专利名称：可快速检测的层析生物芯片技术的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物大分子快速检测芯片的检测技术，具体地说指游离DNA、mRNA或蛋白质分子在层析迁移过程中被固定的DNA探针或相应蛋白质探针俘获的分离检测方法。
传统技术中具有代表性的技术是Southern blot、Northern blot以及测序技术。这些技术均涉及到DNA或RNA抽提、纯化、酶解、电泳、转移、杂交等许多复杂操作。另一方面，这些技术均是一个操作一个检测的模式，效率较低。
生物学已经进入了基因组时代，美国人类基因组计划和中国人类基因组计划预计到2005年，即可获得人类完整的基因(十万个左右)序列。但是基因定位和序列的获得仅仅是这些基因的具体的解剖学定位，要认识这些基因组的生物学功能，则必需对基因组表达的组合模型进行动态研究。因此DNA芯片(基因芯片)技术在几年前便应运而生了。DNA芯片技术并非是将所有的人体基因绘制成图，而是找出人群之间、个体发育、疾病发展先后等基因之间的种种区别点，对独特的基因组合方式进行辨认。用现阶段所有分子生物学技术需要十年才能破译的遗传密码，则可以用少数DNA芯片在短时间内就可以达到。
DNA芯片技术是一种高度集成的DNA检测技术。首先采用专用自动化设备将几千甚至几万个已知DNA寡核苷酸探针或全序列基因探针排列在玻片或硅片上，然后将待检测样本中的所有DNA成分与芯片探针杂交，有相对应的靶DNA就会出现相应的杂交信号。理论上可以做到一次实验检测细胞或组织内所有基因或可以表达的基因。因此这种技术对胚胎发育控制的研究、疾病发生发展的研究、以及生理病理的研究提供了最佳的研究手段。1995年10月斯坦福大学第一篇成熟的DNA芯片检测技术发表在SCIENCE杂志上(Schena M，et alScience 1995，270467)，并成功地检测了酵母菌的全部cDNA，和1046个人类基因的检测(Schena M，et alProc Natl Acad USA 1996，9310 614-619)。1998年美国由NIH、NHGRI、NCBI、NCI、NINDS、BEIP、DCRT等国立研究所成立了DNA微芯片开发计划(μAP)(http//www.nhgri.nih.gov/dir/lcg/15k/html)，该项目拟利用DNA芯片技术进行mRNA表达模型的比较研究，其目标是开发一种含有所有mRNA表达基因的DNA芯片并进行定量研究。
但是这类高集成度芯片技术，仅以DNA芯片技术为例存在以下缺陷和不足1.需要专用的检测设备现有芯片技术都是采用高敏感性的荧光标记技术标记被检测的靶DNA分子，因此芯片的检测就需要昂贵的专用芯片激光扫描仪。
2.检测程序复杂，检测耗时太长现有DNA芯片检测技术只是将DNA探针集成固定进行逆向杂交而已，与传统的杂交技术相比，检测程序仍然复杂，需要经过培训的专业技术人员操作，一般至少需要2天的时间才能完成。而临床诊断项目的要求首先是快速和操作简便，一般性检查最好能在1～2小时内完成并出具报告。
3.检测成本太高由于芯片的制作程序复杂，一般需要采用特殊修饰的玻片，需要特殊点样设备和检测设备，致使芯片的成本居高不下。并且同时检测几百几千个功能上并不相关的基因并不是临床所需要的，临床上需要的是具有特殊针对型并能解决实际问题的检测项目，比如，了解肿瘤基因的表达情况、了解地中海贫血的珠蛋白基因的所有可能突变位点的状况等等。
其它的生物芯片尚在起步阶段。而蛋白芯片仅有少数几人，1999年美国的Mendoza.L.G等采用将抗体或抗原固定在96孔酶联反应板上，做ELISA，此方法与传统的ELISA相似，只是，用CCD扫描所获得结果。2000年德国的Lue king A(Hui Ge UPA，auniversal protein array system forquantitative detection of protein-protein，protein-DNA，protein-RNA and protein-lgard interactions Nucleic Acids Research.2000，28(2)e3I-vii)等人，美国的HuiGe(Avel Arentow，Alexander tukhtin，Gemmell A，et al.protein Micro chipsuse forquantifative detection of protein-protein，protein-DNA，protein-RNA and protein-ligand interactions.Nucleic Acids Reseach.2000，28*2)e3i-uii)将cDNA表达的蛋白固定在PVDF膜上(12×8cm)用特异的抗体筛选阳性蛋白，2000俄国的Pavel Arenlsov将抗体或抗原蛋白固定在100×100×2μm的聚丙烯酰胺胶上，通过凝胶电泳及抗原抗体结合反应，用CCD扫描结果。前几种方法操作较繁锁，抗体或抗原固定的面积较大，不易保存，携带，对快速检测有很多不方便。最近美国的Liny等，JiangG等人为了解决生物芯片所存在的共同缺点，检测信号敏感性低，重复性不是很好，而将蛋白固定的金片上，用生物传感器的方法检测信号结果，此方法虽然敏感，但检测信号仍较弱，而且需要特殊设备，且成本高。
这些问题使得生物芯片目前无法满足临床诊断的要求，无法推广应用。
本发明的目的是提供一种检测程序较简单，可快速进行DNA、mRNA或蛋白等生物大分子检测的芯片方法。
本发明还同时提供了实施该方法的快速检测生物芯片装置。
