多重免疫筛选分析的制作方法
【专利说明】多重免疫筛选分析
【背景技术】
[0001] 由于疾病的严重程度、高致死性、某些媒介（agent)的人类间接触传染性W及对 其中的大多数缺乏有效治疗，由病原体，如细菌、病毒（例如病毒性出血热（VHF))、W及寄 生虫引起的感染性疾病造成显著的公共健康问题。
[0002] 为了及时界定、实施W及采用适当的行动，流行病的控制关键取决于快速检测和 准确地识别媒介。在该种情况下，生产并验证用于爆发的早期检测、精确鉴定病原体、和改 进疾病监测的工具是必不可少的。
[0003] 在该方面，检测体液中的抗体构成了病毒引起的疾病、传染性生物体引起的其它 疾病、自身免疫性疾病的诊断W及癌症检测的重要组成部分。事实上，因为已知某些抗体的 存在与病原体的暴发有关，因此该些抗体可作为诊断标记物并可引导预后和治疗。对于专 口祀向病毒抗原的抗体的情况尤其如此。
[0004] 目前用于检测抗体存在的方法包括多种技术，诸如免疫巧光显微镜、化学发光分 析、Western印迹、放射免疫沉淀法巧I巧和化ISA。因为校准品和所述抗体在相同的条件 下进行分析，通过减少各分析（如化ISA)之间存在的基质效应，同时平行检测几种抗体可 特别地有用；因此，对在相同样本中存在的多个抗体的测量，其将产生可比较的结果。一 种该样分析是利用与珠结合的抗原的Luminex多重分析。Pickering等人，Clinicaland Dia即osticL油oratoryImmunology9:872-876(2002)。
[0005] 然而，使病原相关抗体的直接鉴定复杂化的是正常血清含有大量W复杂染色的模 式表现其自身的天然抗体（AvrameasS.Immunol.Today1991)。该些天然抗体的存在可使 得从"自身免疫噪声"（即天然存在的自身抗体）的复杂背景中区分疾病相关抗体复杂化。 正如在Anderson等人，MethodsMol.Biol. 723:227-238(2011)中所注意到的，交叉反应 (cross-talk)和干扰对于多重分析仍是问题。
[0006] 在多重分析中将人抗体直接与珠结合也作为问题被报道。Tainsky等 人，BiomarkerInsights2:261-267 (2007) ;Waterboe;r等人，J.Immunol Methods309:200-204(2006)〇
[0007] 此外，阳性和对照样品之间的低差异可W限制多重分析的应用。Burbelo等 人，Exp.RevVaccines, 9:567-578 (2010)。
[0008] 另一个复杂因素是化ISA和多重分析并不一定给出相同的结果。例如，Pickering 等人，2002,指出当测量抗各种病毒和细菌抗原的保护性抗体时该两个分析之间的许多矛 盾。该可能反映与抗原如何与基底连接相关的抗原性的改变。Ambrosino等人，Malaria Journal9:317(2010)。类似地，Cham等人，MalariaJournal?: 108 (2008)，报道一些样品 显示出化ISA和基于珠的分析读数之间的显著差异，其中一些具有较高的化ISA读数。该可 能是由于该样的事实，当蛋白结合到表面或球体时抗体可接近的重组蛋白的部分不同。Id。
[0009] 还需要制备足够量的用于商业应用的抗原（即试剂盒）。Burbelo等，Exp. RevVaccines, 9:567-578(2010)。
[0010] 鉴于上述情况，需要可解决上述问题的系统和方法，其可对产生抗体的疾病的分 子诊断提供高通量、成本效益和精确性的进一步改善。本发明满足了该些和其它需要。
【附图说明】
[ocm] 图1表示嵌合AGT-抗原蛋白定向偶联至底物包被的微球上。偶联的第一步由通 过氨基偶联将AGT底物BG-PEG-N肥偶联至活化的微球所组成。第二步由使底物包被的 微球与含AGT的融合蛋白（例如，SNAP突变体）相接触所组成，所述酶旨在共价连接至其 BG-PEG-N肥底物，即至微球上。
[0012] 图2显示如之后的抗-SNAP抗体，嵌合SNAP-病毒抗原蛋白（SNAP-DV1.EDIII、 SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV.EDIII、SNAP-YF.EDIII、 SNAP-巧.EDIII、SNAP-ZIKA.EDIII)的偶联效率。
[0013] 图3比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV2抗体对嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的 免疫分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通过hAGT蛋白的底物缀合至微球 (本发明的偶联）、或者通过标准胺偶联方法，例如Bio-Plex胺偶联试剂盒BI0RAD进行偶 联。
