专利名称：一种快速有序的基因表达差异显示法的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种新的系统地比较基因表达差异，寻找不同组织或同一组织不同发育时期或不同环境中差异表达的基因和克隆差异基因的方法。
cDNA点阵是研究差异基因表达的一个有效的工具。然而，目前仍有成千上万的基因是未知的，尤其是在诸如脑之类的复杂器官中基因。例如，大脑是非常复杂的，在不同环境和不同时期，它有特异性的基因表达谱。此外，由于cDNA点阵费用昂贵，因此cDNA点阵目前还不适于大脑等复杂系统的研究。
众所周知的mRNA差异展示法是由Liang建立起来的用随机引物扩增cDNA的一种传统的DD-PCR(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71.)。该方法现已较少采用。
在DD-PCR基础上发展出的有序差异显示法(Ordered differential display，ODD)则不包括随机cDNA引物(Matz，M.，Usman，N.，Shagin，D，Bogdanova，E.andLukyanov，S.1997 Nucleic Acids Research，25，2541-542)。ODD方法展示的是cDNA poly(A)端酶切片段。ODD法基于两种技术原理抑制性PCR效应和接头特异延伸引物选择性扩增效应。ODD法测试所有可能的引物组合，从而可系统地研究基因表达谱。
ODD方法主要有六个步骤(1)双链cDNA的合成。双链cDNA可以从总RNA制备或由mRNA直接制得。
(2)双链cDNA用识别四碱基对并形成平末端的限制性核酸内切酶进行消化，如RsaI和AluI等。双链cDNA平均256个碱基就有一个此类酶的识别位点，双链cDNA的酶切片段一般在100-500bp之间，大部分片段为250bp左右。这样酶切片段经扩增后将适于用PAGE胶分析。
(3)双链cDNA片段与接头的连接。接头是由一长链(40bp左右)和一短链(12bp左右)组成，短链与长链3′端互补成平端。人工合成的长链和短链(及cDNA合成所使用的T引物)的5′端不带磷酸基团，所以接头仅长链的3′端与酶切片段具磷酸基团的5′端进行连接。
(4)第一轮PCR特异扩增双链cDNA。poly(A)端酶切连接片段。此轮PCR使用的引物对为与接头长链5′端互补的接头特异引物(Adaptor SpecificPrimer，简称为“ASP”，21bp左右)和下游锚定引物Tn-VN(V＝A、G或C；N＝A、G、C或T)。第一轮PCR中，基于抑制性PCR效应，双链cDNA两端连有接头长链的酶切片段形成锅柄结构，扩增受到抑制，所以体系中将只有双链cDNA poly(A)端酶切连接片段能呈指数扩增。
(5)第二轮选择性扩增PCR。此轮PCR使用的上游引物为与接头长链3′端序列互补的接头特异延伸引物(Adaptor Specific Primer Extention，简称为“ADE”，20bp左右)。此引物除与接头3′端序列互补外，还延伸四碱基，其中内侧两碱基与连接处酶切位点互补，外侧为两个选择性碱基NN(N＝A、G、C或T)。上游引物ADE-NN与下游Tn-VN锚定引物(Anchored Primer)配合使用可以有192种可能(16种ADE-NN和12种T-VN引物)。具体操作时，选择其中一种或几种组合，使用[γ-32P]末端标记所选定的ADE引物，选择性扩增cDNApoly(A)端酶切连接片段，降低cDNA酶切片段的复杂程度，提高PAGE胶展示的分辨率。
(6)PAGE胶电泳分析。放射自显影后，存储基因表达图谱。切割回收差异显示的条带，做进一步研究分析。
因此，ODD法展示的是3′EST(已表达序列标志)，因此不需要全长cDNA。然而，ODD法的缺点包括步骤仍较繁琐，需要多次洗涤，假阳性率较高。
因此，本领域迫切需要一种快速、有效地显示基因差异表达的方法。
本发明目的就是提供一种快速、有效地显示基因差异表达的方法。
在本发明的一方面，提供了一种显示基因表达水平有序差异的方法，它包括步骤(a)对mRNA，使用随机引物和配基标记的oligo(dT)引物，合成双链cDNA；
(b)用具有配体的涂层的反应容器吸附标有生物素的cDNA扩增产物，其中该配体与步骤(a)中配基特异性结合；(c)用限制性内切酶消化cDNA扩增产物，产生吸附于反应容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段；(d)洗脱除去未吸附的酶切片段；(e)将吸附于容器的3′端酶切片段与接头连接，形成连接产物，所述接头由长链和短链构成；(f)对连接产物进行第一轮PCR扩增，形成第一轮PCR扩增产物；(g)对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增，形成第二轮PCR扩增产物；(h)对第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分离。
较佳地，在步骤(f)中PCR扩增所用的程序TouchUp程序。
在一优选例中，在步骤(a)中，在合成了cDNA的第一链后，使用随机引物和配基标记的oligo(dT)引物，合成双链cDNA。
