个 多肤，然后可W使用任何常规筛选方法筛选该富集的多个多肤的活性。
[0071] 在某些实施例中，在此描述的该些方法可用于筛选多核巧酸文库。在具体实施例 中，该些方法利用具有至少约1〇2、1〇3、1〇4、1〇5、1〇6、1〇7、1〇8、1〇9、1〇1°、1〇11W及10 12个不同多 核巧酸的文库。通常，文库的大小将少于约10"个不同多核巧酸。多核巧酸文库大小还可W 落入由该些值中的任意值所限制的任何范围内，例如1〇2-1〇15、1〇3-1〇12、1〇3-1〇11、1〇3-1〇1"、 1〇3-1〇9、1〇3-1〇8、1〇3-1〇7、1〇3-1〇6 等。
[0072] 在此描述的方法中有用的多个多核巧酸可W获得自任何来源和/或W任何方式 产生。在不同实施例中，它们可W来源于来自植物或动物的样品或来源于环境样品。例如， 多个多核巧酸可W来源于细菌、原生动物、真菌（例如，酵母、丝状真菌）、病毒、细胞器W 及高等生物，如植物或动物，特别是哺乳类，并且更特别是灵长类，并且甚至更特别是人类。 可W按本领域的技术人员所熟知的多种不同方式中的任何方式建立多核巧酸文库。具体 而言，天然发生的多核巧酸池可W克隆自基因组DNA或cDNA(萨姆布鲁克（Sambrook)等 人，1989,分子克隆实验手册（Mole州larCloning:AL油oratoryManual),第2版，第 1-3 卷，冷泉港实验室）；例如，已经证明通过PCR扩增来自免疫或未免疫供体的抗体基因的组 库而制备的瞻菌体抗体文库是功能性抗体片段的非常有效的来源（温特（Winter)等人， 免疫学年鉴（AnnuRevImmunol.) 1994 ;12 ;433-55 ;霍根布姆（Hoogenboom)，生物技术趋 势（TrendsBiotechnol.) 1997年2月；15(2) ;62-70)。还可W通过随机或渗杂寡核巧酸 合成来编码基因的全部（参见例如，史密斯（Smith),科学（Science) 1985年6月14日； 228(4705) ;1315-7 ;帕姆利（Parmley)和史密斯，基因 1988 年 12 月 20 日；73(2) ;305-18) 或部分（参见例如，洛曼（Lowman)等人，基因佑ene) 1988年12月20日；73(2) ;305-18) 或基因池（参见例如，巧西姆（Nissim)等人，基因1988年12月20日；73(2) ;305-18)而 制备基因文库。还可W通过多种体内技术向多核巧酸或多核巧酸池中随机地引入突变来制 备文库，包括；使用细菌的增变菌株，如大肠杆菌mutD5(廖（Liao)等人，美国科学院院刊 (Proc化tlAcadSciUSA. ) 1986 年 2 月；83(3) ;576-80;山岸（YamagisW)等人，蛋白 质工程（ProteinE：ng.) 1990年8月；3(8) ;713-9 ;洛（Low)等人，1分子生物学杂志（JMol Biol.) 1996年7月19日；260(3) ;359-68);使用B-淋己细胞的抗体超变系统（叶尔阿摩 司（Yelamos)等人，自然（化1:山"6) 1995年7月20日；376巧537) ;225-9)。还可W通过化 学诱变剂和离子化或UV照射（参见，弗里德贝格（化ie化erg)等人，英国皇家学会哲学学 报6;生物科学任1111〇8 1'脚118 1?8〇(3 1〇11(16 61〇18^.) 1995 年1月30日；347(1319); 63-8)，或渗入致突变碱基类似物（弗里兹（Freese),美国科学院院刊（ProcNatlAcadSci USA. ) 1959年4月；45(4) ;622-33;扎克科罗狂accolo)等人，分子生物学杂志（JMol Biol.) 1996年2月2日；255(4) ;589-603)而在体内和在体外引入随机突变。还可W例如 通过使用易错聚合酶而在聚合过程中在体外向基因中引入随机突变（莱昂（Leung)等人， 技术（Technique) 19891 。