高度纯化的乳过氧化物酶，同时防止由于使用添加剂所引起的乳原料组成和质量的变化，而且其能以工业规模应用于生产。
下面是本发明中优选的条件和获得效果的说明。
在本发明中，当将10ml的阳离子交换剂置于1kg未加热的脱脂乳中时，优选该阳离子交换剂的乳铁蛋白吸附能力为85mg/10ml或更多。
离子交换基团优选羧甲基。
在步骤(4)中，优选进行浓缩以使浸出溶液中的蛋白质含量变为0.9至15％，由此实现沉淀。
优选在步骤(3)中使用的浸出溶剂的离子强度为0.07至0.3。
优选在步骤(3)中使用的浸出溶剂是含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中至少一种盐的水溶液。
优选还提供通过去除在所述步骤(5)中得到的乳过氧化物酶溶液的溶剂来获得固体乳过氧化物酶的步骤。
优选在上述步骤中得到的固体乳过氧化物酶的纯度是80％或更多。
在本发明中，当吸附入阳离子交换剂的乳过氧化物酶被洗脱至浸出溶剂时，得到了该乳过氧化物酶与其它级分(杂质)的混合物。然后，当使用超滤膜进行浓缩时，将其它级分(杂质)选择性地分离并通过溶解度的差异去除。结果，可得到高纯度的乳过氧化物酶。
因此，根据本发明，可得到如下效果。
(1)可选择性地回收乳过氧化物酶，而不经过需要调节pH的步骤。
(2)可通过简单的步骤，更短时间和更低成本生产高纯度乳过氧化物酶。
(3)由于不需要缓冲溶液和大量添加剂，从而降低了成本，这点是有利的。
(4)可防止由于使用添加剂而引起的乳原料组成和质量的改变。
(5)可容易地应用于工业规模。
(6)可广泛地应用除乳清之外的乳原料作为与阳离子交换剂接触的原料。
下面是本发明的优选实施例的更详细的说明。
关于本说明书中蛋白质含量，通过Kjeldahl方法测定样品中的氮含量并表示为使用氮/蛋白转换因子6.38转换的百分比。
而且，通过高效液相色谱(HPLC)分析乳过氧化物酶的纯度，并表示为乳过氧化物酶的峰面积相对于由样品中的蛋白质得到的总峰面积的比率(百分比)。
在本说明书中，除上述的蛋白质含量和纯度之外的百分比，除非具体说明，都是基于质量得到。
作为能够用于本发明的乳原料，可使用至少含有乳过氧化物酶的任何乳原料。例如，由哺乳动物如人、奶牛、水牛、绵羊、山羊和马得到的乳、脱脂乳、乳清等等。其中，优选使用在轻微热处理条件下处理的或未加热的乳原料。而且，可使用含有溶于水或缓冲溶液的脱脂奶粉、全脂奶粉、乳清粉、乳清蛋白浓缩物(whey protein condensate，WPC)、乳清蛋白分离物(wheyprotein isolate，WPI)等的溶液。此外，可使用已通过等电点沉淀或通过凝乳酶去除酪蛋白的上清液，或生产乳酪时排出的乳酪乳清。可使用这些乳原料，甚至无需通过澄清器或通过如微滤和过滤等操作预先除去沉淀。
在本发明中，具体地，优选使用源自奶牛的乳原料作为乳原料而生产牛乳过氧化物酶。
可单独使用乳原料，或可组合使用其多种类型。
下面将描述本发明的生产方法。
(1)首先，将乳原料与阳离子交换剂接触由此实现吸附处理。使用具有弱酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂。作为弱酸性离子交换基团，可选择在可作为具有预期目的的合适离子交换基团起作用的基团范围内可选的任何离子交换基团。弱酸性离子交换基团的实例包括羧基、羧甲基、酚基(phenol group)等。优选羧甲基。
所述阳离子交换剂无具体限制，并可根据需要任意选择。优选的阳离子交换剂的实例包括含有交联的多糖(诸如琼脂糖、葡聚糖和纤维素)的多孔粒子，亲水性硅胶、合成的聚合物等等，它们引入有弱酸性离子交换基团。作为其具体实例，可优选使用SEPABEADS FP-CM13(交换基团羧甲基，由Mitsubishi Chemical Corporation制备)、CM-Sephadex C-50(交换基团羧甲基，由Amersham plc.制备)和CM-Sepharose-FF(交换基团羧甲基，由Amershamplc.制备)。
