Car酶及脂肪醇的改良生产的制作方法
【专利说明】CAR酶及脂肋醇的改良生产
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2012年4月2日提交的美国临时申请号61/619,309的权益，该申请 W饮用方式并入本文。
[000引 序列表
[0004] 本发明包括序列表，该序列表通过EFS-WebWASCn形式提交，并且全文W引用方 式并入本文。在2013年4月2日创建的所述的ASCII拷贝命名为LS00039PCT_^.txt，并 且大小为89,038字节。
技术领域
[0005] 本发明公开涉及在重组宿主细胞中改良生产脂肪醇的变体駿酸还原酶（CAR)。本 发明公开进一步涉及变体CAR核酸和多肤W及重组宿主细胞和细胞培养物。本发明公开进 一步涵盖了制作脂肪醇组合物的方法。
【背景技术】
[0006] 脂肪醇构成了工业生化制品的重要类别。该些分子及其衍生物具有多种用途，包 括表面活性剂、润滑剂、增塑剂、溶剂、乳化剂、软化剂、增稠剂、风味剂、香料和燃料。在工业 上，脂肪醇是通过脂肪酸（其由天然来源产生，该天然来源例如挪子油、踪搁油、踪搁坚果 油、牛脂和猪油）的催化氨化或者通过a-帰姪（由石油化学品供料产生）的化学水合而 生产。由天然来源衍生的脂肪醇具有可变的链长。脂肪醇的链长对于具体应用而言是重要 的。实际上，脂肪醇还通过酶制得，其中所述的酶能够将醜基-ACP或醜基-CoA分子还原成 相应的伯醇（例如参见美国专利公开号20100105955、20100105963和20110250663,该些文 献W引用方式并入本文）。
[0007]目前用于生产脂肪醇的技术涉及脂肪酸的无机催化剂介导的还原成相应的伯醇， 该是昂贵、费时且繁兀的。在该种方法中使用的脂肪酸衍生自天然来源（例如上述植物和 动物油、W及脂肪）。此外，还可W通过化学催化来将脂肪醇脱水形成a-帰姪。然而，该技 术是不可再生的，并且涉及高的操作成本和具有环境危害的化学废品。因此，需要改良的脂 肪醇的生产方法，并且本发明公开解决了该需要。
[000引发明概述
[0009] 本发明公开的一个方面提供了包括如下氨基酸序列的变体駿酸还原酶（CAR)多 肤，其中所述的氨基酸序列与SEQIDNO: 7具有至少大约90%的序列一致性，其中变体CAR多肤是经过基因改造的，从而在如下氨基酸位置处具有至少一个突变，其中所述的氨基酸 位置选自氨基酸位置 3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、873、926、927、 930和1128。因此，变体CAR多肤在重组宿主细胞中的表达得到比表达相应的野生型多肤 的重组宿主细胞更高的脂肪醇组合物的效价。在相关的方面中，CAR多肤为CarB多肤。在 另一个相关的方面中，变体CAR多肤包括在位置S3R、D18R、D1化、D18T、D18P、E20V、E20S、 E20R、S22R、S22N、S22G、L80R、R87G、R87E、V191S、F288R、F288S、F288G、Q47：3L、Q473W、Q473Y、 Q473I、Q473H、A535S、D750A、R827C、R827A、I870L、R873S、V926A、V926E、S927K、S927G、M930K、M930R和/或L1128W中的突变。在相关的方面中，CAR多肤包括；突变A535S;或突 变E20R、F288G、Q473I和A535S;或突变E20R、F288G、Q473H、A535S、R827A和S927G;或突变 E20R、S22R、巧88G、Q473H、A535S、R827A和S927G;或突变S3R、E20R、S22R、巧88G、Q473H、 A535S、R873S、S927G、M930R和L1128W;或E20R、S22R、巧88G、Q473H、A535S、R873S、S927G、 19303和11128胖；或突变0181?、6201?、5221?