可W通过使用同源重组而在体内（参见，柯瓦克斯考斯基 化owalczykowski)等人，微生物学评论（MicrobiolRev. ) 1994 年 9 月；58(3) ;401-6巧或 在体外（施特默尔（Stemmer)，美国科学院院刊（(Proc化tlAcadSciUSA. ) 1994年10 月 25 日；91(22) ;10747-51 ;施特默尔，自然（化Uire) 1994年8 月 4 日；370 化488) ;389-91) 引入另外的多样性。还可W从序列数据库或计算预测的序列用化学方法合成全部或部分基 因的文库。
[0073] 使用适合的表达载体，多肤最便利地产生自多个多核巧酸。因此，可用于在此披露 的方法中的多核巧酸文库典型地位于或可W被插入进一个表达载体中，该表达载体在预期 的宿主细胞或体外转录/翻译系统中发挥作用。表达载体可W包括适合的调控序列，如基 因产物的有效表达所需的那些，例如启动子、增强子、翻译起始序列、多腺巧酸化序列、剪接 位点等。多种多样的表达载体和宿主细胞是为本领域的技术人员可获得且已知的。
[0074] 可W通过任何便利的可供使用的方法确定表达的多肤溶解度。该方法是一种允许 并且优选地有助于回收编码被确定为可溶的多肤的多核巧酸的方法。优选地，该方法是一 种W高通量方式有助于溶解度测定和多核巧酸回收的方法，例如，在单个测定中针对表达 可溶性多肤的能力而可W筛选多核巧酸文库的全部成员的情况下。例如，有用的高通量系 统包括其中的每个多肤都被表达W便用例如细胞、颗粒、液滴等中的该编码多核巧酸"包装 (packaged)"或与其连接的那些，其中每个"包装（例如，细胞）"或连接的复合物都可W针 对指示可溶性多肤的表达的信号进行单独分析并且然后基于此信号进行分选。可W使用例 如巧光激活细胞分选器（FAC巧或微流体装置进行信号检测与分选。
[0075] 可W通过在体内（即，在宿主细胞内）进行表达而用其表达的多肤包装多核巧酸。 还可W通过在体外（例如，在包括用于体外转录/翻译的组分的反应混合物中）进行表达 而用其表达的多肤包装多核巧酸。在不同实施例中，至少约20%、30%、40%、50%、60%、 70%、80%或90%的该些反应混合物中每反应混合物表达一种或更少类型的多肤（即，一 种多肤或没有多肤）；每反应混合物表达一种或更少多肤的反应混合物的百分比也可W落 入由该些值所限制的任何范围内。该些反应混合物可W例如是油包水乳液中的水相液滴。
[0076] 在具体实施例中，该多个多核巧酸各自被融合至编码溶解度报告部分的多核巧 酸。在此类实施例中，用于溶解度确定的多肤的产生可W需要产生融合蛋白，在该些融合蛋 白上进行溶解度确定。在分析下对应于该多肤的融合部分的正向折叠典型地与功能性溶解 度报告子相关。
[0077] 在一些实施例中，该宿主细胞或体外转录/翻译系统表达一种互补多肤，该互补 多肤能够结合至融合蛋白的溶解度报告部分，W产生一种可检测的蛋白质复合物。例如， 该些融合蛋白可W表达自一个表达载体，该表达载体包括诱导型或阻抑型启动子，该启动 子允许终止该些融合蛋白的表达，随后是一个允许降解或加工错误折叠的融合蛋白的休眠 期。休眠期后，该互补多肤可W表达自一个不同的诱导型或阻抑型启动子。该互补多肤与 任何正向折叠的融合蛋白形成一种可检测的蛋白质复合物，并且可W针对该蛋白质复合物 筛选该些宿主细胞或该些体外转录/翻译反应混合物。
[007引在一些实施例中，例如，乳液中的水性液滴中的体外转录/翻译系统表达一种融 合蛋白，该融合蛋白包括溶解度报告部分，该溶解度报告部分包括多肤附接标签，该标签能 够与该多个多核巧酸中的多核巧酸形成共价键，或W其他方式结合至其上。该融合蛋白还 包括多肤亲和标签。在此类实施例中，可W在允许每种融合蛋白都如此该样的条件下表达 融合蛋白，该每种融合蛋白都能够与多核巧酸在该水相液滴中形成共价键，或W其他方式 结合至其上。可W通过亲和捕获针对可溶性融合蛋白筛选该些体外转录/翻译反应混合 物。