为了克服现有技术的不足和缺陷，本发明采取一种新的条形芯片设计和层析检测方法以达到本发明的目的本发明主要根据游离DNA、mRNA或蛋白质分子在层析迁移过程中被固定的DNA探针或相应蛋白质探针俘获的原理设计的。探针阵列固定于膜载体上，将第二探针及示踪标记物预置于该膜一端。用流动相带动样品沿膜载体展开，靶DNA、mRNA或蛋白质会被相应固定探针俘获，并在相应的条带位置呈现阳性检测信号，达到快速分离鉴定的目的。具体方法如下a.采用可以让液体自由扩散的薄膜作为探针固定的层析载体膜，固定探针排列在载体膜的中央检测区域，形成探针阵列；b.用于连接示踪标记物的第二探针和/或示踪标记物喷于或浸于蓄存纤维膜上，然后室温干燥保存。将蓄存纤维膜与载体膜粘贴或与压紧，以便层析时蓄存纤维膜内的物质可以被转移至载体膜上；载体膜与蓄存纤维膜可以以任何方式接触，包括正面、反面、包围和两片载体膜相夹的方式；c.含DNA、mRNA或蛋白质的样品加于载体膜，并与蓄存纤维膜同一端，液体流动相沿载体膜展开，样品靶物质先与第二探针及示踪标记物结合，并进一步向探针固定区域迁徙，当标记有示踪物的靶物质与固定探针配对时，便被俘获固定，在相应的条带位置呈现阳性检测信号；d.信号的加强、检测及分析。
固定探针包括DNA探针，cDNA探针、寡核苷酸探针、碱基或戊糖环被修饰过的RNA寡核苷酸探针和非DNA/RNA探针；非DNA/RNA探针包括蛋白质探针、糖蛋白探针和小分子激素探针；蛋白质探针包括抗原探针、抗体探针、受体探针和配体探针。
探针固定的载体膜包括硝酸纤维膜、PVDF膜、尼龙膜等带有阴离子或阳离子氨基集团的膜材料，或者是膜表面被修饰带有活性基团如醛基、巯基、羧基、羟基和酮基等基团的膜性材料。
蓄存纤维膜为亲水性和非吸附性介质，不与生物大分子活性物质反应或吸附，在有流动相流过时可以把预先蓄存的第二探针及示踪标记物通过层析的原理带走。可以采用商用玻璃纤维膜或聚脂纤维膜，以玻璃纤维膜更理想。玻璃纤维具有低吸附的特点，可以用于保存第二探针。玻璃纤维膜的厚度可选择在0.2-1.5mm左右。
探针的固定方法，可以由三维机器人完成精确的定位喷线、划线、喷点或点点，也可以由人工划线、点样完成；探针固定的格式可以是线状、点状、正方形及其他任何形状。实际应用时，点的大小一般从直径或边长50μm至5mm不等，线间或点间距离约为0.2～10mm。
流动相即通常层析时使用的溶剂。
检测所用的示踪标记物，可以是胶体金颗粒、胶体银颗粒、胶体金颗粒加银显影液复染、酶免疫标记物、荧光免疫标记物；胶体金颗粒主要由还原四氯金酸高亲和性结晶体，其颗粒大小为1nm到200nm。当胶体金颗粒加银显影液复染时，是指胶体金染色后再用银显影液复染，使金颗粒周围吸附很多银颗粒，呈现高灵敏度的金属银的黑颗粒。优选银还原信号增强法。
当用于mRNA检测时，可采用直接检测法和间接检测法。直接检测法是以cDNA为探针，巯基标记的Poly(dT)为第二探针，胶体金颗粒为示踪剂的直接检测mRNA的方法。间接检测法为基因外显子的寡核苷酸寡核苷酸片断为探针，巯基标记的Poly(dA)为第二探针，胶体金颗粒为示踪剂的间接检测cDNA的方法。第二探针寡核苷酸Poly(dT)或Poly(dA)，长度为6～200个碱基对；优选硫基标记的Poly(dT)或Poly(dA)。
当样品是基因组DNA时，以基因组DNA的寡核苷酸片断为探针，检测时先将基因组DNA分离、纯化、酶切或超声波破碎、生物素光学标记或PCR扩增标记，Streptavidin包裹的胶体金颗粒为示踪剂。
当样品是抗体时，以纯化的抗原或抗抗体为固定探针，以第二抗体、葡萄球菌蛋白A或蛋白G标记的胶体金颗粒作为示踪剂。
当样品是抗原时，以多克隆或单克隆抗体为固定探针，将被检测抗原直接进行生物素标记和Streptavidin包裹的胶体金颗粒为示踪剂；或以多克隆抗体为固定探针，以单克隆抗体为检测抗体，羊抗鼠第二抗体包被的胶体金颗粒作为示踪剂。
使用时载体膜可贴于有一定硬度的支持物上，并切割成适用的形状。制作时，可热压，还可采用类似于不干胶的粘合方法，将探针膜条粘贴于PVC膜上。
载体膜另一端还可与吸水纤维相连接，以保证流动相的持续展开。
应用上述检测方法的生物大分子快速检测芯片装置，在于该装置的核心部位是有固定探针阵列的膜载体2和与之配合的预存第二探针及示踪物的蓄存纤维膜6。具体地检测装置主要由载体膜2、蓄存纤维膜5、支持PVC底板8、支撑盒9、层析缓冲液6和吸水纤维7等部分组成。载体膜呈条状，一面粘贴在有一定硬度的PVC塑料板上，中央区域为探针固定区域，探针固定的数量依需要而定，在载体膜的一端的空白区域中间部分是蓄存纤维膜固定区域。蓄存纤维膜的由低吸附性的玻璃纤维材料制成，主要蓄存第二探针和胶体金等检测显示试剂，蓄存纤维膜的大小约为层析膜的1/20～1/10，膜的厚度在0.1mm至5mm之间，膜的厚度和大小主要依据蓄存量的大小而定。层析缓冲液包装于一密封小袋内，检测时刺破并与层析膜的固定有蓄存纤维膜的同一侧远端相连。吸水纤维位于层析膜的另一端，并与层析膜相接触，主要用于检测容量较大或较稀释的样本时维持层析的效果。支撑盒9主要用于包装和支撑层析膜。检测时，将样本加于蓄存纤维膜同一端的远端加样孔3，加样后，用样本本身的流动相(样本溶液)或固定于检测装置中的层析缓冲液带动被检测的样本DNA、或mRNA、或蛋白质沿层析膜性载体向另一端展开10，在被检测的DNA、或mRNA、或蛋白质迁移过程中，与固定的探针相遇，便会被固定探针俘获，以达到分离鉴定和分析的目的。
该装置的信号检测方法，可以肉眼直接观察对比，更适合的是标记胶体金颗粒加银还原加强法的信号可以被一般平板光学扫描仪扫描获取，一次扫描可以同时获取50份以上检测结果，通过扫描获取的图象再通过图象分析软件自动分析和报告及打印，有利于自动分析和临床大规模的使用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点1.操作简便本发明操作非常简单。只要会DNA抽提或mRNA抽提的非专业人员均可完成本发明的操作。不仅如此，批量操作也十分容易。如基因表达检测操作时，只需将抽提得到的RNA样本加于指定的加样孔，15分钟至30分钟后就可观察到结果。在检测的基因较多时，还可借助一般图象扫描仪扫描获得永久结果，有助于电脑分析处理。