所述阳离子交换剂的形状、大小、表面条件、材料等是任选的，并可根据需要选择。使用方式的实例包括已经填充了离子交换剂的树脂的预填充柱(pre-packed column)，和介质(medium)如其中填充阳离子交换剂的树脂珠的柱子。在这些情况中，从方便的观点出发，优选将一种类型的阳离子交换剂与一个容器组合使用。然而，根据需要，可将多个分别填充树脂珠的容器串联或并联以进行层析。容器的形状可根据需要进行选择。然而，优选地，形状容易洗涤并提供很多与包含的树脂珠等的接触面，而且内壁优选具有光滑的表面而无凹凸不平。具体地，可优选使用具有圆形面如管状(圆筒状和杆状)和圆锥状作为容器的形状。可任意选择容器的材料，然而，可优选使用不锈钢、玻璃、聚丙烯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙酯(polyethylene terephthalate)、聚碳酸酯、丙烯酸类树脂(acrylic resin)等。可根据处理的规模适当地选择容器的大小，并可以任意选择从诸如几立方厘米到几立方米的规模。可优选用于本发明的商业可得到的预填充柱包括HIPREP 10/16CM FF(交换基团羧甲基，由Amersham plc.制备)，和CM-TOYOPEARLPAK650系列(交换基团羧甲基，由Tosoh Corporation制备)。
在此，为了提高乳过氧化物酶的回收率，优选地在如下步骤中，当将吸附处理之后的阳离子交换剂与浸出溶剂接触时，吸附入阳离子交换剂的蛋白质容易解吸并洗脱至浸出溶剂中。因此，在本发明中，优选乳原料中的蛋白质不是强烈结合于阳离子交换剂。在具有强酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂中，离子交换基团在宽的pH范围内解离。在另一方面，在具有强酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂中，电荷根据pH变化。结果，其具有改变蛋白结合能力的性质，并因此适用于本发明的生产方法。在本发明中，可限定酸解离常数小于3的离子交换基团为强酸性基团，酸解离常数大于或等于3的离子交换基团为弱酸性基团。强酸性基团的实例包括磺酸基，而弱酸性基团的实例包括羧甲基。
而且，用于本发明的阳离子交换剂的多孔性和吸附性的数值范围可以任意选择。此外，对具有与乳过氧化物酶近似相同的等电点和分子量的蛋白质(具体为具有70至90kDa的分子量和7至9的等电点的蛋白质)的吸附能力可表示为指标(index)。其中，关于乳铁蛋白(分子量大约80kDa和等电点大约8)的吸附能力优选表示为指标。可通过例如，已审查的日本专利申请，第二次公开No.H06-13560中描述的方法得到相对于乳铁蛋白的阳离子交换剂的吸附能力。
即，将钠型阳离子交换剂用水溶胀以得到10ml，然后将其置于1kg的未加热的脱脂乳(pH6.7)。在4℃将其混合的溶液搅拌16小时。然后，制备性分离该阳离子交换剂并用水洗涤。将洗涤的阳离子交换剂与150ml 10％浓度的氯化钠水溶液接触，以便于将乳铁蛋白从该阳离子交换剂中洗脱入氯化钠水溶液。通过此洗脱得到的收集物(collectate)中的乳铁蛋白质含量通过Lowry方法(Analytical Biochemistry，U.S.A.Vol.15，1966，p.45至52)测定，并由此计算吸附能力(单位mg/10ml)。