在一优选例中，在步骤(c)中，所述的限制性内切酶是识别四碱基的核酸内切酶。较佳地，所述的限制性内切酶选自下组RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
在一优选例中，步骤(h)中的凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳，从而获得3′EST离散图谱。
在一优选例中，消化、连接和扩增在同一反应容器中进行。
在说明书附图中，
图1是本发明RODD法的流程图。
图2是胚胎(19-20天)脑和躯体的3′ESTs的差异图谱。图谱展示了九种引物组合(AE-GC，AE-GA，AE-AC)和(T-VG，T-VC，T-VG)。R代表胎脑；O代表胚胎躯体。
图3显示了杂交分析结果。其中，图3A膜与胎脑探针杂交；图3B膜与胚胎躯体探针杂交。C6-C10为正负对照C9(约0.5pmol)是3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为正对照，C6-C8(各约20pmol)分别为随机引物、接头特异引物和T引物，C10为质粒pBSK(+)(约1pmol)。A1-A10，B1-B10和C1-C5(约0.5pmol)为回收扩增的3′ESTs。
图4显示了EST(AW055732)分布状况的RT-PCR法分析。泳道1-11各自代表胎脑、胚胎躯体、新生(小于一天)大鼠脑、新生(小于一天)大鼠躯体、以及成年大鼠的脑、心、肾、肌肉、肝、肺和胃。短片段为扩增的EST(AW055732)；长片段为3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的一段，作为对照。
图5是3′ESTs离散图谱。1和2泳道各自为胚胎(17-18)脑和躯体；3和4泳道分别为胚胎(19-20)脑和躯体；5和6泳道分别为新生鼠(小于1天)脑和躯体；7和8泳道分别为成年大鼠的脑和肝。
图6显示了RT-PCR分析EST(AW055739)的分布情况。1-11分别代表胎脑、胚胎躯体、新生鼠(小于1天)脑、新生鼠的躯体、成年大鼠的脑、心、肾、肌肉、肝、肺和胃。图中大片段为正对照(GAPDH)；小片段为EST(AW055739)。
图7是为PAGE胶基因差异表达图谱，数字1-9，13-19代表所获得的在脑中差异表达的片段。其中6、7、8、9、13、14、15、16为Asp-GC和T12-CA引物对组合产物；5、18为Asp-GC和T12-VG引物对组合产物；3、4、17、19为Asp-GC和T12-VA引物对组合产物；1、2为Asp-GC和T12-VC引物对组合产物。M为分子量标记。
图8是RT-PCR分析EST(AW055749)的分布情况。泳道1-11分别代表胎脑、胚胎躯体、新生鼠(小于1天)脑、新生鼠的躯体、成年大鼠的脑、心、肾、肌肉、肝、肺和胃。图中大片段为正对照(GAPDH)；小片段为EST(AW055749)。
本发明人经过广泛而深入的研究，发展了一种经济有效的方法来研究大脑或其他复杂系统中的基因表达情况，该方法被称为快速有序差异显示法(RapidOrdered differential display，RODD)。RODD法的改进之处主要涉及以下步骤首先，用随机引物和生物素标记的oligo(dT)引物来扩增双链cDNA，这个反应只需要很少量的总RNA(50-100ng)就可起始。其次，具有链霉菌抗生物素蛋白涂层的PCR薄壁管被用于从扩增混合物中分离3′EST，这大大简化了操作过程。因此，RODD法可特异而有效地展示3′EST。
定义如本文所用，“TouchUp程序”指在这样PCR反应程序，其中PCR反应各循环中退火温度逐渐上升。例如，一般从约40℃上升至约60℃。TouchUp程序是与已知的“TouchDown程序”相反，在“TouchDown程序”中，各循环中退火温度逐渐下降(例如，一般从约60℃上升至约40℃)。在TouchUp程序中，一般每2个循环之间退火温度增加约0.3-1℃，较佳地，增加约0.5-0.9℃，较佳地约0.6-0.8℃。
快速有序差异显示法(RODD)由有序差异显示法ODD法改进而来，并与基因表达指纹法(Ivanova N.and Belyavsky A.1995 Nucleic Acids Res.23，2954-958)一样，是一种展示3′ESTs的方法。因此，全长cDNA对RODD方法而言并非必需。
RODD的流程如
图1所示。
首先，从mRNA合成cDNA。通常，在cDNA第一链合成后，用PCR法合成双链cDNA，其中使用随机引物和配体(在
图1中以生物素为例)标记的oligo(dT)引物并不影响方法的有效性。因为这一步扩增，非常少的总RNA也能满足实验的需要。
其次，使用具有配体(在
图1中，以链亲和素(也称为“链霉菌抗生物素蛋白”)为例)的涂层的PCR薄壁管，从扩增混合物中亲和吸附生物素标记的双链cDNA片段。
再次，用限制性内切酶消化cDNA扩增产物，产生吸附于反应容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段。例如用RsaI或其它限制性核酸内切酶消化。合适的限制性内切酶是识别四碱基的核酸内切酶。例如，代表性的限制性内切酶包括(但并不限于)RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