2.检测快速利用本发明针对临床的实际需要，开发可以同时检测几十种基因表达或基因突变位点的诊断产品，符合临床诊断发展的方向。本发明可以在30～60分钟内完成基因表达的检测，在3～5分钟内完成体液中抗体或自身抗体检测，即使是应用固定抗体检测体液中抗原的技术所需的检测时间也不会超过1小时。
3.成本低廉本发明制作与检测费用非常低廉，其主要材料为硝酸纤维素膜和基底支撑物PVC膜，加上基因探针或蛋白探针，其成本高低主要与所用探针的成本有关。
4.浓缩效应本发明的技术应用层析法，通过液体的扩散，带动被检测的DNA或蛋白质分子沿膜条迁移，迫使DNA或蛋白质分子与固定的探针相遇，增加分子碰撞的机会和杂交的机会，同时，因为固定的探针呈线状排列，相当于一层层分子筛结构，网住液体中与之配对的靶分子，达到快速的浓缩效果。
本发明可应用于下列分析和检测一.基因表达模型分析基因表达模型(基因表达谱)是指细胞内相关基因的mRNA表达瞬间状况，反映了当时细胞活动的信息。分析细胞基因表达模型，即可获知细胞处于何种状态。本发明可以同时检测10～100个基因的基因表达谱检测方法，使检测十分简单、快速，可以在短于1小时的时间内完成全部检测过程。
基因表达谱条形芯片检测原理动物类细胞mRNA在3’端均带有Poly(A)序列，此序列可作为通用探针杂交的识别序列，通用探针为Poly(dT)，5’标记有胶体金或铁蛋白等有色物质，当与mRNA溶液混合时，便与mRNA的Poly(A)端多重结合。当此复合物在层析时可随着液体在薄膜上的扩散，mRNA向上移动。当mRNA-Poly(dT)杂交复合物在迁移过程中与固定在薄膜上的cDNA探针相遇时，便被固定探针俘获，原位形成有色信号。不被俘获的mRNA分子继续前移，直到碰到可以俘获的分子为止。
应用本发明检测基因表达谱的方法，是将待分析的相关基因如所有肿瘤基因、信号传导途径相关的基因、分化相关基因以及细胞凋亡相关基因等的cDNA探针(不需全长)或者合成的寡核苷酸探针，在喷样或划样机器人的帮助下，将探针喷在条状硝酸纤维膜上并使之固定，再在膜的一端(PVC膜)喷上检测用的第二探针(巯基标记的多聚寡核苷酸Poly(dT))和胶体金颗粒。然后再将该膜条固定于支撑小盒内，即制成单个检测装置。
检测时，首先分离总RNA或mRNA(异硫氰酸胍法)，再用含有甲酰胺的杂交缓冲液稀释，将样本(靶mRNA)加于检测装置的加样孔内，启动层析通路，半小时即可获得结果。该结果可以用肉眼观察，也可以采用通用扫描仪扫描图象，以便进行电脑数据分析。
二.遗传病基因突变位点检测基因突变可以导致遗传病，突变位点的检测有助于判断遗传病的严重程度和治疗方法。基因突变的检测，传统多采用Southern blot技术，用探针探寻。这种方法检测费时长效率低，所需样本量较大。本发明可以将单基因的所有突变位点的探针(如β-地中海贫血的β-珠蛋白的突变的约有近200个，常见的有40-60个突变位点)按一定次序排列在膜条上，构成了不同突变位点的俘获位点。
基因DNA的检测主要检测DNA单碱基突变位点，固定探针为5～19个检测的寡核苷酸探针，检测时将DNA进行PCR扩增、标记，最后层析杂交；如果不进行DNA PCR扩增，也可以进行直接标记，直接标记法可采用生物素标记技术。生物素直接标记基因组DNA是采用光敏生物素技术，将光敏生物素(PhotoBiotin，SIGMA Cat# A1935)与酶切后的基因组DNA片断混合，置于4℃置于卤钨灯下10cm，强光照射25分钟，使DNA标记上生物素，标记完成后，采用凝胶离心过滤法去除游离的游离光敏生物素，核酸部分可以直接由于层析检测。检测时，将上述PCR标记产物或生物素直接标记产物加于层析检测装置的加样孔，层析15分钟，膜的另一端需与吸水纤维素膜或纤维接触，以维持层析的连续性。
三.抗原抗体检测本发明最适合用于抗原/抗体、受体/配体的临床检测和基础研究之用。将抗原或抗体、受体或配体对中的一方作为探针固定于膜条上，检测抗体或抗原、配体或受体，根据应用的不同，制作方法和检测原理也有不同。
固定抗原物质的方法该技术主要用来检测抗体物质，如肝炎病毒的抗体、艾滋病病毒的抗体以及自身免疫抗体等，该技术检测方便，但应用范围有限，主要因为检测的对象是抗体物质。
固定抗体或受体/配体的方法用固定抗体检测抗原要比用固定抗原检测抗体的难度大些，主要是被检测的抗原物质性质差异影响了不同抗原物质的标记效率以及纯化过程，但是，固定抗体法作为探针检测生物体液中的抗原物质，应用范围很广，几乎所有可以形成抗体的物质都可采用该方法加以检测，如肝炎病毒核心抗原、表面抗原、表面抗体等，还有所有白细胞表面抗原(CD抗原)、血清物质等，都可以采用该技术进行检测。制作时，将相关商用抗体按一定次序排列在膜条上，检测时，必须对检测蛋白质或抗原物质进行标记、纯化，最后将标记过的蛋白质样本加于加样孔，启动层析通路，几分钟后即可看到结果。
本发明主要的技术制作及操作一.探针制备核酸探针cDNA探针必须是基因序列的互补链，即可以直接与基因序列杂交的片断。探针长度不小于200碱基。制备方法一般用PCR扩增法，基因模板可以选择克隆化带有cDNA序列的质粒、噬菌体或者人体细胞组织。下游引物带有氨基标记，以便于合成出的单链探针可以直接固定于芯片表面，而不用事先分离探针互补的序列。对于寡核苷酸探针，一般选用基因突变位点上下游的各7～8个碱基的序列(15个碱基长度)，多采用DNA合成仪自动合成即可。
蛋白质探针蛋白质探针可以是任何抗体或蛋白性质的抗原物质。蛋白探针的选择主要依据抗原抗体、受体配体的特异性识别的原则加以识别。蛋白质可以是商品，也可以根据需要自行制备。