通过选择具有由上述方法测定的较高乳铁蛋白吸附能力的阳离子交换剂，可以增加通过本发明的方法回收的乳过氧化物酶的量。即，当根据上述方法将10ml的阳离子交换剂置于1kg的未加热脱脂乳中时，优选具有70mg或更高的乳铁蛋白吸附能力的阳离子交换剂，更优选具有85mg或更高的乳铁蛋白吸附能力的阳离子交换剂，而且甚至更优选具有90mg或更高的乳铁蛋白吸附能力的阳离子交换剂。吸附能力的值优选较高。通常，1kg乳中乳铁蛋白质含量为大约100mg，而能够吸附其总量的阳离子交换剂是理想的。具体地，上述SEPABEADS FP-CM13的乳铁蛋白吸附能力85mg/10ml，而CM-Sephadex C-50的乳铁蛋白吸附能力91mg/10ml，它们都是显示高乳铁蛋白吸附能力的阳离子交换剂。
可以任意选择乳原料和阳离子交换剂的吸附处理(接触)。可通过诸如批式搅拌方法(batch stirring method)和柱连续方法等方法进行所述的吸附处理。只要乳原料和阳离子交换剂能够充分地相互接触，就可以进行任何处理。可进行一种处理，或可组合进行多种吸附处理。
在批式处理的情况中，在希望从一定量乳原料中获得高产率的情况时，使用大量阳离子交换剂是合适的；在希望从一定量阳离子交换剂中获得高产率的情况时，使用大量乳原料是合适的。在批式处理中，可根据阳离子交换剂的吸附能力和/或吸附处理的具体方法来任意调节乳原料和阳离子交换剂的混合体积比。
在此，阳离子交换剂的性质主要分为两种类型硬型和软型。在本发明中，可使用任一种类型。
在硬型中，离子交换剂本身的体积由于离子强度或pH而难以改变。而且，即使阳离子交换剂上的压力由于流速等的变化而改变，阳离子交换剂本身的体积也难以改变。因此，硬型更适于柱连续方法，其中阳离子交换剂被保持在柱子中，并且以高流速流过。
在另一方面，在软型阳离子交换剂中，离子交换剂本身的体积由于离子强度或pH而大幅变化。而且，如果阳离子交换剂上的压力由于流速等的变化而改变时，阳离子交换剂本身的体积容易改变。因此，将软型阳离子交换剂保持在柱中并以高流速流过是困难的。具体地，在将脱脂乳、乳清等流过的情况中，与将其它盐溶液等流过的情况相比，在阳离子交换剂层中导致较大的压力损失。因此，软型阳离子交换剂适于批式方法。
SEPABEADS FP-CM13(由Mitsubishi Chemical Corporation制备)是硬型，而CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制备)是软型。
关于乳原料和阳离子交换剂的吸附处理的温度，考虑到如果温度低于0℃，那么粘度增加或乳原料冻结，而当温度超过60℃时，乳过氧化物酶有可能变性。因此，优选在0℃-60℃的范围内进行所述的处理。即使温度为25℃-60℃，在需要长时间吸附等情况中，乳过氧化物酶有可能逐渐变性。因此，所述处理优选具体在0℃至25℃进行。而且，如果使用未加热的乳原料，要求0℃至10℃进行所述处理以便于防止细菌繁殖。
关于乳原料和阳离子交换剂的吸附处理的时间(接触时间)，考虑到在吸附处理的时间的温度，将采用的吸附处理的方法(批式或柱连续方法)等可适当地选择条件。例如，在批式的情况中，乳原料和阳离子交换剂的吸附处理的时间优选为1分钟以上但24小时以下，而且更优选10分钟以上但6小时以下。而且，在柱连续方法的情况中，线性流速优选为10cm/h以上但1000cm/h以下。
(2)其次，洗涤吸附处理之后的阳离子交换剂。至于此时的洗涤液，考虑到生产成本优选用水洗涤，虽然可能使用离子强度低于0.07的低盐水溶液，或在中性或弱酸性区的缓冲溶液。
对于吸附处理之后的阳离子交换剂，可通过任何方法洗涤并去除使用的乳原料。例如，可以只将阳离子交换剂从含有乳原料和阳离子交换剂的容器中转移，然后在另一处洗涤该阳离子交换剂，或者可以只将乳原料从该容器中转移，然后在该容器中洗涤阳离子交换剂。
(3)然后，将洗涤的阳离子交换剂与浸出溶剂接触。结果，将乳过氧化物酶从阳离子交换剂洗脱入浸出溶剂，并得到浸出溶液。
在此步骤中使用的浸出溶剂的离子强度优选为0.07以上但0.3以下，更优选0.10以上但0.25以下，并甚至更优选0.15以上但0.22以下的范围内。通过使用具有上述范围内的离子强度的浸出溶剂，可有效地从阳离子交换剂洗脱入过氧化物酶。
