专利名称：用PCR技术从人类全基因组Cosmid库中筛选ApoAI可表达全基因的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体涉及一种用PCR技术从人类全基因Cosmid库中筛选ApoAI可表达全基因的方法。
动脉粥样硬化心脑血管疾病(如冠心病，中风)是中国和西方国家致死疾病中的主要杀手。其主要病因是高血清总胆固醇(Gordon etal.1981；Stamler et al.1986；Pooling Project Research Group 1978；Anderson etal.1987)。流行病学调查揭示，血清总胆固醇每增加1％，冠心病危险因素增加2％(NCEPR 1991)。临床研究发现，降低血清胆固醇水平可以减少冠心病的发病率，阻滞动脉粥样硬化的发展(LPCP 1984；Frick 1987)。胆固醇不溶于水，不能在血液里转运。它必需与脂蛋白结合才能在血液里转运。人血液里有四种脂蛋白负责胆固醇的运载。它们是低密度脂蛋白(LDL)，高密度脂蛋白(HDL)，极低密度脂蛋白(VLDL)和中间密度脂蛋白(IDL)。在正常人中，三分之二的总胆固醇由LDL运载。LDL携带内源或外源胆固醇，穿过血管壁，进入内皮下(subendothelium)。在内皮下，LDL胆固醇被氧化成氧化型LDL胆固醇，并通过清道夫受体被巨噬细胞以胆固醇酯的形式在细胞内积聚。大量胆固醇酯积聚在巨噬细胞内形成了泡沫细胞。积聚了大量胆固醇酯的泡沫细胞沉积在血管内皮下，形成了动脉粥样硬化斑块的核心。资料表明，由LDL运载的胆固醇是导致动脉粥样硬化冠心病的主要根源(Goldstein1989；Vega 1986；Innerarity 1990；Rauth1992)。所以LDL胆固醇被称为坏胆固醇。胆固醇引起的动脉粥样硬化不但是冠心病的主要根源，同时也是脑血管疾病，如脑血栓形成，中风的重要病因。此外人脑细胞内积聚的高胆固醇酯还可能和老年性痴呆症的形成有关。体内胆固醇来源有内源和外源。外源胆固醇来自于饮食，内源胆固醇是自体合成的结果。内源胆固醇合成亢进和家族性高胆固醇血症在西方国家较为普遍。这种疾病必须通过药物控制。在美国，40％以上的成年人的LDL胆固醇(坏胆固醇)含量超过正常水平。由于胆固醇在形成心脑血管疾病中的重要作用，近十多年来，美国及欧洲药厂都把其抗动脉粥样硬化药的研究和开发放到降低血清总胆固醇及LDL胆固醇上。这些药中疗效最显著的有Merck药厂的Zocor和Warner-Lambert/Parke-Davis去年上市的Lipitor。这些药的作用机理都是抑制人体胆固醇合成的关键酶HMG-COA-还原酶。虽然HMG-COA-还原酶抑制药能显著的降低血清总胆固醇，防止、阻止及降低动脉粥样硬化和冠心病发生，发展和死亡，但它只能减少内源性胆固醇合成及降低家族性高胆固醇血症引起的冠心病的发展或恶化。对于治疗外源性胆固醇增多引起的动脉粥样硬化，对于消除已进入巨噬细胞内的胆固醇和抑制由此导致的动脉粥样硬化形成，对于去除动脉粥样硬化斑块中积聚的胆固醇，使动脉粥样硬化血管回复正常，则作用不大或无能为力。换句话说，目前欧美市场流行的抑制内源性胆固醇生成药物不能从根本上治疗广义的动脉粥样硬化心脑血管疾病。
医学研究证明，巨噬细胞吞噬和积聚胆固醇，转换成泡沫细胞，沉积在血管壁内皮下是动脉粥样硬化斑块形成的基础。清除积聚在血管壁巨噬细胞/泡沫细胞内的胆固醇，将其转运到肝脏分解，是治疗单纯降低血清胆固醇所不能达到的，根治动脉粥样硬化心脑血管疾病的最新的有效手段，清除巨噬细胞/泡沫细胞及动脉粥样硬化斑块内胆固醇的唯一的有效武器是HDL。近年来，西方心血管疾病研究人员及制药公司开始把研究方向放到新一类抗动脉粥样硬化药，升高密度脂蛋白(HDL)药上来。高密度脂蛋白(HDL)是一重要的胆固醇载体，它在运载胆固醇方面的功能与LDL截然相反。HDL可以刺激血管内皮下巨噬细胞内胆固醇酯水解，并将水解的非酯化胆固醇从巨噬细胞内转运至肝脏分解。更为重要的是，HDL能刺激沉积于血管壁和血管壁动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞/泡沫细胞内胆固醇酯水解。非酯化胆固醇被HDL从泡沫细胞转运至肝脏分解(Alan et al.1996)。从而去除了动脉粥样硬化赖以形成的基础。所以HDL的重要功能被称为胆固醇逆相转运(Reverse Cholesterol Transportation)。胆固醇逆相转运的结果是①抑制胆固醇酯在巨噬细胞内累积，阻止其转化为泡沫细胞，从而防止了动脉粥样硬化的形成；②因为HDL具有独特的转运动脉粥样硬化斑块内泡沫细胞里胆固醇至肝脏分解的作用，从而使动脉粥样硬化血管壁逐步回复正常。HDL的此二项功能一直是西方医学界在治疗动脉粥样硬化病中梦寐以求的效果。此外，HDL含有paraoxonase，可以抑制低密度脂蛋白氧化，防止LDL被巨噬细胞吞噬，产生泡沫细胞。HDL还可以刺激内皮细胞释放前列环素(PI)增加胆固醇酯水解和胆固醇转运出细胞。HDL的作用对象不分内源或外源胆固醇。基础及临床研究证实，每增加1mg/dl HDL胆固醇，冠心病死亡危险即下降2.5％(Alan et al.1996)。低血浆HDL是比高血浆胆固醇更重要的致动脉粥样硬化及冠心病的危险因子(Alan et al.1996)。
提高血浆HDL含量的机理是什么呢？简单地说是激活合成HDL活性成份的有关基因及HDL合成过程中有关酶或蛋白的基因。它们有五项。这5项因素中，最重要一项是ApoA水平。
流行病和转基因动物实验研究结果证实，血浆ApoAI可以抑制动脉粥样硬化的形成和发展(Castelliet al.1977；Rutin et al.1991)。ApoAI含量降低，动脉粥样硬化发病率升高(Castelli et al.1986；Rutinet al.1991)。APOAI就成为筛选治疗动脉粥样硬化的重要靶点。升高ApoAI靶标筛药系统是筛选新一代抗动脉粥样硬化心脑血管病升高密度脂蛋白(HDL)药中的核心技术工具，包括体外细胞靶标筛药方法部分(龚邦强，陆浩均专利，2000年)和体内转基因动物靶标筛药方法部分。我们已建立了ApoAI细胞靶标筛药方法部分。要建立转基因动物靶标筛药方法，其关键是获得ApoAI可表达全基因。然ApoAI可表达全基因加上其相关调控序列基因全长达10.5kb。以普通PCR的方式尚不能直接从基因组中直接扩增出如此大的片断，因此需要通过筛选合适的基因组库来获得完整片断。
获得基因的方法现在主要有两种，分为直接PCR扩增法，杂交膜筛选文库法。直接PCR扩增法受限于Taq酶的延伸性，一般条件下只能扩增到5kb，而且由于Taq酶具有一定的碱基错配率，扩增产物不完全忠实于体内的序列，因此不能获得大片断的基因。