二.探针固定采用喷线方法将探针(不多于50个)和对照探针喷在5mm-10mm宽的硝酸纤维膜或尼龙膜上。对于cDNA探针，可以直接点样，室温干燥后用紫外线进行交联。而对于寡核苷酸探针，紫外线的固定效果较差，必须进行共价连接。该尼龙膜带有氨基修饰，在喷探针之前，膜需要预先用戊二醛处理，使之醛基活化。喷完氨基标记的寡核苷酸探针后，用还原剂处理膜，使不稳定的Shiff’s碱还原为稳定共价键，再用封闭剂(氨基乙醇等)封闭其余的醛基基团。
蛋白探针的固定主要利用蛋白与纤维薄膜的天然吸附的原理实施，通过喷样机等三维机器人将探针点于相应的位置，再经过适当干燥即可。
四.RNA、mRNA抽提RNA抽提可以采用硫氰酸胍(4M)直接抽提RNA，硫氰酸胍变性剂具有很好的抗RNA酶的作用，经硫氰酸胍溶液抽提的RNA经纯化、浓缩、用一定浓度的SSC溶液稀释可以直接用于杂交，也可将硫氰酸胍RNA溶液经过SSC调整后直接用于杂交检测。
五.第二探针制备和标记第二核酸检测探针标记Poly(dT)第二探针的长度可以选择在15个碱基左右，5’端应标记灵敏度高的有色物质，如胶体金颗粒、铁蛋白颗粒以及其他具有相当敏感性的物质。当应用胶体金作为示踪剂时，由于胶体金的特点，可以与巯基化合物形成稳定的复合物。应用巯基标记的Poly(dT)第二探针可以减少探针标记的成本，并且使操作更为简便。
蛋白质胶体金标记用胶体金标记蛋白质，就是指蛋白质吸附到胶体金颗粒表面。胶体金表面带有负电荷，能与蛋白质的正电荷静电吸引而形成牢固的结合。由于这种结合主要是物理作用，所以不会引起蛋白质活性的改变。标记前，需确定胶体金与待标记蛋白质的比例和将pH值调节到标记蛋白质的等电点。标记时，将待标记蛋白质1mg加2.5ml胶体金溶液(10OD)，混合，室温搅拌15分钟，加入10mg BSA，混合5分钟，在加入pH7.0的10％NaCl溶液0.3ml，混匀，离心，再通过离心法或凝胶层析法纯化标记的蛋白质。
六.检测与分析核酸样本的检测芯片探针点样完成后，经过洗涤、干燥等处理后，在储存纤维膜附着区域喷上一定量的Poly(dT)胶体金标记的探针。当应用巯基标记的Poly(dT)第二探针时，把探针直接与胶体金溶液按一定比例混合，让探针与胶体金颗粒充分结合。检测时，经变性后的mRNA或RNA溶液(20μl)加于加样孔中，注意样品在孔中的均匀性。然后将膜条芯片的同一端(加样孔以外区域)浸于层析液(5×SSC溶液)中，让液体沿尼龙膜向另一端层析扩散，同时驱动样本中的mRNA迁移，当mRNA到达相应的位置时，便被固定探针俘获，一般大约需要15分钟到30分钟，再经过15分钟的层析，洗去游离物质，然后通过肉眼观察条带的位置以及信号的有无。芯片杂交的质量可以通过内置的对照加以控制。
由于胶体金标记的二抗或葡萄球菌蛋白A、蛋白G是预先置放在蓄存纤维膜上，检测时只要将受检蛋白样本加于加样孔内，启动层析，几分钟内被检蛋白抗体物质就会沿膜条扩散完毕。
本发明所需关键设备一.喷膜机或划线机喷膜机或划线机是该装置的关键设备，这种设备具有三轴三维线性运动机构，可以将欲固定的DNA或蛋白质探针在指定的位置喷线或划线。喷线为非接触性的，喷样量均匀，不损伤纤维素薄膜，是理想的设备，但是喷头非常昂贵，且容易堵塞，保养维护较难。划线机多采用陶瓷针头，针头便宜，在所固定的探针较多时，操作方便，且容易更换，其缺点是容易划伤薄膜，影响质量。
二.压封机和切割机压封机的目的是将固定有探针的膜条与储存第二探针的玻璃纤维膜热压在PVC塑料薄膜或聚碳酸脂载体上，增加硝酸纤维膜或尼龙膜的韧性以及机械加工性能。切割机的主要作用是将压封有膜条的PVC薄膜切成条状，使之可以装配到检测装置中，还可采用类似于不干胶的粘合方法，将探针膜条和玻璃纤维膜粘贴于PVC膜上。
三.分子生物学设备当应用于DNA杂交或mRNA杂交时，需要相应的分子生物学设备。包括PCR扩增仪、核酸蛋白电泳仪、图象分析仪、冷冻离心机、低温冰箱、核酸自动纯化仪等。
四.包装设备包装设备包括铝薄封口机、剪裁机、干燥剂等。
以下结合实施例进一步阐述本发明。
图1是膜条探针固定示意图A-线固定格式B-点固定格式。
图2是检测装置构造示意图。
图3是mRNA检测原理图。
图4是基因组DNA检测原理图。
图5是固定抗体作为探针检测未知抗原的原理图。
图6是抗原直接固定法检测抗体的原理示意图。
图7是芯片测定结果。
a、造血干细胞部分结构蛋白基因表达谱检测图谱；b、β地中海贫血β珠蛋白基因突变位点检测图谱；c、所有肝炎抗体的检测图谱；d、部分白血病细胞CD抗原检测图谱。
图号说明1-中央检测区域 2-载体膜3-加样孔4-固定探针5-蓄存纤维 6-预置缓冲液7-预填吸水纤维 8-PVC底板9-支撑盒10-层析方向
11-cDNA探针12-mRNA13-第二探针Poly(dT)14-胶体金颗粒15-寡核苷酸片段16-DNA片段17-固定抗原18-被检抗体19-蛋白A 20-固定抗体21-被检抗原。
实施例1造血干细胞部分结构蛋白基因表达谱条形芯片的制作与检测1.cDNA探针的选择与制作以造血干细胞部分结构蛋白和一些小蛋白的基因cDNA作为探针固定于载体膜表面，基因如表1所示。这些基因的cDNA均已被克隆出来，有些是全长基因，有些是Poly(A)端的部分基因序列。这些基因克隆在质粒内，可以用通用的引物将其扩增，本实例所使用的克隆来自国家人类基因组南方研究中心，美国I.M.A.G.E和InCyte公司也有供应。
表1部分造血干细胞结构蛋白基因GeneBankNo表达的蛋白名称X63432 ACTB mRNA for mutant beta-actin (beta′-actin)U03269 actin capping protein alpha subunit(CapZ)U12026 actin-regulatory protein Cap-G(CAPG)K00558 alpha-tubulinX00351 beta-actinV00599 beta-tubulin.
