o' SPBS，Teknova 公司，霍利斯特，加州）中，W停止蛋白质合成。将细胞进一步稀释进相同盐溶液中至适于 流式细胞术的密度。当存储在4°C下时，W此方式制备的细胞可W稳定达24小时。 巧化激活细胸分洗术
[0130] 然后，通过巧光激活细胞分选术选择具有最大巧光的细胞（FACSariaII，BD，富兰 克林湖，新泽西州）。在正确安装细胞分选仪后，遵循制造商的说明，W适于分选的稀释，优 选3, 000个事件/s注射顺序诱导的细胞。然后，分选展现出最高巧光的顺序诱导的细胞的 亚群，优选总群体的1% -5%。继续分选，直到注射细胞的总数超过同上所确定的有效的文 库大小。 细胸回收
[0131] 经由在1,OOOxg下离屯、通过DuraporePVDF0. 22ym过滤器（密理博公司 (Millipore)，Ultra化ee-MC#UFC30GVNB)持续1分钟而浓缩回收的细胞。通过如前所述的 离屯、，用500yL冷PBS洗漆该些细胞。向该过滤器的顶部上的保留的细胞添加50yL的回 收缓冲液（lOmMTrispH8.0,0.ImM邸TA)并用移液器吸取，W重悬该些细胞。通过将该 过滤器在-20°C冷冻机中放置30分钟并且然后在室温下放置30分钟来冷冻/解冻裂解该 些细胞。然后，将该过滤器倒立在干净的1. 7mL管中并在10,OOOxg下离屯、1分钟，W回收 包含裂解的细胞的缓冲液。 《核巧酸回收与扩增
[0132] 回收编码正向折叠的变体的DNA并使用如下适于亚克隆的具尾引物对其进行扩 增；0.3uM正向和反向引物、包含裂解的细胞的lOuL缓冲液、25uL2xK0D热启动预混 液化 0DHotStartMasterMix) (#71842-3,EMD化学品公司（EMDChemicals))、加水至 50yL。将反应在95°C下解育2分钟，W激活聚合酶，随后是26个循环：在95°C下持续20 秒，在55°C下持续20秒，并在68°C下持续45秒。通过制备型琼脂糖凝胶电泳纯化所得扩 增子。 连例2 巧化激活细胸分洗术对照帝白
[013引使用实例1中给出的方法，通过巧光区别正向（F+)和负向（N巧折叠的对照并且 在示例性实验中用于基于巧光强度的区别，该作为溶解度代表。在此实例中，正向折叠的对 照（F+)是大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP)，该蛋白在本领域中已知是一种高可溶性蛋白。 在此实例中，负向折叠的对照（NF)是来自丝状真菌红褐肉座菌化ypocreajecornia)(巧 (n6e)里氏木霉）的纤维二糖水解酶2,该水解酶已经被显示W不可溶形式表达于大肠杆菌 中。将两个基因都克隆进pTETGFP11载体系统中并分开地转化进具有祀TGFP1-10载体 的大肠杆菌细胞中并且如实例1中所描述对其进行顺序诱导。
[0134] 如图2所呈现，F+和NF的群体可W容易地通过它们的巧光而辨别，给出为 FITC-A。另外，本领域的技术人员可W使用巧光激活细胞分选术容易地分选F+和NF的群 体。图3描绘了限制更多的巧光F+群体的实例口控，如在FACS仪器的操作中所需要的。 连例3 巧化激活细胸分洗专库
[01巧]使用实例1中给出的方法，富集易错文库的活性。在此实例中，使用GeiieMorph?II随机诱变试剂盒#2〇〇55〇(安捷伦科技，圣克拉拉，加州，美国）如下产 生易错文库巧化）。将金黄色嗜热子囊菌G册cDNA在25uL易错PCR反应中用作模板， 该些PCR反应由lxMutazymeII缓冲液、0. 2mMdNTP混合物、0. 2yM引物C、0. 2yM引 物D、1.25UMutazymeII聚合酶W及 4、20 或lOOng的模板构成。在MjMini?thermal cycler#PTC-1148(伯乐公司（Bio-Rad),赫拉克勒斯，加州，美国）中进行该反应，编程为； 1个循环，在95°C持续2分钟；和30个循环，每个在95°C持续30秒，在60°C持续30秒，在 72°C持续1分钟。