杂交膜筛选文库法根据所用文库构建载体的类别，可以有普通质粒，M13，噬菌体，Cosmid，PAC，BAC，YAC，MAC等；Cosmid文库既能有效包含50kb以内的全基因，又能保持目标片断较短。筛选库的一般做法是根据文库的克隆片断的能力，以及所需基因物种的基因组大小，计算2-6倍完全覆盖率所需的最小的克隆数，以Cosmid库与人基因组对比，1倍覆盖率所需的克隆数为6×104，2-6倍则需要1.2×105-3.6×105克隆数；如以噬菌体或质粒计算则需要6×105-1.8×106克隆数。根据所需克隆数，以及一块细菌培养平板上所能有效容纳的克隆量，计算需要铺设的细菌平板数量，一般一块10cm平板可以容1200个克隆，15cm的平板可以容纳3700个克隆，这样筛选一次文库约需300块10cm平板或100块15cm平板，相应的各种试剂量使用相当惊人，如细菌培养基，杂交膜，杂交探针与探针标记物，杂交试剂等，粗略概算为26300元(300套平板2700元；7.51 LB培养基300元；杂交膜30000cm228400元；标记试剂合800元；放射性同位素150uCi 7500元；探针1mg 1000元；杂交试剂如Formamide、饱和核酸、Denhardt Solution约3000元；X光片100张1600元；同位素实验室使用1000元)，这些计算还是建立在一切顺利，没有重复的基础上的。另外，由于需要对多达300块的平板进行操作，人员工作量也是相当惊人，并且各道工序均需衔接，如LB平板适用时间为制备后的2-5天内，同位素有到货周期，标记后需在7天内使用，单克隆平板制备后需在7天内得到肯定结果用于下一步使用，X光片的冲洗与曝光条件需在两天内建立，每人同时操作的平板数不能大于10块，否则精力分散，操作不佳，每块平板之间需要准确的标记与定位。另外由于筛选的阳性比率低，筛选的量大，尚存在这样的问题没有准确的阳性克隆比对，不容易辨别假阳性杂交点；很多块平板上为全阴性，容易丧失信心，考虑为文库中缺少该基因的存在；平板多，控制的重复性有难度。总计算来，杂交膜筛选文库法需要高投入约5-10万元，长周期约6-12个月，有经验的工作人员，只适合大实验室使用。
本发明的目的在于设计一种简便快速的能筛选到ApoAI可表达全基因的方法。
本发明提供了一种用PCR技术从人类全基因组Cosmid库中筛选ApoAI可表达全基因的方法，该方法包括下列步骤1.PCR扩增部分片断作为阳性指标，逐级稀释文库独立克隆数，从Cosmid库中快速筛选含有完全调控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技术方法Cosmid库从Clontech公司购买的基因组文库，DNA来源32岁的Caucasian胎盘，载体pWE15，独立克隆数1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入长度35-50kb，平均插入长度38kb；Cosmid库的第一级稀释独立克隆1)取10μl原始Cosmid库的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数Cosmid库的菌液浓度为108/ml；2)取10μl原始Cosmid库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取100μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为105/ml；4)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第3步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为103，分布孔的范围为A1-H12；5)放入37℃培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为103；PCR扩增片断设计根据可查得的部分序列，设计为三段扩增，其引物序列分别为第一段，ApoA1-300bp-+50bp片断，引物上游5’GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3’下游5’ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3’表征ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片断，引物上游5’GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3’下游5’CCTTG CGAGC CACTG ATGC3’，表征ApoA1可表达部分的尾部序列，10.5kb片断的中间部分；第三段ApoA IV的promoter区域，引物上游5’CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3’下游5’TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3’进一步验证ApoA1可表达基因10.5kb被囊括其中；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl 终浓度1X2mM dNTP10μl 终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min
共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下观察电泳条带。
条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带。初步说明为所需要筛选的阳性克隆，实际筛选获得8个孔的亚库具有阳性反应，取其中1个阳性孔进行下一步操作；Cosmid库的第二级稀释独立克隆1)取10μl经筛选为阳性的第一级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度为108/ml。
2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml。
3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml。
4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml。
5)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第4步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为101，分布孔的范围为A1-H12。
5)放入37℃培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为101；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选第二级阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别同第一级亚库筛选，根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带。有此条带，初步说明为所需要筛选的阳性克隆。实际筛选获得28个孔的亚库具有阳性反应，此时亚库的独立克隆数为101，对于其中一个亚库进行单克隆细菌平板制备分析；Cosmid库单克隆细菌平板制备1)取10μl经筛选为阳性的第二级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度平均为108/ml；