M80563 CAPL proteinU03851 capping protein alphaU56637 capping protein alpha subunit isoform 1X84075 cardiac myosin binding protein-CV00478 cytoplasmic actinX04098 cytoskeletal gamma-actinX04588 cytoskeletal tropomyosin TM30(nm)X73882 E-MAP-115U62962 Int-6L25941 integral nuclear envelope inner membrane protein (LBR)M63483 major nuclear matrix proteinM27937 male-enhanced antigen mRNA (Mea)U38291 microtubule-associated protein la (MAPlA)Y00764 mitochondrial hinge protein
M22382mitochondrial matrix protein P1M69066moesinM31211myosin light chain 1 slow a (MLClsa)M31212myosin light chain 3 non-muscle (MLC3nm)U26162myosin regulatory light chainX54304myosin regulatory light chainJ00312non-muscle(fibroblast) tropomyosin geneL22343nuclear phosphoproteinM60858nucleolinX75252phosphatidylethanolamine binding proteinJ03191profilinU61734protein trafficking protein (S31 iii125)L03785regulatory myosin light chain(MYL5)Y00282ribophorin IIU51586siah binding protein 1(SiahBP1)S65762SPTBN1＝beta-fodrinM25077SS-A/Ro ribonucleoprotein autoantigen 60 kdU26648syntaxin 5U77942syntaxin 7M25246vimentin2.cDNA探针扩增合成、纯化应用Qiagen或Promega公司的PCR试剂盒，根据操作说明书扩增所选cDNA克隆，反应过程中，使用质粒所附的通用PCR引物作为通用PCR合成引物，质粒作为模板，延伸时间需2分钟或以上，30个循环，产物经电泳证明后，直接酒精(75％)沉淀即可。沉淀的DNA经20μl 3×SSC溶液溶解后可直接用于喷线或划线。
3.喷线或划线采用喷线方法(BioDot)将所选探针和对照cDNA探针(Actin和Microglubin以及植物DNA)喷在5mm～10mm宽的尼龙膜上形成条带阵列，或者用点样机(Cartesian)将cDNA探针点于膜的指定位置，形成点状阵列。喷样或点样后，室温干燥，在80℃真空炉内烘烤2小时以使cDNA探针与硝酸纤维膜或尼龙膜形成共价交联。
4.核酸探针标记Poly(dT)第二探针的长度可以选择在15个碱基，5’端应标记灵敏度高的有色物质，如胶体金颗粒、铁蛋白颗粒以及其他具有相当敏感性的物质。当应用胶体金作为示踪剂时，由于胶体金的特点，可以与巯基化合物形成稳定的复合物。应用巯基标记的Poly(dT)第二探针可以减少探针标记的成本，并且使操作更为简便。
由于金的金属特性，巯基基团可以与金表面形成稳定的吸附，不需要特殊的共价结合，因此使金颗粒的标记更为简单。标记后的纯化可以采用离心分离的方法，一般先以低速离心去除聚集的金颗粒的沉淀，然后再超速离心，标记的探针存在于沉淀之中，反复离心几次，最后将沉淀于少量10mM PBS缓冲液(pH7.0)中。
5.第二探针蓄存纤维膜制作蓄存纤维膜可以采用商用玻璃纤维膜或聚脂纤维膜，以玻璃纤维膜更理想。玻璃纤维具有低吸附的特点，可以用于保存第二探针。玻璃纤维膜的厚度可选择在0.2～1.5mm左右。将胶体金颗粒标记的第二探针喷于玻璃纤维膜上，或将玻璃纤维膜浸于标记的第二探针溶液之中，然后室温干燥。
6.压膜与切割将上述玻璃纤维膜或聚脂纤维膜和喷过固定探针的硝酸纤维膜或尼龙膜通过复合压膜机，复合在PVC塑料薄板上，以增加纤维膜的韧性和可加工性。也可以将玻璃纤维膜以及硝酸纤维膜或尼龙膜直接通过压膜机压在设计好的聚碳酸脂检测盒上，但以PVC塑料薄膜容易加工。
7.切割与芯片装配采用切割机将复合好的膜片切成所需的规格和形状，即成单人用检测试剂膜条。将单人分试剂膜条及干燥剂装入铝薄膜小袋并封闭。或将单人分检测膜条装配在小型塑料盒，配以相应的层析液小袋和吸水纤维，制成完整的检测装置，然后将检测装置放置在干燥袋内。
8.RNA抽提与处理RNA抽提可以采用硫氰酸胍溶液(4M硫氰酸胍，1％β-巯基乙醇)直接抽提RNA，硫氰酸胍变性剂具有很好的抗RNA酶的作用，经硫氰酸胍溶液抽提的RNA经纯化、浓缩、用3×SSC溶液(抗RNA酶处理过)稀释可以直接用于杂交，也可以将RNA硫氰酸胍溶液经SSC调整盐离子强度(3×SSC)后，直接杂交检测。
9.检测芯片探针点样完成后，经过洗涤、干燥等处理后，在加样区域喷上一定量的Poly(dT)胶体金标记的探针。当应用巯基标记的Poly(dT)第二探针时，把探针直接与胶体金溶液按一定比例混合，让探针与胶体金颗粒充分结合。检测时，经变性后的mRNA或RNA溶液(20μl)加于加样孔中，注意样品在孔中的均匀性。然后将芯片的同一端(末端2mm)浸于层析液(5×SSC溶液)中，让液体沿尼龙膜向另一端层析扩散，同时驱动样本中的mRNA迁移，当mRNA到达相应的位置时，便被固定探针俘获，一般大约需要15分钟到30分钟，再经过15分钟的层析，洗去游离物质，然后通过肉眼观察条带的位置以及信号的有无。芯片杂交的质量可以通过内置的对照加以控制。
