一种新型下调miRNA-21表达的方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型下调miRNA-21表达的方法，在miRBase数据库中检索出>miR-21-5p的序列：5’-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3’；其反义互补序列为：5’-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3’，再与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链；将合成的正反义链混合，95℃加热5分钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物；取2-10μl连接产物转化100μl感受态细胞DH5α，涂LB平板，含50μg/ml壮观霉素，37℃孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50μg/ml壮观霉素的LB培养基中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒。本发明的有益效果是可以长效、便捷下调miR-21的表达。
【专利说明】-种新型下调miRNA-21表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因【技术领域】，涉及一种新型下调miRNA-21表达的方法。
【背景技术】
[0002] 微小RNA-21 (microRNA-21，miR-21)是miRNA家族中的成员之一，具有重要的生物 学功能。目前，通过改变miR-21的活性或表达，从而研究其生物学功能的方法主要有抑制 剂（Inhibitor)、拮抗剂（Antagomir)及慢病毒载体等。然而，这些方法存在有效作用时间 短、操作困难、安全性能差等缺点，难以达到长效、便捷下调miR-21表达的目的。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种新型下调miRNA-21表达的方法，解决了现有的改变 miRNA-21表达的方法有效作用时间短、操作困难的问题。
[0004] 本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：
[0005] 步骤I :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链；
[0006] 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载体构建：将合成的正反义链混合，95°C加热5分 钟退火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物；
[0007] 步骤3 :取2-10 μ 1连接产物转化100 μ 1感受态细胞DH5 α，涂LB平板，含50 μ g/ ml壮观霉素，37°C孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50 μ g/ml壮观霉素的LB培养基 中，按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒,重组质粒即为pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。
[0008] 本发明的有益效果是不仅可以长效、便捷下调miR-21的表达，同时还可快捷地观 察miR-21下调表达后的生物学效应。
【专利附图】
【附图说明】
[0009] 图1是本发明中miR-21-AS0序列的设计原理图；
[0010] 图2是pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0真核表达载体构建示意图；
[0011] 图3是该表达载体构建过程中的质粒电泳图和测序结果；
[0012] 图4是该表达载体转染真核细胞后，miR-21表达水平检测；
[0013] 图5是该表达载体转染真核细胞后，miR-21生物学效应检测。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0015] 本发明利用分子克隆及反义核酸技术构建含CMV启动子的 pcDNA-6. 2-miR-21-AS0真核表达载体。该载体体外转染真核细胞后，利用荧光定量PCR技 术检测miR-21的表达，同时通过体外实验观察miR-21下调后的生物学效应。本发明属于 生物【技术领域】，可以广泛用于分子生物学和细胞生物学实验中下调miR-21，并观察其生物 学效应。
[0016] 本发明采用以下步骤进行：
[0017] 步骤I :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链。图1为miR-21-ASO序列的设计过程。
[0018] 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载体构建：将合成的正反义链混合，95 °C 加热5分钟退火形成双链。将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物， pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 的真核表达载体构建完成。图 2 为 pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0 真核 表达载体构建过程。其中，图中：SV40,猴空泡病毒40(Simianvirus 40) ;EGFP，增强型绿色 突光蛋白(Enhanced green fluorescent protein) ;Spec，壮观霉素抗性（Spectinomycin resistance) ;BSD，杀稻癌菌素抗性（Blasticidin resistance) ;Puc Ori,复制起始 位点（origin ofreplication) ;Pcmv，人巨细胞病毒启动子（Human cytomegalovirus promoter)〇
[0019] 步骤3 :取2-10 μ 1连接产物转化100 μ 1感受态细胞DH5a，涂LB平板（含50 μ g/ ml壮观霉素）后，37°C孵育16小时。挑取6个阳性克隆，接种到含50 μ g/ml壮观霉素的LB 培养基中。按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒，重组质粒即为pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0。
[0020] 将pcDNA-6. 2-miRNA-21-AS0送上海生物工程有限公司进行测序，并对测序结果 与目的序列进行Blast比对分析，如图3所示，A为重组质粒电泳图，B为重组质粒测序鉴定 示意图。用含10%胎牛血清、l〇〇〇u/mL青霉素、100ug/mL链霉素的McCoy'5A细胞培养液， 于37°C、C0 2体积分数为5%条件下培养HCT116细胞。将人结肠癌HCT116细胞分为阴性对 照组及 miRNA-21-AS0 实验组；分别作转染 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-Ctrl (p-Cont)阴性对 照质粒及pcDNA-6. 2-miR-21-AS0(p-miR-21AS0)质粒处理；收集转染72h后的细胞，提取总 RNA。利用Realtime PCR探针法检测miR-21的表达水平。结果显示：以U6作为内参，采用 2^ΔΔα方法计算miR-21相对表达水平，pcDNA-6. 2-miR-21-AS0转染组中，miR-21表达水平 明显下调（图4)，提示该载体可以显著下调miR-21的表达。
[0021] 进一步检测了各转染组中HCT116细胞生长的变化。分组转染HCT116细胞72h后， 光镜下观察HCT116细胞的体外生长变化。结果发现与p-Cont转染组相比，p-miR-21AS0 转染组HCT116细胞的生长明显受到抑制，细胞数量减少，图5为该真核表达载体转染细胞 后，miR-21生物学效应检测图。图5A为光镜；图5B为CCK-8实验结果。结果表明，含CMV 启动子的p-miR-21-ASO真核表达载体不仅可以下调miR-21在真核细胞中的表达，同时，我 们也可通过体外转染观察miR-21下调表达后的生物学效应。
[0022] 其中，miR-21 序列：
[0023] 正义序列：5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA _ 3' ；
[0024] miR-21-ASO 序列
[0025] 正义链：5 ' -TGCTTCAACATCAGTCTGATAAGCTATTTTTG-3 '，反义链：5 ' -CCTGCAAAAATA GCTTATCAGACTGATGTTGA-3' ；
[0026] 本发明的有益效果是，不仅可以长效、便捷下调miR-21的表达，同时还可快捷地 观察miR-21下调表达后的生物学效应。
[0027] 以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限 制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均 属于本发明技术方案的范围内。
[0028]
【权利要求】
1. 一种新型下调miRNA-21表达的方法，其特征在于，按照以下步骤进行： 步骤1 :miR-21_AS0序列设计：在miRBase数据库中检索出〉miR-21_5p的序列： 5' -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3';其反义互补序列为：5' -TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3'，再 与载体粘性末端互补连接，得到合成的正反义链； 步骤2 :pcDNA-6. 2-miR-21-AS0载体构建：将合成的正反义链混合，95°C加热5分钟退 火形成双链，将退火的双链DNA室温连接30分钟得到连接产物； 步骤3 :取2-10 ill连接产物转化100 ill感受态细胞DH5 a，涂LB平板，含50 ii g/ml 壮观霉素，37 °C孵育16小时，取6个阳性克隆，接种到含50 ii g/ml壮观霉素的LB培养基中， 按天根质粒小提试剂盒方法抽提质粒，重组质粒即为pcDNA-6. 2-miRNA-21-ASO。
【文档编号】C12N15/63GK104404071SQ201410708026
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】徐林, 陶弋婧, 周涯, 郭萌萌, 赵娟娟 申请人:遵义医学院