至于浸出溶剂，也可以使用在离子强度调节至上述范围内的中性或弱酸性区的缓冲溶液。考虑到生产成本，更优选地，可使用只溶解了盐的水溶液(盐溶液)。关于可在本申请中使用的盐，可任意选择一种类型或多种类型的组合。
优选的盐溶液是下述盐的水溶液，所述的盐包含选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等中的一种，或者多种类型的混合物。
(4)然后，使用经过超滤膜的膜分离方法，对得到浸出溶液进行膜处理。结果，将浸出溶液浓缩从而实现该浸出溶液中的沉淀。
超滤膜的操作方法可分为如下两种让水和分子量不大于目标分子量的组分分离、渗透以将其去除的正常超滤方法，和连续操作同时将与已渗透穿过膜的渗透物质等量的水加入膜上的保留物(retentate)中的补给水过滤方法(渗滤(diafiltration))。两种方法都可用于本发明。具体地，后者补给水过滤方法从可在浓缩的同时进行脱盐，并可将低分子量组分从保留物中去除至较高程度这一点来说是优选的。
当使用前者正常超滤方法时，优选在超滤之后通过如透析和凝胶过滤的方法进行脱盐。
对于超滤膜，可使用任何商业可得到的超滤膜。其具体实例包括IRIS3038膜、IRIS3072膜(两种都由Rhone-Poulenc S.A.制备)和GR-61pp膜(由DDS Inc.制备)。
对于超滤膜的材料，可使用有机材料或无机材料，并且可考虑成本、通用性(generality)等来选择。
在超滤处理时的浸出溶液的温度是可行的，只要其不大于所使用的膜的耐热温度(heat resisting temperature)(例如，在GR-61pp膜的情况下为80℃或更低)。然而，如果温度为60℃或更高，乳过氧化物酶可能变性，而且细菌繁殖在10-60℃的范围内往往是显著的。因此，优选在0-10℃的范围内进行。
关于超滤时的压力，任何压力都是可能的，只要其不大于所使用的膜的耐压极限(pressure prooflimit)(例如，在GR-61pp膜的情况下为0.6MPa或更低)。由于在耐压极限值附近的使用可能缩短膜的寿命，优选可在2/3的耐压极限或更低的压力(例如，在GR-61pp膜的情况下为0.4MPa或更低)进行超滤。
对于所使用的超滤膜的组件，可能为任何类型，如管型、中空纤维型、平膜型和螺旋型。然而，在如内压力型的中空纤维型组件的组件中，如果沉淀在中空纤维内产生，那么通道也许可能被堵塞，并由此，优选考虑压力等来进行超滤。
在步骤(3)中得到的浸出溶液优选为澄清的褐色溶液。而且，当将此浸出溶液通过超滤膜浓缩时，由于蛋白质溶解度的差异，除乳过氧化物酶之外的蛋白质被沉淀为超滤膜上保留物中的沉淀。在此，为了有效沉淀除乳过氧化物酶之外的蛋白质(即，作为杂质的蛋白质)，优选进行浓缩以使浓缩的浸出溶液中的蛋白浓度变为0.9％或更多。如果浸出溶液中的蛋白质含量超过15％，则考虑到该浸出溶液粘度的增加，并由此降低超滤膜处理的效率。因此，浸出溶液中的蛋白质含量优选在0.9-15％，更优选1.5-12％，并最优选3-10％的范围内。
通过准备各步骤中的条件直到产生沉淀，可减少沉淀中混合的乳过氧化物酶的量，并以可能产生根本不包含乳过氧化物酶的沉淀。
(5)然后，从已产生沉淀的浸出溶液(保留物)中去除沉淀。结果，从该浸出溶液中除去了作为杂质的蛋白质，并得到含有高度纯化的乳过氧化物酶的溶液(乳过氧化物酶溶液)。
去除沉淀的方法是任意选择的。其可为通过使已产生沉淀的浸出溶液(保留物)静置来去除沉淀的方法，或者其可为通过使用离心、精密过滤(precisefiltration)(微滤)等进行澄清处理来收集已除去沉淀的澄清溶液(乳过氧化物酶溶液)的方法。