10.信号获取与分析检测膜条干燥后，置于平板扫描仪扫描，将图象输入电脑(图7a)，由专用分析软件分析、报告。也可经过银还原复染液复染增加检测信号灵敏度。
实施例2 β地中海贫血β珠蛋白基因突变位点的检测1.基因突变可以导致遗传病，突变位点的检测有助于判断遗传病的严重程度和治疗方法。本发明可以将单基因的所有突变位点的探针(如β-地中海贫血的β-珠蛋白的突变的约有近200个，常见的有40-60个突变位点)按一定次序排列在膜条上，构成了不同突变位点的俘获位点。检测时，分离基因组DNA，经过适当酶切后形成2kb左右的片断，再经直接标记或缺口平移标记胶体金颗粒，最后将标记过的标本加于检测装置的加样孔，进行层析使靶DNA沿检测膜条迁移、俘获，最终扫描分析。
2.固定寡核苷酸探针的准备当探针位点决定以后，选取突变位点上游和下游的个7个碱基范围(共15个碱基)的序列作为探针序列，再根据探针的熔点温度适当调整探针的长度。探针多采用合成法，在探针的一端(多在5’端)标记有12碳原子的延长臂和活性反应基团，如羧基标记，本实例探针均由上海生工生物技术服务公司合成。表2显示部分β-地中海贫血的突变探针序列
表2 部分β-地中海贫血的β珠蛋白基因突变探针序列位点野生型 突变型β41-42(-TCTT) CAG AGG TTC TTT GAG T CAG AGG TTG AGT CCT TIVS2-654(C-T)GTT AAG GCA ATA GCA GGT TAA GGI AAT AGC AAβ17(A-T)TGG GGC AAG GTG A TGG GGC IAG GTG AA-28(A-G) GGG CAT AAA AGT CAG GGG CAT AGA AGT CAGβ71-72(+A) TGC CTT TAG TGA TGG TGC CTT TAA GTG ATGβ71-72(+T) TGC CTT TAG TGA TGG TGC CTT TIA GTG ATGINS1-5(G-C) CAG GTT GGT ATC AAG CAG GTT GCT ATC AAG-30(T-C) CTG GGC ATA AAA GTC CTG GGC ACA AAA GTβ14-15(+G) CCC TGT GGG GCA A CCC TGG TGG GGC AHBE26(G-A) GGT GGT GAG GCC C GGT GGT AAG GCC CP(IVS1-1)TGG GCA GGT TGG TAT TGG GCA GTT TGG TATP(B27-28)GTG AGG CCC TGG GCA TGA GGC CCC TGG GCAP(IVS2-1)CTT CAG GGT GAG TCT CTT CAG GAT GAG TCTP(B1)GAC ACC ATG GTG CAC GAC ACC AGG GTG CACP(B37) TAC CCT TGG ACC CAG TAC CCT TAG ACC CAGP(+40～43) CAA CCT CAA ACA GAC AGC AAC CTC AGA CACP(B14-15)ACT GCC CTG TGG GGC AA CTG CCC TGG TGG GGC AAP(CAP+1) ATT GCT TAC ATT TGC ATT GCT TCC ATT TGCP(B19) AAG GTG AAC GTG GAT AAG GTG AGC GTG GATP(B95+A) CTG TGA CAA GCT GCA TGT GAC AAA GCT GCAP(IVS2-5)AGG GTG AGT CTA TGG AGG GTG ACT CTA TGG3.喷线或划线标记有羧基的寡核苷酸探针稀释在3×SSC溶液内，经过滤后在喷膜机或划线机的帮助下，探针与1/10体积的EDC(0.1M)和NHS(1M)溶液(需新鲜配制)一起混合，点于尼龙膜的相应位置，由于EDC可催化羧基与氨基的共价交联，使寡核苷酸探针固定于硝酸纤维膜或尼龙膜的表面。也可以使用氨基修饰的尼龙膜加戊二醛的方法固定氨基标记寡核苷酸探针，该尼龙膜带有氨基修饰，在喷探针之前，膜需要预先用戊二醛溶液(4％)室温处理2小时，使之醛基活化，并洗去游离戊二醛。喷完氨基标记的寡核苷酸探针后，用还原剂(1％硼氢化钠，10mM PBS配制)处理膜，使不稳定的Shiff’s碱还原为稳定共价键，再用封闭剂(1M氨基乙醇溶液等)封闭其余的未结合的醛基集团。
4.胶体金颗粒存储玻璃纤维将Streptavidin标记的胶体金颗粒(10OD，直接购于上海华美公司)，应用喷膜机喷于玻璃纤维膜上，干燥。
5.压膜、和切割与芯片装配操作参见实施例一中7、8步骤。
6.基因组DNA抽提与酶切抽提样品DNA抽提可以用经典的苯酚/氯仿抽提方法，也可以用市场上的基因组DNA抽提试剂盒(如Genomic DNA Purification Kit，Promega，Cat#A1120；QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGEN，Cat#51104)。
酶切选用四核苷酶切位点的限制性内切酶，如Alul、NlaIII、HaeIII等，一般反应步骤为调整抽提的DNA盐浓度为1～3mol/L，加入所用内切酶，37℃反应1小时，终止反应，进行光敏生物素和胶体金颗粒的直接标记。