然后，经洗脱(或洗脱)去除非生物素标记的酶切片段。
随后，仍吸附在管中生物素标记的3′ESTs再与接头连接。其中，所用的接头与本领域中用于ODD的接头类似。接头是由一长链(40bp左右，如30-50BP)和一短链(12bp左右，如10-16bp)组成，短链与长链3′端互补成平端。人工合成的长链和短链(及cDNA合成所使用的T引物)的5′端不带磷酸基团，所以接头仅长链的3′端与酶切片段具磷酸基团的5′端进行连接。该步骤与ODD法基本相同。
接着，对第一轮PCR扩增产物进行第二轮选择性扩增PCR。该步骤与ODD法相同。具体地，此轮PCR使用的上游引物为与接头长链3′端序列互补的接头特异延伸引物(Adaptor Specific Primer Extention，简称为“ADE”，20bp左右，例如15-25bp)。此引物除与接头3′端序列互补外，还延伸四碱基，其中内侧两碱基与连接处酶切位点互补，外侧为两个选择性碱基NN(N＝A、G、C或T)。上游引物ADE-NN与下游锚定引物Tn-VN(Anchored Primer)配合使用可以有192种可能(16种ADE-NN和12种T-VN引物)。具体操作时，选择其中一种或几种组合，使用[γ-32P]末端标记所选定的ADE引物，选择性扩增cDNA poly(A)端酶切连接片段，降低cDNA酶切片段的复杂程度，提高PAGE胶展示的分辨率。
经第二轮PCR的选择性扩增后，3′ESTs片段经例如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)后能清晰地得以展示。
为了进一步的克隆、测序和分析，差异显示的3′ESTs片段从胶上回收并用适用于所有ESTs片段的通用引物进行PCR扩增。
可用本发明方法显示表达差异的组织包括各种生物组织，包括动物和植物组织，例如脊椎动物、哺乳动物。例如，包括(但并不限于)动物各组织、人的正常组织、人的病理组织、人的不同生长期的组织。
可用于本发明的配基和配体并没有特别限制，只要它们能够形成特异性的结合。本领域已知的各种配基-配体组合都可用于本发明。例如，代表性的配基-配体组合包括(但并不限于)生物素和链亲和素，地高辛和特异性抗地高辛抗体、半抗原和特异性抗半抗原的抗体。较佳地，所述的配基是生物素，所述的配体的链亲和素。
本发明方法的优点之一是，消化、连接和扩增三个步骤可在一个反应管中完成，大大简化了操作步骤，同时也节省了时间和费用。
本发明方法的优点之二是，TouchUp程序和洗脱过程都可降低消化后的双链cDNA混合物的复杂性，从而提高RODD法的特异性。
本发明方法的优点之三是，本发明的假阳性率小于现有技术ODD的假阳性率小于30％，而RODD的假阳性率小于16％。
综上所述，证明了RODD是一种非常经济、快速、有效和特异的方法，适于在各种研究系统和领域中应用，如发育、分化、凋亡和病变等生理机理的研究。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1胚胎SD大鼠(19-20天)脑与身体的基因表达差异实验材料的获取成年SD大鼠(雌性，约250克)全脑、心、肝、肺和肾等组织器官的分离取头，沿头骨中缝剪开头骨，快速取出大脑并置于液氮待用；.取鼠躯体，开腹腔，取心、肝、肺和肾等组织器官，液氮冻存。SD胎鼠的全脑和躯体的获取将SD孕鼠乙醚麻醉，开腹腔，取出胎鼠(十余只)，置于Hanks/HEPES溶液里，在显微解剖台下，分离胎鼠中枢神经系统(脑&脊髓)和躯体，分别置于冻存管里液氮冻存。
总RNA的提取少量组织(≤50mg)总RNA的抽提详见上海Watson公司″组织/细胞总RNA抽提试剂盒″说明书；大量组织(1g左右)总RNA的抽提采用异硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F.and Smith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A Practical Approach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得总RNA置于-80℃冰箱保存。
双链cDNA的合成RT具体流程参见TaKaRa RNA PCR试剂盒；然后用随机引物(1pmol)和生物素标记的oligo(dT)引物(5pmol)合成双链cDNA。PCR程序94℃预变性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25个循环，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
双链cDNA的酶切及接头连接生物素标记的双链cDNA转移至具有链霉菌抗生物素蛋白涂层的PCR管中，37℃温育至少十分钟，然后用洗脱缓冲液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，纯化后用RsaI完全消化。