通过此步骤得到的乳过氧化物酶溶液优选根据需要灭菌。此时，从增加乳过氧化物酶的热稳定性的观点来看，所述灭菌优选在如下条件下进行加入钙离子如氯化钙以使浓度为大约20mM，而且热灭菌在72℃进行大约15至90秒。
(6)然后，通过去除所得到的乳过氧化物酶溶液的溶剂，能够获得固体乳过氧化物酶。
去除溶剂的方法物无具体限制，并可根据需要选择。例如，可合适地使用进一步使用超滤膜浓缩，并通过普通方法冷冻干燥以除去水分的方法。结果，可生产高度纯化的乳过氧化物酶粉末。
以此方式得到的固体乳过氧化物酶可实现80％或更高的高纯度。
用于去除溶剂的步骤(6)不是必需的。可以以溶液状态使用如步骤(5)中高度纯化的乳过氧化物酶得到的乳过氧化物酶溶液。
实施例下面通过显示测试实施例来详述本发明。然而，本发明并不限于如下实施例。例如，在本申请中，这些实施例中的组分和这些实施例不包含的组分可以适当地组合。而且，除蛋白质含量和纯度之外，除非具体说明，％表示质量％。
测试实施例1进行本测试以分析在步骤(4)中生产沉淀的优选条件，其进行如下步骤(1)至(3)，以在通过使用超滤膜对从弱酸性阳离子交换剂收集的浸出溶液进行浓缩而获得的浓缩物中生成沉淀。
(1)样品作为弱酸性阳离子交换剂，使用CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制备)，其具有羧甲基和91mg/10ml的乳铁蛋白吸附能力。
将20升脱脂乳加入以170ml弱酸性阳离子交换剂填充的柱子，以将蛋白质吸附于该交换剂。然后，用水洗涤柱子中的弱酸性阳离子交换剂，然后将200ml 1.6％的氯化钠水溶液(离子强度0.27)作为浸出溶剂加入柱子中，由此将已经吸附入弱酸性阳离子交换剂的蛋白质被洗脱至氯化钠水溶液。将大约200ml收集的浸出溶液用作测试样品。通过Kjeldahl方法测定所得到的测试样品中的蛋白质含量，而且其为0.26％。
(2)测试方法制备三类离心型超滤过滤装置(级分的分子量10K Dalton(道尔顿)、30KDalton和50K Dalton，其全部由Millipore Corporation制备)。
将0.5ml的测试样品加入每个过滤装置，并通过在6000rpm离心来进行超滤。然后，观察沉淀产生的存在/不存在。在此时，通过控制离心时间，改变不同阶段中过滤装置中保留物的体积。
(3)测试结果作为本测试的结果，在具有不同级分的分子量的三个过滤装置的任意一个中，当该过滤装置中保留物的体积浓缩至0.15ml时，在过滤器上观察到白色沉淀。当保留物的体积为0.15ml或更小时，也观察到沉淀产生。然而，当其大于0.15ml时，未观察到沉淀。
而且，当将保留物的体积浓缩到0.15ml时，该保留物中的总蛋白质含量未0.9％。
由此结果可确认，当进行浓缩以使所述浓缩的保留物中的总蛋白质含量变为0.9％时，在该保留物中产生沉淀。
测试实施例2进行本测试以分析脱盐处理对通过使用超滤膜浓缩而产生的沉淀的溶解度的影响。
(1)样品作为本测试的样品，使用与测试实施例1类似的测试样品(在1.6％氯化钠水溶液中含有洗脱的蛋白质的浸出溶液，蛋白质含量0.26％)。
(2)测试方法制备三种与30K Dalton级分分子量的超滤膜相连的搅拌小室单位(stirredcell unit)(由Millipore Corporation制备)。每个小室单位加入50ml测试样品。使用氮气，将小室单位内部加压至大约0.3Mpa，而且将该小室单位中的保留物浓缩至10ml。
关于第一个小室，当保留物变为10ml时，将该小室单位中保留物的总量转移到离心管中，并通过在10,000rpm离心分离为固体和液体。然后，收集沉淀(沉淀样品1)。
关于第二个小室，当保留物变为10ml时，将该小室单位中保留物的总量转移到离心管中，并通过在10,000rpm离心分离为固体和液体。然后，收集沉淀。将10ml纯化的水加入所述沉淀，并通过涡旋混合器搅拌1分钟。将以此方式得到的沉淀悬浮液移至离心管，并通过在10,000rpm离心进一步分离为固体和液体。然后，收集沉淀(沉淀样品2)。