2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml；4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml；5)取100μl前述103/ml稀释菌液，铺于10cm细菌培养平板上，LB培养基，1.5％琼脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培养约16小时，待菌落长至平均1mm直径，平均各板上可以长到50-100个克隆；6)以灭菌牙签，挑单克隆菌落的一半于底物处理液中，用于PCR反应。将板上克隆与PCR反应管，底物处理管对应编号，根据PCR反应结果，寻找板上克隆，进行细菌培养扩增，每组筛选共挑选50个单克隆；PCR扩增Cosmid平板单克隆，鉴别筛选目标菌落底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加灭菌牙签挑的一半克隆，混匀100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid库单克隆平板上的其它50个单菌落均作同样的处理；PCR反应条件一在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件二在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第二段序列上下游引物各5μl终浓度50pmol已处理底物2μl105菌DNA当量Taq酶 1μl终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件三在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第三段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带。有此条带，初步说明该克隆为所需要筛选的阳性克隆以及该克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第二段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的100bp
条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得500bp左右的条带。有此条带说明该克隆包含所需要筛选片断的8106-8648bp部分序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第三段序列进行PCR扩增时没有条带，阳性克隆可扩增出1.1kb的片断，说明该克隆已经包含了ApoAIV的基因调控区，整个ApoA1的10.5kb调控区均含在克隆区中。实际筛选获得1个单克隆菌落3段PCR引物序列扩增均得到目标条带；部分序列分析鉴定阳性克隆PCR反应产生目标阳性条带在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol(或第二段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol)已处理目的克隆制备底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别分离目标条带电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下观察电泳条带。
第一段序列扩增的目标阳性条带为400bp；第二段序列扩增的目标阳性条带为500bp左右；对照分子量标准，取下相应的条带所在的琼脂糖胶块；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃
1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘；2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)；3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟；4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；5)洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；6)洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管；7)DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA；目标条带克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×Rapid Ligation Buffer5μlpGEM-T Easy Vector(50ng)1μlPCR product(胶回收产物) 3μlT4 DNA Ligase(3U/μl) 1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜；细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目标条带的T载体(pGEM-T/apo)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟；42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管；管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟；5000g离心30秒，吸去上清约800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)；次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时；质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体；加入100μl SI ，漩涡振荡后完全重悬菌体；加入200μl SII，颠倒Eppendorf管4次；加入150μl SIII，12000g离心10分钟；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml。
③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml。
将上清移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟；小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟；弃上清，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟；用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒；酶切鉴定克隆质粒于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O6μl10×缓冲液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl质粒DNA10μl总体积20μl，离心混合。
37℃水浴1-1.5小时。
Agarose凝胶电泳，可见相应大小的目标片段；目标条带测序分析将PCR扩增获得的目标片断纯化后克隆入的T/A载体，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司测定，两段序列均与预期序列一致，结果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用胶块回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作为引物测序，故图谱上显示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下划线部分为设计的引物序列，其它引物之间的部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致。