、巧886、94731、45355、59276、]\19301(和1^128胖； 或突变E20R、S22RJ288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、S927K和M930R;或突变D18R、E20R、 288G、Q473I、A535S、R827C、V926E、M930K和L1128W;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473H、 A535S、R827C、V926A、S927K和M930R;或突变E20R、S22RJ288G、Q473H、A535S和R827C;或 突变E20R、S22R、巧88G、Q473I、A535S、R827C和M930R;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473I、 A535S、I870L、S927G和M930R;或突变E20R、S22R、巧886、94731、45355、187化和59270;或 突变D18R、E20R、S22R、巧88G、Q473I、A535S、R827C、I870L、V926A和S927G;或突变E20R、 8223、巧886、9473山45355、1?827(：、187化和1^128胖；或突变0181?、6201?、5221?^2886、9473山 A535S、R827C、I870L、S927G和L1128W;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473I、A535S、R827C、 I870L、S927G和L1128W;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G、 M930K和L1128W;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473H、A535S、I870L、S927G和M930K;或突变 E20R、巧886、Q473I、A535S、I870L、M930K;或突变E20R、S22R、巧886、Q473H、A535S、S927G、 M930K和L1128W;或突变D18R、E20R、S22R、F288G、Q473I、A535S、S927G和L1128W;或突变 ￡203、5221?、尸2886、94731、45355、、1?827(：、187化和59270;或突变0181?、6201?、5221?、尸2886、 Q473I、A535S、R827C、I870L、S927G和L1128W;或突变D18R、E20R、S22R、巧88G、Q473I、 A535S、S927G、M930R和L1128W;或突变E20R、S22R、巧88G、Q473H、A535S、V926E、S927G和 19303;或突变6201?、5221?、巧886、9473山45355、1?827(：、18701^、￥9264和11128胖；或它们的 组合。
[0010] 本发明公开的另一个方面提供了包括如下多核巧酸序列的宿主细胞，其中所述的 多核巧酸序列编码变体駿酸还原酶（CAR)多肤，该变体駿酸还原酶（CAR)多肤与SEQID NO: 7具有至少大约90%的序列一致性，并且在如下氨基酸位置处具有至少一个突变，其中 所述的氨基酸位置包括氨基酸位置3、18、20、22、80、87、191、288、473、535、750、827、870、 873、926、927、930和1128,其中当在有效表达变体CAR多肤的条件下在包括碳源的培养基 中培养时，所述的基因改造的宿主细胞W比表达相应的野生型CAR多肤的宿主细胞更高的 效价或产率来生产脂肪醇组合物，并且其中所述的SEQIDNO: 7为相应的野生型CAR多肤。 在相关的方面中，重组宿主细胞进一步包括编码硫醋酶多肤的多核巧酸。在另一个相关的 方面中，重组宿主细胞进一步包括编码F油B多肤和化dR多肤的多核巧酸。在另一个相关 的方面中，本发明公开提供了包括编码脂肪酵还原酶（AlrA)的多核巧酸的重组宿主细胞 及包括该细胞的细胞培养物。
