专利名称：多枝柽柳Myb转录因子基因的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，涉及一种柽柳的Myb转录因子基因。
背景技术：
目前，应用转基因技术改良植物的抗性已经成为共识，同时已经有各种基因获得专利的报道。柽柳抗旱、耐盐能力极强，说明其体内有一系列抗逆能力强的基因。因此，柽柳是进行抗性基因的良好材料。
进行基因的克隆技术是要确定所要克隆的目的基因，然后通过构建cDNA文库及EST分析、RT-PCR、酵母双杂交等技术获得所需基因的片段或全长，对基因片段，则应用RACE方法或cDNA文库筛选方法获得全长基因。
在基因工程技术中，由于植物的抗盐性状为数量性状，涉及大量的基因，因此，转单一的抗盐基因抗盐效果不十分明显，而且，到目前为止，也尚未培育出真正能够在盐渍化土壤生长的抗盐转基因植物。因此，人们将研究重点投向了能够调控大量基因表达的调控因子类基因，研究表明，植物体内有依赖于ABA和不依赖于ABA的两种抗逆基因调控途径，其中Myb转录因子及bZIP转录因子为依赖于ABA合成的抗逆基因调控途径(林忠平 主编.走向21世纪的植物分子生物学.北京科学出版社)，2000.234～241)，DREB为不依赖于ABA(脱落酸)的抗逆基因调控途径。目前，已经有许多对植物转录调控因子基因的抗逆性进行研究的报道，如刘强等对DREB(dehydration responsiveelement-bindingprotein)转录因子进行研究，发现转DREB基因的植物有良好的抗盐效果。而Myb转录因子作为抗盐、旱基因表达的调控因子，已经为人们所公认，但目前尚未有克隆和研究柽柳Myb转录因子基因的报道。
发明内容
本发明的目的是克隆出一种抗盐能力极强的木本植物柽柳的调控抗盐、旱胁迫基因表达的多枝柽柳Myb转录因子基因，它是一种用于植物转基因培育抗旱、耐盐新品种。本发明的多枝柽柳Myb(Myb transcription factor)转录因子基因具有如序列表所表示的编码区核酸及氨基酸序列。本发明采用cDNA文库技术建立cDNA文库，对文库克隆进行EST分析，从大量基因序列中筛选获得了该基因的部分序列，该序列3’端完整，5’不完整，应用5’RACE技术克隆出其全长cDNA序列，用Pfam(pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Proteinsearch)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族，其cDNA全长是847bp，编码区位置在164-412碱基之间，长249bp，包含82个氨基酸。柽柳广泛分布于我国西北地区的干旱、盐渍化荒漠中，是荒漠地区盐渍化沙地上良好的固沙造林树种，具有强的抗盐、旱胁迫，耐高温等特性(张道远.张娟.谭敦炎.潘伯荣.国产柽柳科3属6种植物营养枝的解剖观察，西北植物学报，2003，23(3)382～388)，因此它是一种进行植物抗盐研究的理想材料。Myb转录因子是一种重要的抗旱、耐盐调控基因，可以调控植物体内大量抗旱、耐盐基因的表达(Abe H，Yamaguchi-Shinozaki K，Urao T，Iwasaki T，Hosokawa D，Shinozaki K.Role of Arabidopsis MYC and MYB homologs in drought-andabscisic acid-regulated gene expression.Plant Cell，1997，91859-1868)，是国内外公认的抗旱、耐盐调控基因，目前抗旱、耐盐基因克隆与研究的热点。因此，在抗旱、耐盐转基因育种中有重要的应用价值。将该基因具有明显的抵抗干旱、耐盐能力构建在植物表达载体ProkII中，转化到烟草中，发现转基因烟草与对照相比具有明显的抗旱与耐盐效果，转基因烟草可以在-45Kp的水势下能够正常生长5天以上，而非转基因烟草则出现枯萎现象，在1.5％NaCl(W/V)条件下仍可正常生长，而非转基因烟草则枯萎，抗旱、耐盐效果非常明显。
具体实施例方式具体实施方式
一本实施方式是这样实现的(一)提取柽柳的总RNAa、向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液(2％(w/v)CTAB，NaCl 1.4mol/L，四硼酸钠0.025mol/L，pH＝9)和10％(V/V)β-巯基乙醇得到提取液，65℃水浴锅中预热5分钟；b、将柽柳材料用液氮冷却研磨，加入到提取液中，混匀，65℃水浴10分钟；c、加入等体积的Tris酚/氯仿混合液，12000g离心5分钟，取上清液，重复酚/氯仿抽提一次；d、向上清液中加入等体积氯仿，12000g离心5分钟，取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴放置3小时；