[0079] 在某些实施例中，对编码可溶性多肤的多个多核巧酸进行选择，W形成富集的多 个多核巧酸。可W单独或在池中回收用可溶性多肤包装或连接至其上的多核巧酸。回收的 多核巧酸可W充当富集的多个多核巧酸，该富集的多个多核巧酸可W任选地经受另外的筛 选。在溶解度筛选是基于检测宿主细胞中的蛋白质复合物的情况下，可W通过裂解包括该 可检测的蛋白质复合物的任何一个或多个宿主细胞，并回收编码融合蛋白的多核巧酸来回 收多核巧酸。当溶解度筛选是基于连接至编码一种融合蛋白的多核巧酸的该融合蛋白的亲 和捕获时，该筛选步骤产生回收的多核巧酸。在任何一种情况下，多核巧酸回收还可w需要 例如用退火至侧翼于该多核巧酸的载体区域的引物进行核酸扩增。
[0080] 该富集的多个多核巧酸可W经受另外的筛选，W鉴定一个或多个具有或可能具有 希望的活性的多核巧酸。可W通过表达该些富集的多肤或其部分并且然后筛选希望的特征 来进行筛选，希望的特征是例如蛋白质结合（特异性或非特异性）、酶活性、协同或抑制活 性、解吸、吸附等。可替代地，或另外，筛选可W需要对该些多核巧酸测序并鉴定具有感兴趣 的序列或序列基序、改变的序列频率、所选的序列同一性或反选的序列同一性的多核巧酸。
[0081] 在一些实施例中，针对编码具有高于预定水平的活性的多肤的多核巧酸而对该富 集的多个多肤进行筛选。在某些实施例中，进行活性筛选，W鉴定具有高于或低于野生型活 性水平或高于或低于"起始"活性水平的活性水平的多肤，例如，该"起始"活性水平是诱变 对应的多核巧酸之前的多肤的特征，W产生多核巧酸文库。在不同实施例中，该活性筛选 可W鉴定与野生型或起始活性水平的活性水平具有至少W下各项的不同的多肤；2%、5%、 10%、1日％、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85 %、90 %、95 %、2 倍、5 倍、10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍、35 倍、40 倍、45 倍、50 倍、55 倍、60 倍、65 倍、70 倍、75 倍、80 倍、85 倍、90 倍、95 倍、100 倍、500 倍、1，000 倍、5, 000 倍、 10, 000倍。在一些实施例中，活性水平的差异落入该些值中的任何值所限制的范围内，例如 2倍至10, 000倍、2倍至100倍、5倍至95倍、10倍至90倍、15倍至85倍、20倍至80倍、 25倍至75倍、30倍至75倍等。可W进行该样的一个筛选，W回收编码具有希望的活性的 多肤的多核巧酸。
[0082] 在具体实施例中，该选择产生富集的多个多核巧酸，该富集的多个多核巧酸具有 至少2倍富集的编码具有该活性的多肤的多核巧酸。在不同实施例中，富集程度是至少；5 倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75 倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、1〇3倍、104倍、105倍、106倍、108倍或109倍。在一些实 施例中，富集程度落入该些值中的任何值所限制的范围内，例如2倍至100倍、5倍至95倍、10倍至90倍、15倍至85倍、20倍至80倍、25倍至75倍、30倍至75倍、100倍至109倍、 1〇3倍至1〇8倍等。 A.通社将专库融1合牵帝白质溶解麼根告子的专库富集-体内系统
[0083] 在具体实施例中，体内富集方法需要将文库成员融合至蛋白质溶解度报告子，随 后选择编码可溶性融合蛋白的多核巧酸。在示意性实施例中，在适合的表达载体（例如，基 于T7启动子的载体）中，多核巧酸文库的每个成员都经由接头融合至编码11 0 -链多肤溶 解度报告子的多核巧酸（沃尔多（Waldo)&卡班图斯（C油antous)，"编码自组装拆分巧光蛋 白系统的核酸（Nucleicacidencodingaself-assemblingspli