基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，属于药理学【技术领域】。包括以下四步：（1）将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入pCDNA3等表达质粒载体，并进行载体鉴定和蛋白表达检测；（2）将携带目的基因的pCDNA3等重组质粒转染入293T等细胞，进行重组蛋白的表达；（3）将得到表达标签蛋白的细胞进行CETSA检测；（4）在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上，对多种药物、多种靶标蛋白的高通量分析；得到的CETSA数据用于分析。本发明技术能够高效灵敏快速地进行高通量检测，可用于化合物的体内蛋白靶点的筛选。
【专利说明】基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，属于药理学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]新药的研发是高投入、高风险、周期长和高收益的产业，面临着多重挑战，然而随着对分子、细胞和生理过程的深入研究，已经明确了大量的蛋白质作为潜在的药物靶点，因此开发高效的新药筛选方法已经成为加速药物开发的迫切需要。药物开发两个常见的瓶颈:鉴别合适的靶标蛋白，以及设计出能够有效找到并结合它们的药物分子。目前临床应用药物的疗效多是通过直接或间接作用于一个或几个靶标蛋白。药物结合到蛋白质功能性位点后产生活化或抑制的效果，即是通过蛋白质活性的修饰产生相应的分子、细胞或机体应答。因此，一种药物的疗效是依赖于它与靶点蛋白接合的程度，而药物的副作用则来自于其脱靶结合其他蛋白产生药物的不利影响。因此鉴别合适的靶标蛋白对于新药的开发意义重大。
[0003]监测药物疗效过程中的一个问题是，不能直接测定细胞和组织中的药物结合反应，相反，它只能间接监测下游的细胞反应。因此，研发中的药品由于无法预测药物在细胞内的作用靶点而导致后期临床试验失败。大多数药物是通过结合一个或多个蛋白质来影响其功能，这就产生了药物开发中的两个常规瓶颈:识别正确的靶蛋白，设计药物能够有效的寻找到并结合该蛋白。但是现在还没有方法能够有效且直接的测量药物分子到达并结合靶蛋白的方法。卡罗林斯卡研究中心科学家开发出一种称之为细胞热转移(CETSA, CellularThermal Shift Assay)的方法,该方法采用的原理是祀蛋白在结合药物分子后通常变得结构稳定。瑞典Karolinska研究所的研究人员已经开发出一种根据药物配体与蛋白结合后的稳定性，在2013年最新发表于《科学》(Science)杂志上的论文中对这一方法进行了详细描述，其利用了一个概念:当药物分子结合时靶蛋白通常会获得稳定。CETSA被认为是可以直接测定药物有效性的技术，有可能大大推动新药的改良和研发。CETSA将成为新药研发过程中一个重要的控制阶段，或者作为其他方法的补充。
[0004]高通量筛选(High throughput screening, HTS)技术是指以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微孔板作为实验工具载体，以自动化操作系统执行试验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验结果数据，以计算机分析处理实验数据，在同一时间检测数以千万的样品，并以得到的相应数据库支持运转的技术体系，它具有微量、快速、灵敏和准确等特点。简言之就是可以通过一次实验获得大量的信息，并从中找到有价值的信息充分利用药用资源，由于高通量筛选依赖数量庞大的样品库，实现了药物筛选的规模化，较大限度地利用了药用物质资源，提高了药物发现的几率，同时提高了发现新药的质量。基于CETSA新技术的发明，我们将其与高通量筛选技术结合，在我们构建的带标签的全基因组的过表达质粒库的基础上，从而快速准确筛选药物靶点，是一种新型的高通量筛选的特色效用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，在构建带标签的全基因组的过表达质粒库的基础上，药物与各靶标蛋白结合后进行高温溶解，同时高通量检测其恒温量效反应曲线，最终得出该药物与各靶标蛋白的IC50，直接反应出与该药物结合活性最强的靶标蛋白，从而提供一种新型的高通量筛选药物靶标蛋白的技术检测方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0007]—种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，包括以下四步:人类全基因组表达质粒的构建、外源蛋白的表达和纯化、CETSA检测、高内涵扫描和数据统计分析，具体如下:
(I)人类全基因组表达质粒的构建:
将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入带标签的flag-p⑶NA3等表达质粒载体，并进行鉴定和启动子活性检测。以HeLa细胞全基因组转录组为模板，PCR法扩增出目的基因，利用同源重组酶法将目的片段连接到flag-pCDNA3等表达载体上。再将构建成功的P⑶NA3等表达重组质粒和内参质粒P -gal瞬时共转染入细胞，培养48 h后检测荧光素酶活性。要求双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，转染重组质粒后可检测到荧光素酶活性。构建人类全基因组表达质粒库后，为药物靶标蛋白的筛选提供基础。
[0008](2)外源标签蛋白的表达和细胞裂解液提取:
培养细胞(视研究目的而定)收集后使用PBS缓冲液洗三次后，溶于含有蛋白酶抑制剂的激酶缓冲液(Kinase buffer),使用液氮进行反复冻融破裂细胞,将得到的细胞提取物通过20000g，4° C离心20分钟后得到可溶性蛋白提取物，得到的蛋白保存于-80° C。
[0009](3) CETSA 检测:
将上述标签蛋白提取物一部分加入适宜浓度的待测药物，另一部分加入抑制剂，室温孵育10?30分钟后，将细胞悬液等分成50 iil，分别在不同温度下加热3?10分钟，具体的温度通过CETSA预实验确定。然后将细胞提取物再次20000g，4° C离心20分钟，分离得到的上清液，弃去不溶性沉淀。然后取IOii I样品进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmuno sorbent assay，ELISA)。ELISA实验最终得到各药物-蛋白孵育作用后的吸光度值。该吸光度值与CETSA最低的药物-蛋白孵育温度直接相关，据此绘制CETSA曲线和ITDRFCETSA (等温量效反应指纹图谱)。
[0010](4)高通量分析和数据统计分析
在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上，实现对多种药物、多种祀标蛋白的闻通量分析。得到的CETSA数据(ELISA得到的吸光度值)用于分析。CETSA数据和相应的ITDRFCETSA数据进行s形(可变斜率)曲线拟合。或者计算药物对蛋白的半数抑制浓度(IC50),通过Lineweaver Burk曲线得到药物对蛋白的抑制常数Ki。
[0011]该发明的有益效果在于:本发明技术已经构建了人类全基因组质粒表达库，能够为已上市药物或新型先导化合物的靶点筛选和药效确认提供真正意义上的高通量筛选；高内涵技术是高通量筛选中意义重大前景广泛的技术，设备和操作虽然相对复杂，但结果可靠，工作效率高；本发明技术全基因表达库基础上建立的CETSA结合高内涵筛选药物靶标蛋白的分析方法，对药物对靶标蛋白性质的影响以及亲和力等特点进行定量分析，能够高效灵敏快速地进行高通量检测，可用于化合物的体外蛋白靶点的筛选。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是本发明实施例中高通量CETSA曲线和高通量ITDRFCETSA曲线的生成步骤示意图。
【具体实施方式】
[0013]下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。CETSA曲线和ITDRFCETSA曲线的生成步骤示意图，见图1。
[0014]实施例1:
筛选已知药效药物的未知靶蛋白:
选择人肺癌细胞株LAC和人肝癌细胞株H印G2作为研究对象，按细胞生长需求，LAC细胞培养于F12K培养基(含5%胎牛血清、1%青链霉素)，H印G2培养于高糖DMEM培养基(含5%胎牛血清、1%青链霉素)，细胞生长融合度超过80%后使用5%的胰蛋白酶消化，使用培养基稀释后种板进行浓度梯度预实验。根据细胞活力CCK-8预实验结果，设定待测化合物处理LAC细胞和H印G2细胞的浓度分别为10-3M到10-10M。使用RIPA裂解液裂解未经药物处理过的细胞，20000g离心20分钟后得到细胞提取物。在温度梯度作用下30-80°C加热得到各蛋白的热溶解曲线以及最适宜温度，然后向另一份蛋白提取物加入各候选化合物，45°C加热3分钟后，冷却到室温后计算各候选化合物的热溶解曲线，可以观察到经过索拉非尼(已上市抗癌药物，用于阳性对照)处理后的蛋白样品，MAPK通路蛋白的热溶解曲线出现显著位移,而Smad通路(Smadl-4)和Notch通路蛋白并未出现明显变化。据此原理,可以筛选出能够作用于疾病靶标蛋白的潜在治疗药物。
[0015]实施例2:
高通量筛选与已知疾病蛋白结合的未知化合物:
将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入带标签的flag-p⑶NA3等表达质粒载体，并进行鉴定和启动子活性检测。以HeLa细胞全基因组转录组为模板，PCR法扩增出目的基因，利用同源重组酶法将目的片段连接到flag-pCDNA3等表达载体上。再将构建成功的P⑶NA3等表达重组质粒和内参质粒P-gal瞬时共转染入细胞，培养48 h后检测荧光素酶活性。要求双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒无误，转染重组质粒后可检测到荧光素酶活性。构建人类全基因组表达质粒库后，为药物靶标蛋白的筛选提供基础。培养细胞(视研究目的而定)收集后使用PBS缓冲液洗三次后，溶于含有蛋白酶抑制剂的激酶缓冲液(Kinase buffer),使用液氮进行反复冻融破裂细胞,将得到的细胞提取物通过20000g，4° C离心20分钟后得到可溶性蛋白提取物，得到的蛋白保存于-80° C。将上述标签蛋白提取物一部分加入适宜浓度的待测药物，另一部分加入抑制剂，室温孵育10?30分钟后，将细胞悬液等分成50 yl，分别在不同温度下加热3?10分钟，具体的温度通过CETSA预实验确定。然后将细胞提取物再次20000g，4° C离心20分钟，分离得到的上清液，弃去不溶性沉淀。然后取IOii I样品进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)。ELISA实验最终得到各药物-蛋白孵育作用后的吸光度值。该吸光度值与CETSA最低的药物-蛋白孵育温度直接相关，据此绘制CETSA曲线和ITDRFCETSA(等温量效反应指纹图谱)。
[0016]实施例3:
高通量体内筛选已知疾病靶蛋白的未知化合物:
在联合药品库的基础上，对多种潜在的抗肝癌药物和其他先导化合物进行活性研究。将初步筛选出的化合物进行浓度稀释或配置，在实验过程中对化合物的浓度进行调整。将具有潜在药理活性的抗癌化合物进行细胞学预实验，根据cck-8细胞活力实验结果初步选定候选化合物的浓度。在人类全基因组表达质粒库的基础上，将按上述步骤分离纯化得到的各靶标蛋白分别加入384孔板中，进行浓度梯度和温度梯度孵育3-5分钟后得到CETSA实验得到热溶解曲线和ITDRFCETSA，计算其中位移最大的蛋白，从而初步得到具有潜在抗癌活性的化合物及其相关的靶标蛋白。
[0017]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种基于细胞热转移技术的高通量药物靶点筛选方法，其特征在于:包括以下四步:人类全基因组带标签的表达质粒的构建、带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取、CETSA检测、高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析，具体如下: (1)人类全基因组带标签的表达质粒的构建:将人类全基因组的各基因的编码区序列片段定向连入Flag-pCDNA3等表达质粒载体,并进行带标签质粒鉴定和标签蛋白表达的检测；以HeLa细胞全基因组转录组RNA为模板，PCR法扩增出目的基因，利用ClonExpress?IIOne Step Cloning Kit将目的片段连接到flag-pCDNA3等表达载体上；再将构建成功的p⑶NA3等表达重组质粒和内参质粒P -gal瞬时共转染入细胞，培养48 h后检测荧光素酶活性； (2)带标签蛋白的表达和细胞裂解液获取:实验前I天按照100万个293T或其他细胞铺细胞于10厘米细胞培养皿；18小时后将携带目的基因的阳性PCDNA3等表达重组质粒转染入293T细胞，进行重组蛋白的表达，具体过程为:10厘米细胞培养皿中，每IOug目的质粒；细胞37° C培养于10%胎牛血清+ DMEM细胞培养基中，孵育48小时后，胰酶法收集细胞，同时加入蛋白酶抑制混合物(Protease Inhibitor Mixture Set III), EDTA和2000活力单位的核酸酶；细胞裂解物提取过程为:将得到的细胞按照100万细胞每毫升PBS比例稀释，vertex混匀，放置液氮10分钟，常温溶解10分钟，如此反复冻融3次；4°C，2000g离心20分钟取上清； (3)CETSA检测:将得到表达标签蛋白的细胞裂解液进行CETSA检测；步骤(2)中获取的细胞裂解液，一部分加入适宜浓度的待测药物，另一部分加入抑制剂，室温孵育10?30分钟后，将细胞悬液等分成50 yl，分别在不同温度下加热3-10分钟；然后将细胞提取物再次20000g，4° C离心20分钟，分离得到的上清液，弃去不溶性沉淀；然后取IOiU样品进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immune sorbent assay, ELISA) ;ELISA 实验最终得到各药物-蛋白孵育作用后的吸光度值；该吸光度值与CETSA最低的药物-蛋白孵育温度直接相关，据此绘制CETSA曲线和ITDRFCETSA (等温量效反应指纹图谱)； (4)高通量标签抗体的ELISA扫描和数据统计分析:在构建的人类全基因组表达质粒库的基础上，对多种药物、多种靶标蛋白的高通量分析；得到的CETSA数据(ELISA得到的吸光度值)用于分析；CETSA数据和相应的ITDRFCETSA数据进行s形(可变斜率)曲线拟合；或者计算药物对蛋白的半数抑制浓度(IC50),通过Lineweaver Burk曲线得到药物对蛋白的抑制常数Ki。
【文档编号】C12N15/66GK103645324SQ201310637870
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】胡朝阳, 房波 申请人:胡朝阳, 房波