e、15000g，4℃离心15分钟，弃上清，用70％乙醇清洗沉淀，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用；f、用Promega公司的mRNA分离试剂盒(PolyATtract mRNA IsolationSystem III)分离mRNA取mRNA 5ug用于构建柽柳cDNA文库，cDNA文库构建试剂盒为ZAP-cDNA Synthesis Kit and ZAP-cDNA GigapackIII GoldCloning Kit(Stratagene公司生产，其产品号为200450)，所建立的柽柳cDNA文库滴度为7.2×105pfu，重组率为98％；g、用PCR法检测文库克隆插入片段长度在1kb左右；(二)对文库克隆进行测序测序引物为T3引物，cDNA文库克隆的测序仪为Amersham Pharmacia公司的MegaBACETM1000 DNA序列分析仪。通过对文库克隆的Blast X分析获得Myb基因的片段，该片段长度为689bp，具有完整的3端，但5端不完整，序列如下＞myb转录因子片段序列5’ACTCTTCCACAACTGCTGCAAACACGGCAACATCTGATGAAAATTCTGTCGATTCCTCAGAGTACAGCTACCAAGAGTTTAAGCCGGAATTTTCTGAAGATGAAGAGACTCTGATCACTAGGATGTTCAATTTGGTTGGAGAAAGATGGTCTCTGATTGCCGGGAGAATTCCAAGGAAGGACAGCCGAAGAGATTGAGAAATACTGGACTTCAAGGTACTATACAAGTCGGTGAGCAGAAAGATTGAGGAGCCCCGGCCGACCTGCCTGCCTATATAATACTACGAAGCATAGATATGACCGAGAGAGAGGCATGTAAAAAATTATTAGACGGATTCGTAAAACGGTGAATCCCCACTTATAAATCCCATCGATCGAGTGCTGCCTTGGAATACTAGAGGCAACAAAAACAGCATTTACGGTTGTTGTATGAAAAGTTGTAGCGGTTGTGCTCCTCTTCTATCCTCCCTATGTATATTTTTAAGTGCTTTCTCTTTGTTTTGGAAATTAGCGGCGTTATCATACTGCTAGACTAGATTAGACTAGACTCGAGTCCAGACCTCTTCAGTCGTTTTTAGGAAGGAGATCAGCGTCGGTGCATGCATGACATTTGTTGTACTTTATGTATATTGGTTTTTATGAGCGTTAAGACGTCTCTCTCTTCCTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’。
根据上面获得的已知的基因序列设计5’RACE引物5’CTCTTGGTAGCTGTACTCTGAGGAATCG3’，然后通过5’RACE技术获得完整的基因。
用RACE试剂盒(RACE克隆试剂盒为SmartTMRACE cDNA AmplificationKit(BD Biosciences公司)进行克隆全长cDNA序列用1μg总RNA进行反转录，具体所用的试剂及操作步骤均严格参照按试剂盒说明书，反转录后将反转录溶液用TE缓冲液(试剂盒提供)稀释到100μL，PCR反应体系严格参照试剂盒说明书，PCR反应使用改动的降落PCR(touchdown PCR)程序，具体PCR程序为94℃预变性1min，94℃ 6sec，72℃ 3min 6个循环，94℃6sec，70℃ 12sec，72℃ 3min，5个循环，94℃ 6sec，68℃ 12sec，72℃ 3min，30个循环，72℃保温7min。扩增后获得了1条长度为350bp的特异扩增片段，将该片段与pMD18-T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌Jm109，将插入片段与目的片段大小相符合的克隆进行测序。测序结果为5’GATTGGAATTCTCCCGGCAATCAGAGACCATCTTTTTCCATTCCAATTGAACATAGCTTCCGCTTCACTCCAATACTAGCTTCCACCTGAAGAACAACAAGTGTAGGTATATAATTAATTGTTTTAGTTTTCGAAAACATCTCAAAACAGAGACCCTGAAGTTATGGCAGACAAGGCTCACTCTTCCACAACTGCTGCAAACACGGCAACATCTGATGAAAATTCTGTCGATTCCTCAGAGTACAGCTACCAAGAG 3’。