[0011] 本发明公开的另一个方面提供了重组宿主细胞，其中当表达相应的野生型CAR多 肤的宿主细胞在与所述的基因改造的宿主细胞相同的条件下培养时，所述的基因改造的宿 主细胞的效价是表达相应的野生型CAR多肤的宿主细胞效价的至少3倍。在一个相关的方 面中，基因改造的宿主细胞的效价为大约30g/L至大约250g/L。在另一个相关的方面中，基 因改造的宿主细胞的效价为大约90g/L至大约120g/L。
[0012] 本发明公开的另一个方面提供了重组宿主细胞，其中当表达相应的野生型CAR多 肤的宿主细胞在与所述的基因改造的宿主细胞相同的条件下培养时，所述的基因改造的宿 主细胞的产率是表达相应的野生型CAR多肤的宿主细胞产率的至少3倍。在一个相关的方 面中，基因改造的宿主细胞的产率为大约10%至大约40%。
[0013] 本发明公开进一步涵盖包括本发明所述的重组宿主细胞的细胞培养物。在相关 的方面中，细胞培养物的生产率是表达相应的野生型CAR多肤的细胞培养物的生产率的至 少大约3倍。在另一个相关的方面中，生产率为大约0. 7mg/L/虹至大约3g/L/虹。在另一 个相关的方面中，培养物培养基包括脂肪醇组合物。脂肪醇组合物是在细胞外生产的。月旨 肪醇组合物可W包括C6、C8、CIO、C12、C13、C14、C15、C16、C17 或C18 脂肪醇；或者CIO: 1、 C12:l、C14:l、C16:l和C18:l不饱和脂肪醇中的一种或多种。在另一个相关的方面中，月旨 肪醇组合物包括C12和C14脂肪醇。在另一个相关的方面中，脂肪醇组合物包括比例为大 约3:1的C12和C14脂肪醇。在另一个相关的方面中，脂肪醇组合物涵盖了不饱和的脂肪 醇。此外，脂肪醇组合物可W包括在由脂肪醇的还原末端的C7和C8之间、在碳链的位置7 处具有双键的脂肪醇。在另一个方面中，脂肪醇组合物包括饱和的脂肪醇。在另一个方面 中，脂肪醇组合物包括支链脂肪醇。
[0014] 本发明公开进一步考虑W更高的效价、产率或生产率来制作脂肪醇组合物的方 法，其包括W下步骤；改造重组宿主细胞；在包括碳源的培养基中培养重组宿主细胞；W及 可任选地由培养基中分离脂肪醇组合物。
[0015] 附图简述
[0016] 当联合附图一起阅读本发明公开时，可W更好地理解，其中所述的附图起到示意 优选的实施方案的作用。此外，应该理解的是本发明公开不限于附图中公开的具体的实施 方案。
[0017] 图1为在重组宿主细胞中W醜基CoA作为前体来生产脂肪酸衍生物的示例性生物 合成途径的概况。该循环由丙二醜基-ACP和己醜基-CoA的缩合来引发。
[001引图2为示例性脂肪酸生物合成循环的概况，其中通过将丙二醜基-CoA转醜基而 形成丙二醜基-ACP来生产丙二醜基-ACP(通过丙二醜基-CoA:ACP醜基转移酶（化bD) 的催化）；然后，目-丽脂醜基-ACP合成酶III(化bH)引发丙二醜基-ACP和己醜基-CoA 的缩合。延长循环开始于目-丽脂醜基-ACP合成酶I(化bB)和目-丽脂醜基-ACP合成 酶II(f油巧催化的丙二醜基-ACP与醜基-ACP的缩合，从而生产目-丽-醜基-ACP，该 目-丽-醜基-ACP接着被NADPH依赖的目-丽脂醜基-ACP还原酶（化bG)还原，从而生产 目-羟基-醜基-ACP，其通过目-羟基醜基-ACP脱水酶（化bA或f油幻脱水形成反-2-帰 醜基-醜基-ACP。F油A还可W使反-2-帰醜基-醜基-ACP异构化形成顺-3-帰醜基-醜 基-ACP，其可W绕过f油I，并可W被化bB利用（脂肪族链长通常至多为C16)，从而生产 目-丽-醜基-ACP。各循环中的最后步骤是由NADH或NADHPH依赖的帰醜基-ACP还原酶 (化bl)催化的，其将反-2-帰醜基-醜基-ACP转化为醜基-ACP。在上文所述的方法中，月旨 肪酸合成的终止是通过硫醋酶将醜基由醜基-ACP上移除，从而释放游离的脂肪酸（FFA)来 进行的。硫醋酶（例如tesA)水解硫醋键，该是通过硫氨基键在醜基链与ACP之间进行的。
[0019]图3示出了己醜基-CoA駿化酶（accABCD)的酶复合物的结构和功能。生物素駿 化酶由accC基因编码，而生物素駿基载体蛋白质炬CCP)由accB基因编码。该两个与駿基 转移酶活性有关的亚基由accA和accD基因编码。BCCP共价键合的生物素携带駿酸部分。birA基因（图中未示出）将全-accB生物素化。