经洗脱去除非生物素标记的酶切产物，吸附在管中生物素标记的cDNA的3′末端的酶切产物与接头(20pmol)于16℃6小时，4℃16小时条件连接。接头是由长链和短链组成，长链的3′端与短链形成平端长链5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短链 3′-CGCCTCCCGCCA-5′连接产物的扩增扩增使用T锚定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接头特异的外侧引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃预变性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循环)20sec，72℃ 45sec(+1sec/循环)，28循环，72℃ 10min。
第二轮选择性PCR使用特定的T锚定引物和γ32p标记的接头特异的内侧延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)进行扩增。PCR程序94℃预变性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28个循环，72℃ 10min。
差异表达的EST片段的PAGE胶分析、扩增、克隆掺有同位素的选择性扩增产物用6％的变性PAGE电泳，X光片(Kodak)压片、洗片，分析结果，于胶上找出并切下脑与身体有差异表达条带，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室温静置10分钟，然后沸水煮10分钟，离心取上清液。有差异的条带使用适用于所有ESTs片段的通用引物(接头内侧特异引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二轮的条件进行扩增，并克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)。
反向杂交双链cDNA使用随机引物DNA标记试剂盒(Gibco BRL，美国)进行标记。而双链cDNA的合成使用10pmol的d(N)9随机引物，50pmol的T引物，1ng的cDNA第一链和0.5 U Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，德国)，终体积为20ml.。CR程序94℃预变性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃30sec，10个循环，72℃ 5min。
回收并扩增后的3′ESTs的样品，加NaOH(终浓度为0.2 mM)变性，点样在带正电荷的尼龙膜上，一式两份。然后，两张膜分别与胚胎(19-20天)脑和躯体的cDNA探针杂交。
在该实施例中，选择性扩增了九种接头延伸引物和锚定T-VN引物的组合，所得到的胚胎(19-20天)脑和躯体的3′ESTs图谱如图2。
从图2中，发现接头延伸引物AE-GC和AE-AC产生的条带要比引物AE-GA的条带多而且强。这一现象与前人的结论一致，其结论是那些以A或T为末端的引物在扩增中效率较低(Mou，L.，Miller，H.，Li，J.，Wang，E.，Chalifour，L.，1994Biochem.and Biophys.Res.Comm.，199，564-69)。这或许是所有使用PCR为手段的策略的共同弱点。
二十五个3′ESTs片段从胶上回收扩增后，一式两份地点在尼龙膜上，用反向杂交法验证(Mou，L.，Miller，H.，Li，J.，Wang，E.，Chalifour，L.，1994 Biochem.andBiophys.Res.Comm.，199，564-69)。结果如图3。其中图3A是膜与胎脑探针杂交；图3B是膜与胚胎躯体探针杂交。C6-C10为正负对照C9(约0.5pmol)是3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为正对照，C6-C8(各约20pmol)分别为随机引物、接头特异引物和T引物，C10为质粒pBSK(+)(约1pmol)。A1-A10，B1-B10和C1-C5(约0.5pmol)为回收扩增的3′ESTs。从图3A和3B的对比可以清楚地看出有十几个EST有表达差异。
对这些差异表达的EST测序。测序后，大鼠胎脑和躯体之间差异显示的十六个3′ESTs片段的序列登录并存放在GeneBank中(索引号为AW055727-AW055736和AW087141-AW087146)。
为进一步验证RODD方法的有效性，本发明人使用RT-PCR的方法对一个EST片段(AW055732)做了更深入的研究，结果如图4所示。EST(AW055732)在图2中用箭头标出，通过dbest库的搜索，发现其与小鼠和人类的rp58基因高度同源。