然后，将该反应在72°C下解育10分钟。使用TAE缓冲液（40mMTris、 20mM己酸和ImM邸TA)，通过0. 8%低烙点琼脂糖凝胶电泳分离易错反应产物，其中从该 些凝胶切离大约化b的产物带并根据制造商的方案，使用NucleoSpin?提取II试剂盒 (NucleoSpin⑥ExtractIIkit)(马歇雷-纳格尔公司（Macherey-Nagel)，迪伦，德国） 对其进行纯化。将纯化产物克隆进pTETGFP11载体系统中并转化进具有祀TGFP1-10 载体的大肠杆菌细胞中并且如实例1中所描述对其进行顺序诱导。分开地，将野生型（WT) 和已知的不可溶金黄色嗜热子囊菌G册变体（IV)克隆进pTETGFP11载体系统中并转化进 具有祀TGFP1-10载体的大肠杆菌细胞中并且如实例1中所描述对其进行顺序诱导。 [0136]如图4所呈现，可W通过易错文库巧化)、野生型（WT)和不可溶变体（IV)的巧光 曲线辨别它们，给出为FITC-A。另外，本领域的技术人员使用巧光激活细胞分选术分选最高 的5%或1%发巧光细胞，使得在该文库中的活性克隆的数目增加8. 1倍和9. 5倍（图5)。
【主权项】
1. 一种针对可能编码功能多肽的多核苷酸而对多个多核苷酸进行富集并对该富集的 多个多核苷酸进行筛选的方法，该方法包括： (a) 提供编码一种多肽的变体的多个多核苷酸，其中这些多核苷酸中的至少一些编码 一种具有至少一种活性的多肽； (b) 从这些多核苷酸产生多肽； (c) 确定这些多肽是否可溶； (d) 选择这些编码可溶性多肽的多核苷酸，以形成富集的多个多核苷酸；并且 (e) 针对编码具有该活性的多肽的多核苷酸筛选该富集的多个多核苷酸。
2. 如权利要求1所述的方法，其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肽的多核苷 酸的至少2倍富集或其中所述选择产生编码一种具有该活性的多肽的多核苷酸的至少选 自下组的富集程度，该组由以下各项组成：5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40 倍、45 倍、50 倍、55 倍、60 倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、IO3倍、10 4 倍、IO5倍、10 6倍、10 8倍以及10 9倍的富集。
3. -种关于可能编码功能多肽的多核苷酸的水平而比较多核苷酸的至少两个文库的 方法，该方法包括： (a) 提供编码同一多肽的变体的多核苷酸的至少两个不同文库； (b) 针对每一多个多核苷酸： (i) 从这些多核苷酸产生多肽；并且 (ii) 确定这些多肽是否可溶；并且 (c) 将具有最高水平的可溶性多肽的多个多核苷酸鉴定为包含最高水平的可能编码功 能多肽的多核苷酸的多个多核苷酸。
4. 如权利要求3所述的方法，其中每一多个多核苷酸都包括至少一些编码一种具有至 少一种活性的多肽的多核苷酸，并且该方法另外包括针对编码具有该活性的多肽的多核苷 酸筛选该鉴定的多个多核苷酸。
5. 如任何以上权利要求所述的方法，其中（b)的产生包括在宿主细胞中表达这些多 肽。
6. 如权利要求5所述的方法，其中将这些多肽在宿主细胞中表达为融合蛋白，其中该 融合蛋白还包括一个溶解度报告部分。
7. 如权利要求6所述的方法，其中该宿主细胞表达一种互补多肽，该互补多肽能够结 合至融合蛋白的溶解度报告部分，以产生一种可检测的蛋白质复合物。
8. 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中（b)的产生包括在一种反应混合物中表 达这些多肽，该反应混合物包括用于体外转录/翻译的组分。
9. 如权利要求8所述的方法，其中将这些多肽表达为融合蛋白，其中每种融合蛋白都 包括一个或多个溶解度报告部分，该一个或多个溶解度报告部分包括： 多肽附接标签，该标签能够与该多个多核苷酸中的多核苷酸形成共价键，或以其他方 式结合至其上；以及 多肽亲和标签。