所有能查到的文献资料显示，目前研究人员还没有用由本方法筛选到的ApoAI可表达全基因制作ApoAI转基因动物。本发明在国际上首次将PCR有效扩增ApoAI的部分序列作阳性指标，应用Pool Dilution方法从Cosmid库中筛选到的人ApoAI可表达全基因作ApoAI转基因动物。
由于PCR方法进展，利用已知的一段序列设计引物，对一定稀释度的库作鉴定的方式进行筛选的方法被建立。此法主要在于PCR的灵敏度足够从106的背景中鉴别出阳性序列的存在，以及每次筛选只需在102的数量级上进行，因此可以提高工作效率与准确性。具体操作为计算所需克隆数同杂交膜筛选文库法，根据文库的克隆片断的能力，以及所需基因物种的基因组大小，计算2-6倍完全覆盖率所需的最小的克隆数，以Cosmid库与人基因组对比，1倍覆盖率所需的克隆数为6×104，2-6倍则需要1.2×105-3.6×105克隆数，以所需的克隆数制备小两个数量级的独立克隆的亚库，总共制备100个这样的亚库，培养于96孔板上。如文库中含有所需的目的基因，由于每孔亚库使用2μl的菌液，滴度有105，计算菌内Cosmid的拷贝数，对于独立克隆数为103的亚库，每个目的基因在PCR底物中都有103个拷贝，足够PCR检测的灵敏度；第一轮筛选100个降2次方克隆数的亚库，至少可以获得1个阳性亚库；以该阳性亚库同样作降2次方的亚亚库(对原文库而言为降4次方)，由于该阳性亚库PCR检测为阳性，因此其100个亚亚库中必有一个阳性；对于原始105的文库，通过两次独立克隆数降级，筛选获得的阳性亚亚库独立克隆数为10的量级，进一步筛选，制备平板单克隆，只需1块10cm的平板即可，对于该平板上的单克隆筛选，也可以继续采用PCR筛选或是传统的杂交膜筛选法。根据这种方法，与杂交膜筛选法对比，具有试剂消耗少，总计约300个PCR反应，600元，平板、LB培养基等约100元，总消耗约2000元，显著低于杂交膜筛选法的粗略概算26300元；人员工作量小，100个PCR反应基本可以同时进行，3个月可以获得阳性结果；难度小，由于每次反应中均肯定有阳性结果，对筛选过程有信心；不涉及到同位素操作，对环境影响小；各道工序间依赖性小，容易安排。
本方法尚注意了以下几点1.由于PCR不能扩增5kb以上序列，对目标基因筛选设立多个PCR扩增引物对，以保证需筛选的目标基因全长均落在范围内，同时多对PCR扩增引物的联合使用提高了检测的准确性；2.对筛选出的目标基因，根据所用PCR引物对扩增相应片断作序列测定，进一步验证目标基因的准确性；3. 96孔板上分解亚库后，37℃继续培养16小时，使其克隆数恢复，增加各独立克隆的拷贝数，利于PCR检测；4.使用了菌液的快速裂解制备PCR底物的流程，使得准备PCR反应的时间从需要制备Cosmid粗DNA开始的1天时间缩短为1小时。
因此本方法相对于现有的获取基因的方法，具有以下的优越性高准确性，完整性(相对于PCR直接扩增基因法)、消耗小、筛选速度快、对人员要求低(相对于杂交膜筛选文库法)。
图1，第一段引物的阳性扩增结果左侧为DL2000分子量标准，条带依次为100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右侧为预计的380bp长度扩增条带，其中250bp的条带为pWE15的背景扩增条带。该段序列的有效扩增表征目的基因的头部在克隆中。(见图4)图2，第二段引物的阳性扩增结果左侧为DL2000分子量标准，条带依次为100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右侧为预计的500bp长度扩增条带，其中100bp的条带为pWE15的背景扩增条带。该段序列的有效扩增表征目的基因的中部在克隆中。(见图4)图3，第三段引物的阳性扩增结果左侧为DL2000分子量标准，条带依次为100bp，250bp，500bp，750bo，1.0kb，2.0kb右侧为1.1 kb Apo AIV promoter的VNTR序列，该段序列的有效扩增表征目的基因的尾部在克隆中。(见图4)图4，筛选Apo A1全基因的示意图A为Apo A1-300bp-+50bp扩增序列，即设计的第一段扩增引物；B为8106bp-8648bp扩增序列，即设计的第二段扩增引物；C为Apo AIV的promoter VNTR序列，可扩增出1.1kb片段，即设计的第三段扩增引物。
实施例1.PCR扩增部分片断作为阳性指标，逐级稀释文库独立克隆数，从Cosmid库中快速筛选含有完全调控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技术方法Cosmid库从Clontech公司购买的基因组文库，DNA来源32岁的Caucasian胎盘，载体pWE15，独立克隆数1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入长度35-50kb，平均插入长度38kb；Cosmid库的第一级稀释独立克隆1)取10μl原始Cosmid库的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数Cosmid库的菌液浓度为108/ml；2)取10μl原始Cosmid库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取100μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为105/ml；4)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第3步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为103，分布孔的范围为A1-H12；5)放入37C培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为103；PCR扩增片断设计根据可查得的部分序列，设计为三段扩增，其引物序列分别为第一段，ApoA1-300bp-+50bp片断，引物上游5’GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3’下游5’ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3’表征ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片断，引物上游5’GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3’下游5’CCTTG CGAGC CACTG ATGC3’，表征ApoA1可表达部分的尾部序列，10.5kb片断的中间部分；第三段ApoA IV的promoter区域，引物上游5’CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3’下游5’TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3’进一步验证ApoA1可表达基因10.5kb被囊括其中；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl
混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下观察电泳条带。
条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带。初步说明为所需要筛选的阳性克隆，实际筛选获得8个孔的亚库具有阳性反应，取其中1个阳性孔进行下一步操作；Cosmid库的第二级稀释独立克隆1)取10μl经筛选为阳性的第一级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度为108/ml。
2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml。
3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml。
4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml。
5)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第4步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为101，分布孔的范围为A1-H12。
5)放入37℃培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为101；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选第二级阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别同第一级亚库筛选，根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带。有此条带，初步说明为所需要筛选的阳性克隆。实际筛选获得28个孔的亚库具有阳性反应，此时亚库的独立克隆数为101，对于其中一个亚库进行单克隆细菌平板制备分析；Cosmid库单克隆细菌平板制备1)取10μl经筛选为阳性的第二级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度平均为108/ml；2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml；4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml；5)取100μl前述103/ml稀释菌液，铺于10cm细菌培养平板上，LB培养基，1.5％琼脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培养约16小时，待菌落长至平均1mm直径，平均各板上可以长到50-100个克隆；6)以灭菌牙签，挑单克隆菌落的一半于底物处理液中，用于PCR反应。将板上克隆与PCR反应管，底物处理管对应编号，根据PCR反应结果，寻找板上克隆，进行细菌培养扩增，每组筛选共挑选50个单克隆；PCR扩增Cosmid平板单克隆，鉴别筛选目标菌落底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加灭菌牙签挑的一半克隆，混匀100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid库单克隆平板上的其它50个单菌落均作同样的处理；PCR反应条件一在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件二在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP10μl终浓度0.2mM第二段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件三在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP10μl终浓度0.2mM第三段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp
条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带。有此条带，初步说明该克隆为所需要筛选的阳性克隆以及该克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第二段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的100bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得500bp左右的条带。有此条带说明该克隆包含所需要筛选片断的8106-8648bp部分序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第三段序列进行PCR扩增时没有条带，阳性克隆可扩增出1.1kb的片断，说明该克隆已经包含了ApoAIV的基因调控区，整个ApoA1的10.5kb调控区均含在克隆区中。实际筛选获得1个单克隆菌落3段PCR引物序列扩增均得到目标条带；部分序列分析鉴定阳性克隆PCR反应产生目标阳性条带在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP 10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol(或第二段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol)已处理目的克隆制备底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶1μl 终浓度2μl去离子水 72μl补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别分离目标条带电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb。
紫外310nm下观察电泳条带。
第一段序列扩增的目标阳性条带为400bp；第二段序列扩增的目标阳性条带为500bp左右；对照分子量标准，取下相应的条带所在的琼脂糖胶块；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘；2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel.Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)；3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟；4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；5)洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；6)洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管；7)DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA；目标条带克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×Rapid Ligation Buffer5μlpGEM-T Easy Vector(50ng)1μlPCR product(胶回收产物) 3μlT4 DNA Ligase(3U/μl) 1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜；细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目标条带的T载体(pGEM-T/apo)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟；42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管；管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟；5000g离心30秒，吸去上清约800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)；次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时；质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体；加入100μlSI，漩涡振荡后完全重悬菌体；加入200μlSII，颠倒Eppendorf管4次；加入150μlSIII，12000g离心10分钟；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制200ml。
②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml。
③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml。
将上清移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟；小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟；弃上清，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟；用50μlTER(PH7.4)(50μlTE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒；酶切鉴定克隆质粒于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O6μl10×缓冲液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各1μl质粒DNA10μl总体积20μl，离心混合。
总体积20μl，离心混合。
37℃水浴1-1.5小时。
Agarose凝胶电泳，可见相应大小的目标片段；目标条带测序分析将PCR扩增获得的目标片断纯化后克隆入的T/A载体，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司测定，两段序列均与预期序列一致，结果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用胶块回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作为引物测序，故图谱上显示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下划线部分为设计的引物序列，其它引物之间的部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致。
权利要求
1.一种用PCR技术从人类全基因组Cosmid库中筛选ApoAI表达全基因的方法，该方法包括下列步骤1.PCR扩增部分片断作为阳性指标，逐级稀释文库独立克隆数，从Cosmid库中快速筛选含有完全调控序列的ApoA1 10.5kb基因以及其它APO家族基因的技术方法Cosmid库从Clontech公司购买的基因组文库，DNA来源32岁的Caucasian胎盘，载体pWE15，独立克隆数1.1×106，滴度108/ml，宿主菌NM538，插入长度35-50kb，平均插入长度38kb；Cosmid库的第一级稀释独立克隆1)取10μl原始Cosmid库的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数Cosmid库的菌液浓度为108/ml；2)取10μl原始Cosmid库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取100μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为105/ml；4)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第3步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为103，分布孔的范围为A1-H12；5)放入37℃培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为103；PCR扩增片断设计根据可查得的部分序列，设计为三段扩增，其引物序列分别为第一段，ApoA1-300bp-+50bp片断，引物上游5’GACTC GAGAG GGGAA GGGGA TGAGT G3’下游5’ATAGA TCTCC TGAAC CTTGA GCTGG G3’表征ApoA1的起始部分；第二段，8106bp-8648bp片断，引物上游5’GAGGG CATTA CCTGG AGCAG3’下游5’CCTTG CGAGC CACTG ATGC3’，表征ApoA1可表达部分的尾部序列，10.5kb片断的中间部分；第三段ApoA IV的promoter区域，引物上游5’CCTCT ATTAG CGATC CATTC CTG3’下游5’TGCTG TGTGA ATGGT TGTTA ACTG3’进一步验证ApoA1可表达基因10.5kb被囊括其中；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl 终浓度1X2mM dNTP10μl 终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下观察电泳条带，条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带。