＞gb|AF140224.1|AF140224 Mus musculus转录受体RP58(rp58)mRNA，全长＝4993分值＝196 bits(99)，预计值＝7e-49相同性＝111/115(96％)Query1gtacgaaactaaacagtattgtaagttattccccctcaggaaataaaacatactatgatt 60|||| ||||||||||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4883 gtacaaaactaaacagcattataagttattccccctcaggaaataaaacatactatgatt 4824Query61 gtcaaagctagatgtcagtctaagatttacaacaaaggaagaatgtgaaactaag 115||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct4823 gtcaaagctagatgtcagtctaagatttagaacaaaggaagaatgtgaaactaag 4769＞emb|AJ223321|H8AJ3321 Homo sapiens RP58基因全长＝5321分值＝174bits(88)，预计值＝3e-42相同性＝110/116(94％)，缺口＝1/116(0％)Query1gtacgaaactaaacagtattgtaagttattccccctcaggaaa-taaaacatactatgat 59|||| |||||||||| ||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct4808 gtacaaaactaaacagcattataagttattccccctcaggaaaataaaacatactatgat 4749Query60 tgtcaaagctagatgtcagtctaagatttacaacaaaggaagaatgtgaaactaag 115||||||||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct4748 tgtcaaagctagatgtcagtctaagttttagaacaaaggaagaatgtgaaactaag 4693图4所呈现的EST(AW055732)在各不同发育时期的脑和躯体中的表达情况，以及在成年大鼠不同组织中分布情况EST(AW055732)片段在不同发育时期的脑中均一高表达，而在成年大鼠中仅在心和肌肉中有微弱表达，这与文献所报导的相符(Aoki，K.，Meng，G.，Suzuki，K.，Takashi，T.，Kameoka，Y.，Nakahara，K.，Ishida，R.and Kasai，M.，1998，J.Biol.Chem.273，26698-6704.)。
综上所述，证明了RODD是一种非常经济、快速、有效和特异的方法，适于在各种研究系统和领域中应用，如发育、分化、凋亡和病变等生理机理的研究。结果还表明，本发明的假阳性率小于现有技术ODD的假阳性率小于30％，而RODD的假阳性率小于16％。
实施例2不同发育时期的大鼠的脑与身体的表达差异基因的研究实验材料的获取成年SD大鼠(雌性，约250克)全脑、心、肝、肺和肾等组织器官的分离取头，沿头骨中缝剪开头骨，快速取出大脑并置于液氮待用；.取鼠躯体，开腹腔，取心、肝、肺和肾等组织器官，液氮冻存。新生SD大鼠的全脑和躯体的获取将SD大鼠的新生鼠，置于Hanks/HEPES溶液里，在显微解剖台下，分离新生SD大鼠中枢神经系统(脑&脊髓)和躯体，分别置于冻存管里液氮冻存。SD胎鼠的全脑和躯体的获取将SD孕鼠乙醚麻醉，开腹腔，取出胎鼠(十余只)，置于Hanks/HEPES溶液里，分离胎鼠中枢神经系统(脑&脊髓)和躯体，于液氮冻存。
总RNA的提取少量组织(≤50mg)总RNA的抽提详见上海Watson公司″组织/细胞总RNA抽提试剂盒″说明书；大量组织(1g左右)总RNA的抽提采用异硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F.and Smith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A Practical Approach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得总RNA置于-80℃冰箱保存。
双链cDNA的合成RT具体流程参见TaKaRa RNA PCR试剂盒；然后用随机引物(1pmol)和生物素标记的oligo(dT)引物(5pmol)合成双链cDNA。PCR程序94℃预变性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25个循环，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
双链cDNA的酶切及接头连接生物素标记的双链cDNA转移至具有链霉菌抗生物素蛋白涂层的PCR管中，37℃温育至少十分钟，然后用洗脱缓冲液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，纯化后用RsaI完全消化。
经洗脱去除非生物素标记的酶切产物，吸附在管中生物素标记的cDNA的3′末端的酶切产物与接头(20pmol)于16℃ 6小时，4℃16小时条件连接。接头是由长链和短链组成，长链的3′端与短链形成平端长链5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短链 3′-CGCCTCCCGCCA-5′连接产物的扩增扩增使用T锚定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接头特异的外侧引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃预变性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循环)20sec，72℃ 45sec(+1sec/循环)，28循环，72℃ 10min。