[0020] 图4提出了W醜基-ACP为起始来生产脂肪醇的示例性生物合成途径的概况，其中 脂肪酵的生产是由醜基-ACP还原酶（AAR)或硫醋酶、W及駿酸还原酶（Car)的酶活性来催 化的。脂肪酵通过酵还原酶（也称为醇脱氨酶）转化为脂肪醇。该途径不包括脂肪醜基 CoA合成酶（fa曲）。
[0021] 图5示出了与由大肠杆菌MG1655所进行的脂肪酸衍生物的生产相比，具有化祀 基因衰减（即，删除）的MG1655大肠杆菌菌株所进行的脂肪酸衍生物（总脂肪物质）的生 产。图5提供的数据显示化祀基因衰减不会影响脂肪酸衍生物的生产。
[002引图6A和她示出了当质粒P化-WTTRCWTTesA转化至如图所示的各菌株中时，并 在FA2培养基中发酵20小时，从而在32C(图6A)和37C(图6B)完成诱导至收获，由2 个重复的平板筛选得到的"总脂肪物质"的生产数据。
[002引图7A和7B提供了 1FAB138基因座的图示，其包括整合在FAB138前面的cat-loxP-T5启动子的示意图（图7A) ;W及iT5_138的示意图（图7B)。整合在FAB138前 面的cat-loxP-T5启动子区的序列（其在cat-loxP-T5启动子区的每一侧上显示出50个 碱基对的同源性）在SEQIDN0:1中提供，而iT5_138启动子区的序列（其在每一侧上具 有50个碱基对的同源性）在SEQIDNO:2中提供。
[0024]图8示出了校正巧h和ilvG基因的作用。使用由D191获得的P化-tesA(包括PTRC- 'tesA的P化1920质粒）转化EG149(ii)h-ilvg-)和V668巧G1491地+ilvG+)。附图 示出了在EG149菌株中校正巧h和ilvG基因允许W比V668菌株更高水平地生产FFA，其中 所述的V668菌株的巧h和ilvG基因是未校正的。
[00巧]图9为转座子盒插入到菌株1〔535的如^下基因（转座子匹配物68F11)中的示意 图。其中示出位于转座子盒内部的启动子，并且该启动子可W影响相邻的基因的表达。
[0026] 图10示出了在菌株V324中通过CarB60将游离脂肪酸转化为脂肪醇。附图示出 了与CarB(浅柱）相比，表达CarB60(得自染色体）的细胞（深柱）将更高级份的C12和 C14游离脂肪酸转化成脂肪醇。
[0027] 图11示出了与Cai~B相比，表达CarB60(得自染色体）的细胞将更高级份的C12 和C14游离脂肪酸转化成脂肪醇。
[0028] 图12示出了组合文库的突变体在发酵之后的脂肪醇生产。
[0029] 图13示出了ca巧变体在生产型质粒（carBl和CarB2)中在摇瓶发酵之后的脂肪 醇生产。
[0030] 图14示出了单一拷贝的整合的carB变体（icarBl、icarB2、icarB3和icarB4)在 摇瓶发酵之后的脂肪醇生产。
[0031] 图15示出了双质粒筛选系统的结果，其用于通过摇瓶发酵证实被改良的Cai~B变 体。
[0032] 图16示出了用于在生物反应器中改良地生产脂肪醇的新的Cai~B变体。
[003引发明详述
[0034]综述
[00巧]本发明公开提供了新的变体駿酸还原酶（CAR)及其核酸和蛋白质序列。本发明公 开进一步涵盖了重组宿主细胞和细胞培养物，其包括用于生产脂肪醇的变体CAR酶。为了 商业上可利用地由可发酵糖或生物质生产脂肪醇，必须优化所述的方法W用于有效地转化 和回收产物。本发明公开通过使用改造的变体酶和改造的重组宿主细胞来提供改良地生产 脂肪醇的组合物和方法而解决了该一需要。宿主细胞作为生物催化剂，从而使用发酵方法 高效价地生产脂肪醇。依此，本发明公开进一步提供了创建光合异养宿主细胞的方法，其中 所述的光合异养宿主细胞直接生产特定链长的脂肪醇和a-帰姪，该样可不必催化转化纯 化的脂肪酸。该种新方法提供了产品质量和成本的优点。