初步说明为所需要筛选的阳性克隆，实际筛选获得8个孔的亚库具有阳性反应，取其中1个阳性孔进行下一步操作；Cosmid库的第二级稀释独立克隆1)取10μl经筛选为阳性的第一级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度为108/ml，2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml，3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml，4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml，5)准备1块无菌的96孔细胞培养板，每孔中加入200μl新鲜配制的无菌LB培养基，加入100μg/ml浓度的氨苄青霉素，另外每孔分别加入第4步所获得的稀释菌液10μl，此时每孔的Cosmid菌的总密度为101，分布孔的范围为A1-H12，5)放入37℃培养箱培养16hr，此时每孔中菌液浓度约为108/ml，独立克隆数仍为101；PCR扩增Cosmid亚库，鉴别筛选第二级阳性亚库底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加2μl前述制备的Cosmid稀释克隆菌液，100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid稀释克隆菌板上的96个孔的每一个孔的菌均作同样的处理；PCR反应条件在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl终浓度1X2mM dNTP10μl终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb；紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别同第一级亚库筛选，根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带。有此条带，初步说明为所需要筛选的阳性克隆。实际筛选获得28个孔的亚库具有阳性反应，此时亚库的独立克隆数为101，对于其中一个亚库进行单克隆细菌平板制备分析；Cosmid库单克隆细菌平板制备1)取10μl经筛选为阳性的第二级稀释Cosmid亚库中阳性孔的菌液，在100倍显微镜下，使用相差方式，以及医用血球计数板，直接计数其菌液浓度平均为108/ml；2)取10μl目标Cosmid亚库的菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为106/ml；3)取10μl前述稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为104/ml；4)取100μl前述104/ml稀释菌液，加入1ml新鲜配制的无菌LB培养基，混合均匀，此时稀释菌液的浓度为103/ml；5)取100μl前述103/ml稀释菌液，铺于10cm细菌培养平板上，LB培养基，1.5％琼脂糖，100μg/ml Amphicillin，37℃培养约16小时，待菌落长至平均1mm直径，平均各板上可以长到50-100个克隆；6)以灭菌牙签，挑单克隆菌落的一半于底物处理液中，用于PCR反应。将板上克隆与PCR反应管，底物处理管对应编号，根据PCR反应结果，寻找板上克隆，进行细菌培养扩增，每组筛选共挑选50个单克隆；PCR扩增Cosmid平板单克隆，鉴别筛选目标菌落底物的快速处理以1X PCR Buffer 50μl加灭菌牙签挑的一半克隆，混匀100℃煮沸10min，10000g离心2min，取上清2μl，加入PCR反应液中，作为底物，对于Cosmid库单克隆平板上的其它50个单菌落均作同样的处理PCR反应条件一在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl 终浓度1X2mM dNTP 10μl 终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物2μl 105菌DNA当量Taq酶1μl 终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件二在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer10μl 终浓度1X2mM dNTP 10μl 终浓度0.2mM第二段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol已处理底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理PCR反应条件三在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl 终浓度1X2mM dNTP 10μl 终浓度0.2mM第三段序列上下游引物各 5μl终浓度50pmol已处理底物2μl105菌DNA当量Taq酶1μl终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别阳性克隆电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下观察电泳条带；条带鉴别根据条带的有效位置及长度判断扩增的阳性情况，作为Cosmid载体的pWE15使用第一段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的250bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得400bp左右的条带，有此条带，初步说明该克隆为所需要筛选的阳性克隆以及该克隆包含所需要的ApoA1-300起始的序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第二段序列进行PCR扩增时可以获得可重复的100bp条带，该条带为背景条带，可以剔除，目标序列扩增可以获得500bp左右的条带，有此条带说明该克隆包含所需要筛选片断的8106-8648bp部分序列；作为Cosmid载体的pWE15使用第三段序列进行PCR扩增时没有条带，阳性克隆可扩增出1.1kb的片断，说明该克隆已经包含了ApoAIV的基因调控区，整个ApoA1的10.5kb调控区均含在克隆区中，实际筛选获得1个单克隆菌落3段PCR引物序列扩增均得到目标条带；部分序列分析鉴定阳性克隆PCR反应产生目标阳性条带在0.5ml离心管中准备下列试剂10X PCR Buffer 10μl 终浓度1X2mM dNTP 10μl 终浓度0.2mM第一段序列上下游引物各 5μl 终浓度50pmol(或第二段序列上下游引物各5μl 终浓度50pmol)已处理目的克隆制备底物 2μl 105菌DNA当量Taq酶 1μl 终浓度2μl去离子水 72μl 补齐反应体积为100μl混匀后，加50μl石蜡油，放入PCR仪，运行参数为91℃ 1min60℃ 1min72℃ 1min共30个循环，最后72℃延伸5min，4℃保温待处理1％琼脂糖-TAE凝胶电泳鉴别分离目标条带电泳条件10V/cm 30min上样量PCR反应液10μl，加2μl 5X上样缓冲液分子量标准使用TaKaRa公司的DL2000，条带大小分别为100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，紫外310nm下观察电泳条带，第一段序列扩增的目标阳性条带为400bp；第二段序列扩增的目标阳性条带为500bp左右；对照分子量标准，取下相应的条带所在的琼脂糖胶块；Agarose DNA快速回收(Gibco BRL，Concert Gel ExtractionSystem)准备a.50℃水浴装置b.