7.PCR扩增胶体金间接标记PCR扩增时采用三对PCR引物，序列为HBB1-1AGG GTT GGC CAATCT ACT CC；HBB1-2BBiotin-GTC TCC ACA TGC CCA GTT TC；HBB2-1TTG GGT TTC TGA TAG GCA CTG；HBB2-2BBiotin-TCT CCC CTT CCTATG ACA TGA；HBB3-1ATG CCT CTT TGC ACC ATT CT；HBB3-2BBiotin-TGC TCA AGG CCC TTC ATA AT。扩增后所有产物均带有生物素标记，因此在检测时通过Streptavidin标记胶体金颗粒的玻璃纤维膜时，与胶体金颗粒结合并向前迁移，沉积于相应固定探针的位置。
8.生物素直接标记基因组DNA生物素直接标记基因组DNA是采用光敏生物素技术，将光敏生物素(PhotoBiotin，SIGMA Cat# A1935)与酶切后的基因组DNA片断混合，于4℃置于卤钨灯(100W)下10cm，强光照射25分钟，使DNA标记上生物素，标记完成后，采用凝胶离心过滤法去除游离的游离光敏生物素，核酸部分可以直接用于层析检测。
9.层析杂交检测时，将上述PCR标记产物或生物素直接标记产物加于层析检测装置的加样孔，层析15分钟，膜的另一端需与吸水纤维接触，以维持层析的连续性。
10.信号检测和分析将检测膜条干燥后，置于平板扫描仪扫描，将图象输入电脑(图7b)，由专用分析软件分析、报告。如果检测信号达不到检测灵敏的要求，可以加用银显影液复染以增加检测灵敏度。信号的摄取与保存有利于自动分析和临床大规模的使用。
实施例3 多类型肝炎血清抗体的胶体金检测方法以抗体1-抗原-抗体2方法举例说明的多类型肝炎血清抗体检测过程。
1.抗体的选择从NeoMarker以及Santa Cruz和Gibco BRL公司购买6种亚型肝炎病毒全套抗体，如抗-HAV，抗-HbsAg，抗-HBs，抗-HbeAg，抗-Hbe，抗-HBc，抗-HCV，抗-HDV，抗-HEV，抗-HGV等抗体，固定抗体都选用多克隆抗体，检测抗体全部选择单克隆抗体，胶体金固定抗体为羊抗鼠二抗。所购抗体浓度一般为200μg/ml，含有2mg/ml的BSA和0.1％的叠氮钠，可以直接使用，用于喷线。
2.胶体金的准备胶体金制备有多种途径，最常用的是还原四氯金酸(HAuCl4)的方法。四氯金酸是一种高亲和性结晶体，以水溶液的形式密封于安醅瓶中，室温下可保存数月。例如，应用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，是将1ml 1％四氯金酸水溶液加双蒸水100ml煮沸，立即加入1％柠檬酸三钠4ml，在煮沸5分钟，这样制得的胶体金颗粒约为15nm。本实例的胶体金溶液是从华美生物技术公司购买，浓度为10OD值，直径为40nm。
3.用胶体金标记羊抗鼠二抗就是让羊抗鼠二抗吸附到胶体金颗粒表面。胶体金表面带有负电荷，能与蛋白质的正电荷静电吸引而形成牢固的结合。由于这种结合主要是物理作用，所有不能会引起抗体活性的改变。标记前，需确定胶体金与待标记羊抗鼠二抗的比例和将pH值调节到标记的等电点(pH6.5～7.0)。标记时，将待标记1mg羊抗鼠二抗溶液加2.5ml胶体金溶液(10OD)，混合，室温搅拌15分钟，加入10mg BSA，混合5分钟，在加入pH7.0的10％NaCl溶液0.3ml，混匀，离心，在通过离心法或凝胶层析法纯化胶体金标记的羊抗鼠二抗。
4.蓄存膜制备通过喷膜法或浸膜法将所有相应的单克隆抗体等比例混合，加入1/2体积的胶体金标记羊抗鼠二抗，混合，包被于或喷于聚脂纤维膜上，室温干燥，4℃保藏。
5.多克隆抗体的固定用点膜机、喷膜机或划线机将多克隆抗体点于硝酸纤维膜或带正电的尼龙膜的检测区域或控制区域，喷膜的抗体量为1μl/cm，室温使其充分干燥，目的是使抗体吸附更牢固。
6.膜片制备将上述玻璃纤维膜或聚脂纤维膜和硝酸纤维膜或尼龙膜通过复合压膜机，复合在PVC塑料薄板或粘贴于不干胶PVC塑料薄板上，以增加纤维膜的韧性和可加工性。
7.压膜、切割与芯片装配操作参见实施例一中7、8步骤。
8.包装将单人分试剂膜条及干燥剂装入铝薄膜小袋并封闭。或将单人分检测膜条装配在小型塑料盒，配以相应的层析液小袋和吸水纤维，制成完整的检测装置，然后将检测装置放置在干燥袋内。
9.检测检测时将膜的贴有蓄存纤维膜端远端浸于检测样品内，或者将样本加于加样孔内，层析3～5分钟，肉眼观察结果，也可将检测膜条干燥后，应用一般平板扫描仪扫描，将结果(图7c)输入电脑并分析、报告。
实施例4 白血病细胞CD抗原的检测方法CD抗原也称白细胞分化抗原，是白细胞表达在细胞表面的一种特定标志物，其中很多可以反映白细胞分化的进程、反映白细胞激活或失活的状态。白细胞表面分子通常用抗白细胞的抗体进行检测。应用不同组合的CD抗原抗体就可以鉴别出白细胞的亚型，如B细胞、辅助T细胞，细胞毒T细胞和自然杀伤细胞等，这些细胞对药物的反应和抗性都不相同。
白血病是一种骨髓造血细胞克隆性增值，细胞常停留在细胞分化的某一阶段而不发育成熟，因而可以带有某种特殊的标志。白血病可以发生于造血细胞任何一个系列，其本身也带有这个系列的特殊标志。对于急性白血病，白细胞的免疫分型可以鉴定白血病细胞发生的系列和成熟的程度。然而到目前为止，还没有发现对于任何一种白血病都特异的标志物，因此白血病细胞的鉴定通常就是不同CD抗原表达的组合鉴定。
1.探针选择到目前为止，已发现的以CD系列命名的抗血液细胞的抗体已达到编号166，加上各种亚型，实际上已经接近190个。这些CD抗体都是识别血液细胞上的某一特定分子，绝大多数是蛋白质或糖蛋白，少数是粘多糖(5-6种)。为了达到临床诊断的实用性，该诊断膜条所使用的CD抗体为38个，可函盖所有白血病类型的诊断，这些抗体选择如表3。该实例选用NeoMarker所售的CD抗原抗体。所购抗体浓度一般为200μg/ml，含有2mg/ml的BSA和0.1％的叠氮钠，可以直接使用，用于喷线。
表3.所选抗体的CD编号名称
2.将抗体喷线固定将抗体浓度调节至200μg/ml，在微量喷膜机的帮助下，将抗体溶液喷线于膜的相应位置，喷膜的抗体量为1μl/cm，室温真空抽干，使抗体探针牢固地固定于硝酸纤维膜或PVDF膜的表面。干燥后的膜应保存于干燥和4℃环境。
3.胶体金的准备操作参见实施例三中第2步骤。