用NCBI(WWW.ncbi.nlm.nig.gov)的Align two sequences程序对原序列和RACE获得的序列进行拼接，将拼接后应用ORF FOUNDER寻找开放读码框，将开放读码区的推导氨基酸序列进行BLASTP相似性比较，结果如序列表所示。该基因编码区长847bp，编码区长249bp，编码82个氨基酸，5’非翻译区长163bp，3’非翻译区长435bp。
用Pfam(pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Protein search)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族。结果如下Myb_DNA-bindingdomain 1 of 1，from 33 to 78score 32.4，E＝1.3e-06query*-＞rgrWtaeEdellveavekhGkgfgIrlsltkanWkkIaekmgpgssn+++++++E+ 1+ +++++G + W++Ia+++33 KPEFSEDEETLITRMFNLVGER-----------WSLIAGRIP--63nvegrtaeqcklryykyk＜-*grtae++ ++query 64---GRTAEEIEKYWTSRY78
<110>东北林业大学<120>多枝柽柳Myb转录因子基因<160>1<210>1<211>249<212>DNA<213>多枝柽柳Myb转录因子基因的编码区cDNA序列<400>11 atggcagacaaggctcactcttccacaactgctgcaaacacggcaM A D K A H S S T T A A N T A46 acatctgatgaaaattctgtcgattcctcagagtacagctaccaaT S D E N S V D S S E Y S Y Q91 gagtttaagccggaattttctgaagatgaagagactctgatcactE F K P E F S E D E E T L I T136 aggatgttcaatttggttggagaaagatggtctctgattgccgggR M F N L V G E R W S L I A G181 agaattccaggaaggacagccgaagagattgagaaatactggactR I P G R T A E E I E K Y W T226 tcaaggtactatacaagtcggtga 249S R Y Y T S R *
权利要求
1.多枝柽柳Myb转录因子基因，其特征在于该基因的编码区cDNA序列为5’ATGGCAGACAAGGCTCACTCTTCCACAACTGCTGCAAACACGGCAACATCTGATGAAAATTCTGTCGATTCCTCAGAGTACAGCTACCAAGAGTTTAAGCCGGAATTTTCTGAAGATGAAGAGACTCTGATCACTAGGATGTTCAATTTGGTTGGAGAAAGATGGTCTCTGATTGCCGGGAGAATTCCAGGAAGGACAGCCGAAGAGATTGAGAAATACTGGACTTCAAGGTACTATACAAGTCGGTGA 3’。
全文摘要
多枝柽柳Myb转录因子基因，它属于基因工程技术领域，涉及一种柽柳的Myb转录因子基因。本发明采用cDNA文库技术建立cDNA文库，对文库克隆进行EST分析，从大量基因序列中筛选获得了该基因的部分序列，该序列3’端完整，5’不完整，应用5’RACE技术克隆出其全长cDNA序列，用Pfam(pfam.wustl.edu/)程序中的蛋白质搜索(Protein search)对该蛋白进行家族预测，确定该基因为Myb蛋白家族，其cDNA全长是847bp，编码区位置在164－412碱基之间，长249bp，包含82个氨基酸。
文档编号C12N15/29GK1624132SQ20041004403
公开日2005年6月8日 申请日期2004年11月10日 优先权日2004年11月10日
发明者姜静, 王玉成, 杨传平, 刘桂丰 申请人:东北林业大学