关于第三个小室，将40ml纯化的水加入含有浓缩至10ml的保留物的小室单元。然后与上次类似地加压，直到将保留物再次浓缩至10ml。当保留物变为10ml时，将该小室单位中保留物的总量转移到离心管中，并通过在10,000rpm离心分离为固体和液体。然后，收集沉淀(沉淀样品3)。
通过普通方法测定沉淀样品1至3的干重。
(3)测试结果作为本测试的结果，在任意的小室中，当该小室单位中的保留物为10ml时，沉淀在保留物中形成。
而且，沉淀样品1至3的质量几乎不存在差异。因此，可确认的是，即使将纯化的水加入已经通过浓缩步骤形成的沉淀，该沉淀不再溶解。
此外，可确认即使通过脱盐改变盐浓度，已经在浸出溶液中形成的沉淀以不受影响，而且该沉淀不再溶解。
下面通过显示实施例来更详细地描述本发明。然而，本发明并不局限于如下实施例。
实施例1作为弱酸性阳离子交换剂，使用CM-Sephadex C-50(由Amersham plc.制备)，其具有羧甲基和91mg/10ml的乳铁蛋白吸附能力。
将17升此阳离子交换剂填充入具有50em内径的柱中，并将40升1.5％氯化钠水溶液通过该柱子。然后用水洗涤，并将该柱中的阳离子交换剂调节为钠形式。
制备源自奶牛的脱脂乳(pH6.7，后面描述为样品1)作为乳原料。将2000升此脱脂乳在温度为4℃且流速为60升/h的条件下通过柱子，由此实现吸附处理。
将水通过吸附处理之后的柱子，以洗涤尚未吸附入该阳离子交换剂的乳组分。
然后，将20升1.6％氯化钠水溶液(离子强度0.27)作为浸出溶剂以30升/h的流速通过，以洗脱吸附入阳离子交换剂的蛋白质。结果，收集了21升含有牛乳过氧化物酶的浸出溶液(后面描述为样品2)。
然后，使用20K Dalton级分的分子量的超滤膜(由DDS Inc.制备)单位，以0.3Mpa的平均压力将21升浸出溶液进行超滤，并进行浓缩直到保留物的量变为2升。
然后，进一步进行超滤同时加入水，以使保留物脱盐，并最终收集2升的保留物。在该保留物中产生白色沉淀。
然后，将含有白色沉淀的保留物静置澄清，并收集1.95升的上清液级分(后面描述为样品3)作为牛乳过氧化物酶溶液。
使用具有1.4μm孔径的精密过滤膜将收集的上清液级分(牛乳过氧化物酶溶液)进行微滤，以进一步去除少量沉淀，并且产生含有牛乳过氧化物酶的纯化的制备物。
此外，将得到的纯化的制备物冷冻干燥，以产生26g粉状冻干的含有牛乳过氧化物酶的制备物(后面描述为样品4)关于在生产步骤中得到的上述样品1至4，即样品1脱脂乳(乳原料)，样品2来自阳离子交换剂的浸出溶液，样品3超滤膜处理后保留物的上清液级分，和样品4冷冻干燥的制备物，对于每个样品测定蛋白质含量和牛乳过氧化物酶活性以得到比活性(specific activity)。在此，通过Kjeldahl方法测定蛋白质含量，并通过Putter等的方法(Bergmeyer ed，Methods of EnzymaticAnalysis，third edition，Vol.3，1983，p.286至293)测定牛乳过氧化物酶活性，以得到每1mg蛋白的过氧化物酶活性(比活性)。结果在表1中显示。
表1
如表1所示，样品1的蛋白质含量为3.30％，而其比活性为0.20单位/mg。而且，样品2的蛋白质含量为0.26％，而其比活性为132.5单位/mg。从这些结果中，可以理解的是，在脱脂乳(乳原料)的蛋白质中，牛乳过氧化物酶被选择性地洗脱于浸出溶液中。
而且，样品3的蛋白质含量为1.64％，而其比活性为220.3单位/mg。样品4的比活性为224.4单位/mg。
比较样品2、与样品3和4的结果，通过使用超滤膜浓缩浸出溶液，并去除产生的沉淀，牛乳过氧化物酶的比活性显著地增加。结果，可以理解的是，通过上述沉淀的去除，除牛乳过氧化物酶之外作为杂质的蛋白质被有效地去除，而牛乳过氧化物酶的纯化效率增加。