预热TE缓冲液至65-70℃1)切胶以洁净、锋利刀片切下含DNA片段的Agarose胶，修净边缘；2)称重胶浓度小于2％，重量小于400mg者，装入1.5ml Eppendorf管中，每10mg胶加入30ml L1(Gel. Solubilization Buffer，见Gibco公司操作手册)；3)溶解50℃水浴15分钟以上，每隔3分钟混匀一次，溶解后继续水浴5分钟；4)装柱取一洗脱柱放入一2ml洗涤管中，把“3”中的混和物倒入洗脱柱中，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；5)洗涤(可选)洗脱柱放回2ml洗涤管中，加500μl L1，室温放置1分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体；6)洗涤洗脱柱放回2ml洗涤管中，加700μl L2(Wash Buffer，含乙醇，见Gibco公司操作手册)，室温放置5分钟，离心12000g 1分钟，弃去洗涤管中液体，重复离心1分钟，弃去洗涤管；7)DNA回收把洗脱柱放入一新的1.5ml Eppendorf管中，加入50μl预热的TE缓冲液，室温放置1分钟，离心12000g 2分钟，可得回收DNA；目标条带克隆入pGEM-T Easy Vectors(Promega公司)在一新的0.5ml Eppendorf管中先后加入如下试剂2×Rapid Ligation Buffer 5μlpGEM-T Easy Vector(50ng) 1μlPCR product(胶回收产物) 3μlT4 DNA Ligase(3 U/μl) 1μl总体积10μl，4℃连接反应过夜；细菌转化取JM109感受态菌200μl于Eppendorf管中加入上述已连接了目标条带的T载体(pGEM-T/apo)4μl，轻轻混匀，放置冰上30分钟；42℃水浴，热休克90秒，不摇动试管；管中加入无抗生素之LB培养基800μl，37℃温和摇动(150rpm)45分钟；5000g离心30秒，吸去上清约800μl，加入X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly--D-galactopyranoside)IPTG(isopropyl-β-thiogalactopyranoside)(Promega)混匀后，用无菌涂布器将菌液全部铺于含氨苄青霉素的琼脂平板表面，37℃平放20分钟后倒置培养10-14小时(过夜)；次日挑取白色菌落接种于3ml含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃摇床摇菌(180rpm)12小时；质粒提取取菌液，加入至Eppendorf管中，4℃ 4000g离心10分钟，弃上清，倒置试管，滴尽残存液体；加入100μl SI，漩涡振荡后完全重悬菌体；加入200μl SII，颠倒Eppendorf管4次；加入150μl SIII，12000g离心10分钟；附①SI50mm葡萄糖，25mmol Tris-Hcl(pH8.0)，10mmolEDTA(pH8.0)，配制 200ml，②SII0.2mol NaOH，1％SDS，配制100ml，③SIII5mol乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，双蒸去离子水28.5ml。将上清移到另一Eppendorf管中，加入等体积(450μl)苯酚氯仿异戊醇，混匀后，12000g离心10分钟；小心吸取上层水相，加入冰无水乙醇，混匀后-70℃放置30分钟，12000g离心15分钟；弃上清，加500μl冷75％乙醇轻洗管壁，10000g 5分钟，弃尽上清，37℃静置干燥10分钟；用50μlTER(PH7.4)(50μl TE pH8.0，RNaseA 10mg/ml，5μl)溶解质粒；酶切鉴定克隆质粒于一新Eppendorf(EP)管中依次加入以下反应物及试剂ddH2O 6μl10×缓冲液 2μl限制酶(Bgl II及Xho I)各 1μl质粒DNA 10μl总体积20μl，离心混合，37℃水浴1-1.5小时，Agarose凝胶电泳，可见相应大小的目标片段；目标条带测序分析将PCR扩增获得的目标片断纯化后克隆入的T/A载体，以T7 promter作序列分析引物，交上海生工(Sangon)公司测定，两段序列均与预期序列一致，结果如下第一段序列01 TGANNCCNTGGGATACCCCGANCCCACCCGGGAGACCTGCAAGCCTGCAGACACTCCCCT61 CCCGCCCCCACTGAACCCTTGACCCCTGCCCTGCAGCCCCCGCAGCTTGCTGTTTGCCCA121 CTCTATTTGCCCAGCCCCAGGGACAGAGCTGATCCTTGAACTCTTAAGTTCCACATTGCC181 AGGACCAGTGAGCAGCAACAGGGCCGGGGCTGGGCTTATCAGCCTCCCAGCCCAGACCCT241 GGCTGCAGACATAAATAGGCCCTGCAAGAGCTGGCTGCTTAGAGACTGCGAGAAGGAGGT301 GCGTCCTGCTGCCTGCCCCGGTCACTCTGGCTCCCCAGCTCAAGGTTCAGGAGATCTATA第一段序列使用胶块回收DNA直接以ApoA1-300起始的PCR第一段序列作为引物测序，故图谱上显示出第一段序列的反向引物序列，其它部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致；第二段序列GCCGCGGGAATTCGATTGAGGGCATTACCTGGAGCAGCTGCCTCTAGGGATGAACTGAGCAGACAGGCAGGAGGGTTCTGACCTGTTTTATATCATCTCCAGGGCAGCAGGCACTGAGGACCCAGGGCGCTGGGCAAAGGTCACCTGCTGACCAGTGGAGATGAGGGCCTGAGGCAGGGTGTCCAGATGCAGCAAGCGGGCGGGAGAGTTGGGAAATCCCTAGGAGACTGAGTCCACGCTGCTGTCCCGCCAGCCCTGCAGCCCAGATGAGCTCAGGAACTGGGGGTGGGCCTGGGGAGCCTCATTCCTTCCTAGCTGACTGGCTCCCCAGGGAGAGGCTGGTGAGAGGGGAAATGGCTTGGACATAGGCCAGCGCTCGGGCCCATCTCAGCCTTTCACACTGGAATTTCAGGCCCCTCCCTCCACCAGCCCCAAGCCCTGAACACAGCCTGGAGTAGAGGGGTGAGGGGCTTCTTCAGACTTGAGAACAAGTGGGTGGCTTGGGCTGGGGGGTGTTTGGAGTAAAGGCACAGAAGACCGGGCATCAGTGGCTCGCAAGGCCTGGGCATAGCTTGAYGTATTTTATAGTGTCACCTAAATAGCTTNGGCGTAATNATGGCCATAAGCTGNTTTCCTTGNGGNGNAAATTGNTNTTTCCGCTTCACAAATTCCNCACAAACAATACCAAGCCCGGAAGCANTAAAGGNGGGAAAAGNCCTGGGGGGGGCCTAAATGGAGGGGAGCCTTAACCTCNCNATTTAATTTGNGTTTGGCGCTTCNCTTGGCCCCCNT下划线部分为设计的引物序列，其它引物之间的部分序列与GenBank中编号[gi178765]的对应片断完全一致。
全文摘要
本发明提供了一种用PCR技术从人类全基因组Cosmid库中筛选ApoAI可表达全基因的方法。本发明首次将PCR有效扩增ApoAI的部分序列作阳性指标,应用PoolDilution方法从Cosmid库中筛选到的人ApoAI可表达全基因作ApoAI转基因动物。
文档编号C12Q1/68GK1355321SQ0012751
公开日2002年6月26日 申请日期2000年11月24日 优先权日2000年11月24日
发明者龚邦强, 周晓明, 戚春婷, 张嗣良 申请人:上海医药(集团)总公司