第二轮选择性PCR使用特定的T锚定引物和γ32p标记的接头特异的内侧延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)进行扩增。PCR程序94℃预变性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28个循环，72℃ 10min。
差异表达的EST片段的PAGE胶分析、扩增、克隆掺有同位素的选择性扩增产物用6％的变性PAGE电泳，X光片(Kodak)压片、洗片，分析结果，于胶上找出并切下脑与身体有差异表达条带，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室温静置10分钟，然后沸水煮10分钟，离心取上清液。有差异的条带使用适用于所有ESTs片段的通用引物(接头内侧特异引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二轮的条件进行扩增，并克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)。
在该实施例中，研究了不同发育时期的大鼠的脑与身体的表达差异基因情况胚胎(17-18)脑和躯体、胚胎(19-20)脑和躯体、新生鼠(小于1天)脑和躯体、成年大鼠的脑和肝。3′ESTs离散图谱如图5所示。从图中可以清楚地看出显示出许多差异表达的基因。
为进一步验证RODD方法的有效性，使用RT-PCR的方法对一个EST片段(AW055739)做了更深入的研究(图6)。通过dbest库的搜索，我们发现EST(AW055739)与小鼠和人类的一种锌指蛋白高度同源。图6所呈现的EST(AW055739)在各不同发育时期的脑和躯体中的表达情况，以及在成年大鼠不同组织中分布情况，与PAGE胶所呈现的一致。EST(AW055739)片段在不同发育时期的脑中均一高表达，而在成年大鼠其它组织中低表达。
该实施例进一步证明了RODD是一种非常经济、快速、有效和特异的方法，适于在各种研究系统和领域中应用，如发育、分化、凋亡和病变等生理机理的研究。
实施例3成年大鼠脑与肝脏的基因表达差异实验材料的获取成年SD大鼠(雌性，约250克)全脑、心、肝、肺和肾等组织器官的分离取头，沿头骨中缝剪开头骨，快速取出大脑并置于液氮待用；.取鼠躯体，开腹腔，取心、肝、肺和肾等组织器官，液氮冻存。
总RNA的提取总RNA的抽提采用异硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F.andSmith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A PracticalApproach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得总RNA置于-80℃冰箱保存。
双链cDNA的合成RT具体流程参见TaKaRa RNA PCR试剂盒；然后用随机引物(1pmol)和生物素标记的oligo(dT)引物(5pmol)合成双链cDNA。PCR程序94℃预变性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25个循环，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
双链cDNA的酶切及接头连接生物素标记的双链cDNA转移至具有链霉菌抗生物素蛋白涂层的PCR管中，37℃温育至少十分钟，然后用洗脱缓冲液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，纯化后用RsaI完全消化。
经洗脱去除非生物素标记的酶切产物，吸附在管中生物素标记的cDNA的3′末端的酶切产物与接头(20pmol)于16℃6小时，4℃ 16小时条件连接。接头是由长链和短链组成，长链的3′端与短链形成平端长链5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短链 3′-CGCCTCCCGCCA-5′连接产物的扩增扩增使用T锚定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接头特异的外侧引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃预变性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循环)20sec，72℃ 45sec(+1sec/循环)，28循环，72℃ 10min。
第二轮选择性PCR使用特定的T锚定引物和γ32p标记的接头特异的内侧延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)进行扩增。PCR程序94℃预变性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28个循环，72℃ 10min。