而且，关于样品4(冷冻干燥的制备物)，通过高效液相色谱来分析乳过氧化物酶的纯度。
在此分析中，使用装备SHODEX ASAHIPAK C4P-50柱和具有280nm的分析波长的紫外吸附检测器的HPLC设备。关于流动相，流速为0.8ml/min，使用A溶液(乙腈∶0.5M氯化钠＝10∶90的混合溶液)和B溶液(乙腈∶0.5M氯化钠＝50∶50，含有0.03％三氟乙酸的混合溶液)，并通过具有浓度变化(其中比例A∶B由50∶50在30分钟内变为0∶100)的线性密度梯度方法进行洗脱。称重大约20mg的样品并将其溶于10ml 2.9％氯化钠水溶液，将其中的25μl在上述分析方法中测定。
在此，先前将纯化的牛乳过氧化物酶(由Sigma-Aldrich Co.制备)用作参考标准物(reference standard)，以确认在上述分析方法中参考标准物的峰出于洗脱时间的大约18分钟。
然后，在上述分析方法中分析样品4，并通过根据峰面积的自动积分来测定牛乳过氧化物酶纯度。
结果，可以确认，样品4的牛乳过氧化物酶纯度为89％。因此，可以确认通过本发明的方法可以从乳原料中生产高度纯化的乳过氧化物酶。
工业实用性本发明提供生产乳过氧化物酶的方法，其能够以比常规方法更简单的步骤，用更短的时间，更低的成本生产高度纯化的乳过氧化物酶，而且其能以工业规模应用于生产。
权利要求
1.生产乳过氧化物酶的方法，其包括步骤(1)将一种或多种乳原料与具有弱酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂接触由此实现吸附处理；步骤(2)洗涤所述吸附处理之后的阳离子交换剂；步骤(3)将所述洗涤的阳离子交换剂与洗脱乳过氧化物酶的浸出溶剂接触，由此得到乳过氧化物酶洗脱至所述浸出溶剂的浸出溶液；步骤(4)通过超滤膜浓缩所述浸出溶液，由此实现在浓缩的浸出溶液中的沉淀；和步骤(5)通过从所述浓缩的浸出溶液中去除沉淀得到乳过氧化物酶溶液。
2.根据权利要求1的生产乳过氧化物酶的方法，其中所述阳离子交换剂的乳铁蛋白吸附能力为85mg/10ml或更高。
3.根据权利要求1或2的生产乳过氧化物酶的方法，其中所述离子交换基团是羧甲基。
4.根据权利要求1-3中任一项的生产乳过氧化物酶的方法，其中，在所述步骤(4)中，进行浓缩以使所述浓缩的浸出溶液中的蛋白质含量变为0.9至15％，由此实现沉淀。
5.根据权利要求1-4中任一项的生产乳过氧化物酶的方法，其中所述步骤(3)中使用的浸出溶剂的离子强度为0.07至0.3。
6.根据权利要求5的生产乳过氧化物酶的方法，其中所述步骤(3)中使用的浸出溶剂是含有选自氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁中至少一种盐的水溶液。
7.根据权利要求1-6中任一项的生产乳过氧化物酶的方法，其进一步包括通过去除在所述步骤(5)中得到的乳过氧化物酶溶液的溶剂来获得固体乳过氧化物酶的步骤。
8.根据权利要求7的生产乳过氧化物酶的方法，其中所述固体乳过氧化物酶的纯度是80％或更高。
全文摘要
本发明涉及生产乳过氧化物酶的方法，其包括如下步骤(1)将原料乳与具有弱酸性基团作为离子交换基团的阳离子交换剂接触，由此实现吸附处理；(2)洗涤吸附处理之后的阳离子交换剂；(3)洗涤后将该阳离子交换剂与浸出溶剂接触，由此得到乳过氧化物酶溶出至浸出溶剂的浸出溶液；(4)通过超滤膜浓缩浸出溶液，由此实现在浓缩的浸出溶液中的沉积；和(5)通过从浓缩的浸出溶液中去除沉积物得到乳过氧化物酶溶液。
文档编号B01D61/16GK1918289SQ20058000498
公开日2007年2月21日 申请日期2005年2月8日 优先权日2004年2月17日
发明者市桥信夫, 山内恒治, 新光一郎, 安藤哲也 申请人:森永乳业株式会社