[0036] 更具体而言，可W通过修饰一种或多种基因（与脂肪醇的生产、降解和/或分泌的 生物合成途径有关）的表达来增强所需的脂肪醇组合物的生产。本发明公开提供了重组宿 主细胞，其经过改造从而提供相对未改造的或天然的宿主细胞而言增强的脂肪醇生物合成 (例如菌株改良）。此外，本发明公开提供了用于本发明公开的重组宿主细胞、方法和组合 物的多核巧酸。然而，公认的是，与此类多核巧酸绝对一致的序列不是必须的。例如可W对 特定多核巧酸序列进行改变，并针对活性评估编码的多肤。该种改变通常包括保守突变和 沉默突变（例如密码子优化）。可W使用本领域已知的方法，针对所需的功能筛选修饰的或 突变的多核巧酸（即，突变体）、W及编码的变体多肤，其中所述的功能例如为相比亲代多 肤的改良的功能，包括但不限于增强的催化活性、增强的稳定性或降低的抑制作用（例如 降低的反馈抑制作用）。
[0037] 本发明公开鉴定了根据酶分类巧C)号、与本发明所述的脂肪酸生物合成途径的 多个步骤（即，反应）有关的酶活性，并提供通过所述的EC号分类的示例性多肤（即，酶）、 W及编码此类多肤的示例性多核巧酸。此类示例性多肤和多核巧酸（其通过编号和/或 序列识别号（SEQIDNO)识别）可用于改造亲代宿主细胞中的脂肪酸途径，从而获得本发 明所述的重组宿主细胞。而且，应该理解的是本发明所述的多肤和多核巧酸是示例性的并 且是非限定的。本领域的那些技术人员可W使用多个数据库获得本发明所述的示例性多肤 的同源序列（例如the^tionalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI)提供 的Elntrez数据库，theSwissInstituteofBioinformatics提供的Ex化sy数据库，the TechnicalUniversityof化aunschweig提供的BRENDA数据库，W及theBioinformatics CenterofKyotoUniversityandUniversityofTokyo提供的KEGG数据库，所有该些均 可在theWorldWideWeb上获得）。
[0038] 多种宿主细胞可W被修饰从而包括脂肪醇生物合成酶（例如本发明所述的那 些），从而使重组宿主细胞适于生产脂肪醇组合物。应该理解的是多种细胞可W提供遗传物 质的来源，包括编码适用于本发明提供的重组宿主细胞中的多肤的多核巧酸序列。
[003引定义
[0040] 除非另外的指示，本发明使用的所有技术和科学术语都具有本发明公开所属技术 领域的任一普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本发明所述的那些相似的或等 价的其他方法和材料可W用于实施本发明公开，但是优选的材料和方法在本发明中进行了 描述。在描述和对本发明公开提出要求时，W下术语根据下文列出的定义来使用 [00川编号：在整个说明书中使用的序列编号得自由NCBI(化tionalCenter化r BiotechnologyInformation)提供的数据库（其由the^tionalInstitutes of化al化U.S.A.维护）（该编号在本发明中确认为"NCBI编号"或备选地确认 为"GenBank编号"），W及得自the Swiss Institute of Bioinformatics提供的UniProt Knowledgebase(UniProt邸)and Swiss-Prot数据库（该编号在本发明中确认为 "化iProt邸编号，，）。
[0042]酶分类巧C)号；EC号由the Nomencla1:ure Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology(lUBMB)建立，其描述可W在国际互联网 的lUBMB Enzyme Nomencla化re网站上获得。EC号是根据所催化的反应将酶分类。
[0043]如本文所用，术语"核巧酸"是指多核巧酸的单体单元，其由杂环碱基、糖和一个或 多个磯酸基构成。天然形成的碱基（鸟嘿岭佑)、腺嘿岭（A)、胞嚼巧（C)、胸腺嚼巧（T)和 尿嚼巧扣)）通常为嘿岭或嚼巧的衍生物，但是应该理解的是天然和非天然形成的碱基类 似物也被包括在内。天然形成的糖为戊糖（五碳糖）脱氧核糖（其形成DNA)或核糖（其 形成RNA)，但是应该理解的是天然和非天然形成的糖类似物也被包括在内。核酸通常通过 磯酸键连接，从而形成核酸或多核