差异表达的EST片段的PAGE胶分析、扩增、克隆掺有同位素的选择性扩增产物用6％的变性PAGE电泳，X光片(Kodak)压片、洗片，分析结果，于胶上找出并切下脑与身体有差异表达条带，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室温静置10分钟，然后沸水煮10分钟，离心取上清液。有差异的条带使用适用于所有ESTs片段的通用引物(接头内侧特异引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二轮的条件进行扩增，并克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)。
PAGE胶基因差异表达图谱如图7所示。在该实施例中，本发明人研究了Asp-GC和T12-CA、Asp-GC和T12-VG、Asp-GC和T12-VA、Asp-GC和T12-VC引物对组合。
EST片段(AW055749)的RT-PCR方法分析结果如图8所示。dbest库的搜索后，未发现EST(AW055749)的同源序列，说明EST(AW055749)是一个全新的EST片段。图8所呈现的EST(AW055749)在各不同发育时期的脑和躯体中的表达情况，以及在成年大鼠不同组织中分布情况EST(AW055749)片段在胚胎脑和成年大鼠的脑中高表达，在新生鼠(小于1天)脑和成年大鼠其它组织中低表达，而在不同时期的躯体未见表达。
该实施例进一步证明了RODD是一种非常经济、快速、有效和特异的方法，适于在各种研究系统和领域中应用，如发育、分化、凋亡和病变等生理机理的研究。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种显示基因表达水平有序差异的方法，其特征在于，它包括步骤(a)对mRNA，使用随机引物和配基标记的oligo(dT)引物，合成双链cDNA；(b)用具有配体的涂层的反应容器吸附标有生物素的cDNA扩增产物，其中该配体与步骤(a)中配基特异性结合；(c)用限制性内切酶消化cDNA扩增产物，产生吸附于反应容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段；(d)洗脱除去未吸附的酶切片段；(e)将吸附于容器的3′端酶切片段与接头连接，形成连接产物，所述接头由长链和短链构成；(f)对连接产物进行第一轮PCR扩增，形成第一轮PCR扩增产物；(g)对第一轮PCR扩增产物进行第二轮PCR扩增，形成第二轮PCR扩增产物；(h)对第二轮PCR扩增产物进行凝胶电泳分离。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(f)中PCR扩增所用的程序TouchUp程序。
3.如权利要求1所述所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，在合成了cDNA的第一链后，使用随机引物和配基标记的oligo(dT)引物，合成双链cDNA。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述的限制性内切酶是识别四碱基的核酸内切酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的限制性内切酶选自下组RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的mRNA来自下列组织动物各组织、人的正常组织、人的病理组织、人的不同生长期的组织。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的配基和配体选自下组生物素和链亲和素，地高辛和特异性抗地高辛抗体、半抗原和特异性抗半抗原的抗体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的配基是生物素，所述的配体的链亲和素。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(h)中的凝胶电泳为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，消化、连接和扩增在同一反应容器中进行。
全文摘要
本发明更快了一种经济、高效、快速的基因表达水平有序差异显示法。它主要用于系统地比较基因表达整体状况的差异,寻找差异基因。首先,双链cDNA的合成使用随机引物和配基标记的oligo(dT)引物;其次,具有配体涂层的薄壁管用于吸附标有配基的cDNA3′端酶切片段。吸附的双链cDNA酶切、洗脱后与接头连接。再经第一轮PCR扩增和第二轮选择性PCR扩增,从而获得清晰的3′ESTs离散图谱。
文档编号C12Q1/68GK1354259SQ0012749
公开日2002年6月19日 申请日期2000年11月22日 优先权日2000年11月22日
发明者李荣秀, 康建胜, 王志平 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心