10. -种筛选有助于蛋白质折叠的分子伴侣的方法，该方法包括： (a)在宿主细胞中或在体外反应混合物中表达一种融合蛋白，其中该融合蛋白包括一 个趋于错误折叠或凝集的部分，其中该部分被连接至一个或多个溶解度报告部分，并且其 中该宿主细胞或体外反应混合物还包括或产生一种潜在的分子伴侣； (b) 确定该融合蛋白是否可溶； (c) 如果该融合蛋白是可溶的，则将该潜在的分子伴侣鉴定为有助于该融合蛋白的折 叠的分子伴侣。
11. 如权利要求10所述的方法，其中在多个宿主细胞或体外反应混合物中表达该融合 蛋白，并且不同宿主细胞或反应混合物分别包括或产生不同的潜在的分子伴侣，并且其中， 当在体外反应混合物中表达该融合蛋白时，至少约20%的这些反应混合物中每反应混合物 包括或产生一种或更少的所述潜在的分子伴侣。
12. 如权利要求11所述的方法，其中这些潜在的分子伴侣表达自选自以下各项的多核 苷酸集：编码已知分子伴侣多肽的集，编码一种或多种已知分子伴侣多肽的变体的集，编码 肽的集，来源于来自植物或动物的样品或来源于环境样品的集，或者这些潜在的分子伴侣 包括选自以下各项的小分子集：多个已知小分子分子伴侣，一种或多种已知小分子分子伴 侣的多个变体，和多个小分子，其中在该小分子集中的每个小分子都被连接至一个独特的 多核苷酸条码。
13.如权利要求11或12所述的方法，其中在表达一种互补多肽的宿主细胞中表达该融 合蛋白，该互补多肽能够结合至融合蛋白的溶解度报告部分，以产生一种可检测的蛋白质 复合物。
14.如权利要求11或12所述的方法，其中在分开的反应混合物中表达这些融合蛋白， 这些分开的反应混合物包括油包水乳液中的水相液滴。
15.如权利要求14所述的方法，其中每种融合蛋白都包括一个或多个溶解度报告部 分，该一个或多个溶解度报告部分包括： 多肽附接标签，该标签能够与多核苷酸形成共价键，或以其他方式结合至其上；以及 多肽亲和标签。
16. -种用于鉴定一个或多个可溶和/或功能结构域的蛋白质结构域作图方法，该方 法包括： (a) 在宿主细胞中或在体内反应混合物中表达一种融合蛋白，其中该融合蛋白包括有 待作图的蛋白质的一部分，其中该部分被连接至一个或多个溶解度报告部分； (b) 确定该融合蛋白是否可溶； (c) 如果该融合蛋白是可溶的，则将该部分鉴定为作为可溶和/或功能结构域的部分。
17.如权利要求16所述的方法，其中在多个宿主细胞或体内反应混合物中表达多个不 同的融合蛋白，并且其中，当在体外反应混合物中表达该融合蛋白时，至少约20%的这些反 应混合物中每反应混合物包括或产生一种或更少的所述潜在的分子伴侣。
18.如权利要求17所述的方法，其中在表达一种互补多肽的宿主细胞中表达这些融合 蛋白，该互补多肽能够结合至可溶性融合蛋白的溶解度报告部分，以产生一种可检测的蛋 白质复合物。
19.如权利要求17所述的方法，其中这些融合蛋白表达自这些分开的反应混合物中的 编码这些融合蛋白的多核苷酸，这些分开的反应混合物包括油包水乳液中的水相液滴。
20. 如权利要求19所述的方法，其中每种融合蛋白都包括一个或多个溶解度报告部 分，该一个或多个溶解度报告部分包括： 多肽附接标签，该标签能够与编码该融合蛋白的多核苷酸形成共价键，或以其他方式 结合至其上；以及 多肽亲和标签。
【专利摘要】本发明提供了基于针对可溶性蛋白筛选表达的多核苷酸文库的方法。
【IPC分类】C12N15-10
【公开号】CN104704120
【申请号】CN201380052465
【发明人】R·布拉泽杰, N·托里洛, C·埃姆里克
【申请人】诺维信公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2013年9月20日
【公告号】EP2898070A2, US20150218553, WO2014047453A2, WO2014047453A3