[0014] 图4比较用于检测纯化的单克隆抗-DV1抗体对嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白的免疫 分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白W单重格式缀合至微球，或者与其它偶 联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、 SNAP-WNV.邸III、SNAP-YF.邸III、SNAP-巧.EDIII、SNAP-T邸.EDIII)W多重格式缀合至微 球。
[0015] 图5显示用于检测纯化的单克隆抗-WNV抗体的稀释液对偶联至微球的嵌合 SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、 SNAP-WNV.邸III、SNAP-YF.邸III、SNAP-巧.EDIII、SNAP-T邸.EDIII)的多重免疫分析实验 的反应性和特异性。
[0016] 图6显示W多重免疫分析检测针对DV3的小鼠多克隆血清中抗-DV3IgG(A)W及 检测针对YF的小鼠多克隆血清中的抗-YFIgG检测炬）对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒 Ag蛋白（SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV. 邸III、SNAP-YF.EDIII、SNAP-巧.EDIII、SNAP-W化.EDIII、SNAP-ROCIO.邸III、SNAP-MVE. EDIII、SNAP-SLE.EDIII、SNAP-ZIKA.EDIII)的反应性和特异性。
[0017] 图7显示W多重免疫分析检测在DVl感染的人类患者血清中的抗-DVlIgM(A) 和抗-DVlIgG做对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2. 邸III、SNAP.DV3.抓III、SNAP.DV4.抓III、SNAP-WNV.EDIII、SMP-YF.抓III、SNAP-巧. EDIII、SNAP-WSL.EDIII、SNAP-R0CI0.EDIII、SNAP-MVE.EDIII、SNAP-SLE.EDIII、 SNAP-ZIKA.EDIII、SNAP-T邸.EDIII)的反应性和特异性。
[0018] 图8公开pDeSNAPuniv盒的结构。
[0019] 图 9 公开pDeSNAPuniv/SBV.N盒的结构。
[0020] 图10A和B显示（A)在用Cd"诱导10天（+)或未诱导的（-)的S2/SNAP-SBV.N细 胞上清中进行的免疫印迹分析。使用抗抗体检测分泌的嵌合蛋白SNAP-SBV.N(理 论MW50kDa)，与限定量的高纯度嵌合蛋白SNAP-T0S.N(理论MW49kDa)进行比较。炬）在 尺寸排阻层析柱的各馈分（化action)上直接可视的蛋白（PAGE-SDS的考马斯藍染色）对 应于来自诱导10天的S2/SNAP+SBV.N细胞分泌的SNAP+SBV.N蛋白的最后纯化步骤。
[0021] 图11显示含有本发明的抗原包被微球的装置的实例。
[002引 图12A-F显示含有SARS病毒N基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQIDNO:154) 和氨基酸序列（SEQIDNO: 155)。
[0023] 图13A-D显示含有SARS病毒S基因受体结合结构域的SNAP构建体的编码核巧酸 (SEQIDNO: 156)和氨基酸序列（SEQIDNO: 157)。
[0024] 图14A-E显示含有人类冠状病毒N基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 158)和氨基酸序列（SEQIDNO: 159)。
[0025] 图15A-G显示含有人类冠状病毒SI基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 160)和氨基酸序列（SEQIDNO: 161)。
[0026] 图16A-D显示含有人类冠状病毒SI基因受体结合结构域伽D)的SNAP构建体的 编码核巧酸（SEQIDNO: 162)和氨基酸序列（SEQIDNO: 163)。
[0027] 图17A-D显示含有钩端螺旋体的LruA基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 164)和氨基酸序列（SEQIDNO: 165)。
[002引图18A-D显示含有钩端螺旋体的LruB基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 166)和氨基酸序列（SEQIDNO: 167)。
[0029] 图19A-D显示含有钩端螺旋体的LipL32基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQ IDNO: 168)和氨基酸序列（SEQIDNO: 169)。
[0030] 图20A-F显示含有戊型肝炎的C基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 170)和氨基酸序列（SEQIDNO: 171)。
[0031] 图21A-E显示含有戊型肝炎的C基因的核屯、序列的SNAP构建体的编码核巧酸 (SEQIDNO: 172)和氨基酸序列（SEQIDNO: 173)。