4.细胞膜蛋白水化和分离在0-4℃环境中，加纯化的Triton X-114(10mM PBS，150mM NaCl，pH7.4)，使Triton X-114的终浓度为2-3％，膜蛋白浓度为1-3mg/ml；0-4℃孵育1小时，0-4℃ 100,000g离心1小时，去除不溶物质；在一试管内加4ml6％葡聚糖，将细胞溶液加于上面，25-30℃孵育5-10分钟，20℃离心100g5分钟，去上层水相层用于检测。
5.胶体金标记细胞膜蛋白标记前，需通过分光光度计(波长280nm)比色法确定标记膜蛋白的浓度，将待标记膜蛋白1mg加2.5ml胶体金溶液(10OD)，混合，室温搅拌15分钟，加入10mg BSA，混合5分钟，在加入10％NaCl溶液(pH7.0)0.3ml，混匀，离心，在通过离心法或凝胶层析法纯化胶体金标记的细胞膜蛋白。
6.蓄存膜制备通过喷膜法或浸膜法将BSA(10mg/ml)包被于聚脂纤维膜上。
7.压膜、切割与芯片装配操作参见实施例一中7、8步骤8.检测检测时将膜的固定储存纤维膜端的远端(2mm即可)浸于检测样品内，或者将样本加于加样孔内，层析(层析液为标记胶体金的细胞膜蛋白溶液)3～5分钟，或增加银显影液复染，肉眼观察结果，也可将检测膜条干燥后，应用一般平板扫描仪扫描，将结果(图7d)输入电脑并分析、报告。
权利要求
1.一种生物大分子快速层析检测芯片的检测方法，检测对象为DNA、mRNA或蛋白质，根据游离DNA、mRNA或蛋白质分子在层析迁移过程中被固定的DNA探针或相应蛋白质探针俘获的原理设计，包括下述步骤a.采用可以让液体自由扩散的薄膜作为探针固定的层析载体膜，固定探针排列在载体膜的中央检测区域，形成探针阵列；b.示踪标记物和/或连接示踪标记物的第二探针喷于或浸于蓄存纤维膜上，干燥，将蓄存纤维膜固定或粘贴于载体膜一端，并使其紧密接触，蓄存纤维膜为亲水性和非吸附介质，不与生物大分子活性物质反应或吸附；c.含DNA、mRNA或蛋白的样品加于层析载体膜，并与蓄存纤维膜同一端，液体流动相沿层析载体膜展开，样品靶物质先与第二探针及示踪标记物结合，并进一步向探针固定区域迁徙，当标记有示踪物的靶物质与固定探针配对时，便被俘获固定，在相应的条带位置呈现阳性检测信号；d.信号的加强、检测及分析。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中固定探针包括DNA探针，cDNA探针、寡核苷酸探针、碱基或戊糖环被修饰过的RNA寡核苷酸探针和非DNA/RNA探针；非DNA/RNA探针包括蛋白质探针、糖蛋白探针和小分子激素探针；蛋白质探针包括抗原探针、抗体探针、受体探针和配体探针。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中探针固定的载体膜包括硝酸纤维膜、PVDF膜、尼龙膜等带有阴离子或阳离子氨基集团的膜材料，或者是膜表面被修饰带有活性基团如醛基、巯基、羧基、羟基和酮基等基团的膜性材料。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中的示踪标记物，是胶体金颗粒、胶体银颗粒、胶体金颗粒加银显影液复染、酶免疫标记物、荧光免疫标记物。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中以银还原信号增强法报告检测信号。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中层析载体膜贴于有一定硬度的支持物上，并切割成适用的形状。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中层析载体膜另一端还可与吸水纤维相连接。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中探针固定的格式可以是线状阵列或点状阵列，线间或点间距离约为0.2～10mm。
9.根据权利要求1所述的检测方法，当样品中靶物质是mRNA时，以cDNA为固定探针，Poly(dT)为第二探针，胶体金颗粒为示踪剂；或基因外显子的寡核苷酸寡核苷酸片断为探针，Poly(dA)为第二探针，胶体金颗粒为示踪剂。
10.根据权利要求1所述的检测方法，当样品是基因组DNA时，以基因组DNA的寡核苷酸片断为探针，检测时先将基因组DNA分离、纯化、酶切或超声波破碎、生物素光学标记或PCR扩增标记，Streptavidin包裹的胶体金颗粒为示踪剂。
11.根据权利要求1所述的检测方法，当样品是抗体时，以纯化的抗原或抗抗体为固定探针，以第二抗体、葡萄球菌蛋白A或蛋白G标记的胶体金颗粒作为示踪剂。
12.根据权利要求1所述的检测方法，当样品是抗原时，以多克隆或单克隆抗体为固定探针，将被检测抗原直接进行生物素标记和Streptavidin包裹的胶体金颗粒为示踪剂；或以多克隆抗体为固定探针，以单克隆抗体为检测抗体，羊抗鼠第二抗体包被的胶体金颗粒作为示踪剂。
13.应用权利要求1所述的检测方法的生物大分子层析检测芯片，其特征在于具有载体膜和与之配合的蓄存纤维膜，膜载体有固定探针阵列，蓄存纤维膜预存第二探针及示踪物；蓄存纤维膜位于载体膜的一端，与载体表面接触。
全文摘要
一种生物大分子快速层析检测芯片的检测方法,主要根据DNA、mRNA和蛋白溶液层析迁移过程中被固定的DNA和蛋白探针俘获的原理设计的。固定探针的载体为硝酸纤维膜、尼龙膜等,将胶体金颗粒标记的第二探针预置于膜一端。用流动相带动样品沿膜载体展开,靶物质会被相应固定探针阵列俘获,达到快速分离鉴定的目的。本发明还提供快速检测芯片,该检测装置制作本低廉、检测方便快速,非常适合于临床和基层单位使用。
文档编号C12Q1/68GK1354258SQ00127450
公开日2002年6月19日 申请日期2000年11月17日 优先权日2000年11月17日
发明者缪金明 申请人:缪金明