[003引图22A-C显示含有丙型肝炎的C基因的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQID NO: 174)和氨基酸序列（SEQIDNO: 175)。
[0033] 图23A-D显示含有丙型肝炎的C基因的核屯、序列的SNAP构建体的编码核巧酸 (SEQIDNO: 176)和氨基酸序列（SEQIDNO: 177)。
[0034] 图24A-C显示含有编码来自施马伦贝格病毒（Schmallenbergvirus)的NS蛋白 的序列的SNAP构建体的编码核巧酸（SEQIDNO: 178)和氨基酸序列（SEQIDNO: 179)。
[0035] 图25A-B显示包含于本发明试剂盒中的抗原偶联微球的有利组合。
【具体实施方式】
[0036] 本发明使用对抗原的定向抗原偶联方法允许更高灵敏度和特异性地同时筛选生 物样本中的多个抗原。本发明人已经开发和验证了该样的免疫分析，其导致快速和同时检 测生物液体中由多种疾病（特别是虫媒病毒疾病和VHF)产生的几种抗体。
[0037] 为实现使用最少抗原对低量抗体检测的最佳灵敏度和特异性者，已经开发出定向 抗原偶联方法。该种定向抗原偶联方法基于AGT酶和其底物（06-苄基鸟嚷岭衍生物）之 间的共价相互作用，所述底物通过将其苄基转移至酶的活性位点半脱氨酸上与AGT酶不可 逆反应。相应地，一些祀抗原可融合至AGT酶部分，从而导致不同的嵌合融合蛋白下称 为[AGT-抗原]融合蛋白），其可W用作对存在于生物样本中抗体的捕获试剂。本发明人已 证明，当该些融合蛋白由于特异性AGT-底物相互作用结合到固体支持物上时该种抗体捕 获出人意料地得W增强。
[003引如在本申请的实例所示，本发明人用定向抗原偶联方法来生成一些不同抗原包 被的巧光微球。16组不同的微球已与16种纯化嵌合[AGT-抗原]融合蛋白相偶联，用 于滴定对W下不同蛋白特异的16种血清抗体；登革血清型1至4、西巧罗、黄热病、日本 脑炎、婢传脑炎、圣路易脑炎、墨累谷脑炎（MurrayValleyence地alitis)、威塞尔布朗 (Wesselsbron)、寨卡狂化a)、罗西奥（Rocio)、乌苏图扣SU化）、裂谷热和基孔肯雅病毒。 出人意料地，该16组不同微球已被混合在单一样本中而不影响检测的灵敏度和特异性 (参见图5)。该种系统的生产是高度时间效益和成本效益的，因为只需极少量的重组抗原 (<50yg)来产生一组抗原偶联的微球（~1. 25X106微球），该样的组足W进行1000个个 体分析。
[0039] 因此，本发明包括用于进行多重分析的方法和试剂盒，所述多重分析基于固体支 持物（优选标记的微粒）与AGT底物的定向抗原偶联，所述AGT底物偶联至嵌合融合蛋白 (即，AGT-抗原）。该种定向偶联允许抗原与生物样本中的抗体增加的相互作用。用AGT底 物包被的固体支持物可W与AGT-抗原通过在其免疫分析中的AGT酶的酶活性来相互偶联。
[0040] 6-烷基鸟嚷岭-DNA-烷基转移酶（AGT，也被称为ATase或MGMT，W下称为"AGT") 在IUBMB酶命名法中编号为EC2. 1. 1.63。它是207个氨基酸残基的6-烷基鸟嚷岭-DNA-烧 基转移酶DNA修复酶，其在细胞内的功能是修复烷基化DNA。更精确地，AGT通过将Sw2反 应中的甲基不可逆地转移至反应性半脱氨酸残基（切S145)对DNA中的妒-甲基化鸟嚷岭 发挥作用。最近，已经证明一些06-苄基鸟嚷岭衍生物通过将其苄基转移至AGT酶的活性 位点半脱氨酸上来与所述酶进行不可逆反应（参见Damoiseaux等人，化emBiochem. , 2001 ，W02004/031404和WO2005/085470)。因此，AGT-抗原可W通过该种酶反应与AGT底物偶 联。
[004U 与AGT-抗原偶联的固体支持物可W与含免疫球蛋白的生物样本一起解育。在免 疫球蛋白已经结合到固体支持物上之后，可W完成对有效结合至免疫球蛋白的固体支持物 的检测。免疫球蛋白包被的固体支持物的鉴定能够诊断哪种病原体感染患者（因为每种固 体支持物与限定的致病抗原相匹配）。该个检测步骤通过任何常规方法进行，例如通过使用 标记的检测抗体W及通过鉴定固体支持物的性质。
[0042] 有利地，本发明的方法仅设及在患病患者中检测抗体的存在，而不需要关于那些 抗体鉴定的知识。
[0043] 用于檢测《个靴杭体的方法
[0044] 本发明设及用于在生物样本中检测至少2种祀抗体的方法。本发明包括检测至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、30、40、50、100个等不同祀抗体的存在或 不存在。因此，本发明包括一种包括至少 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、20、25、 30、40、50、100个等固体支持物的方法，W及一种包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、20、25、30、40、50、100个等不同表位的方法。所述方法可^包括在加入生物样 本之前混