专利名称：：兴国红鲤与“全红”体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别方法
技术领域：
：本发明属于遗传学领域，涉及两种红鲤的分子鉴别方法，具体地讲，涉及兴国红鲤(Cyrpinuscarpiovar.singuonensis)禾口"全纟工，，亍本色B^工彩鱼里(Cyrpinuscarpiovar.color)分子遗传鉴别方法。
背景技术：
：兴国红鲤(图1)分布于江西省兴国县，是我国优良的鱼类育种材料，参与构建了生产上许多具有较高经济价值和社会效益的杂交组合，产生了巨大的生产、经济价值和社会效益。瓯江彩鲤分布于浙江省瓯江流域，是一种养殖面积较为广泛，具有食用和观赏双重价值的多体色类型彩鲤。瓯江彩鲤目前已具有7种体色(5种原有的体色类型，2种近几年开发出来的新体色类型)。瓯江彩鲤除体色丰富外，在形态上与兴国红鲤十分相似，均为纺缍形。其中"全红"体色瓯江彩鲤(图2)的体表全身红色，从形态和体色上不能将其与兴国红鲤区别开来。表1为兴国红鲤与"全红"体色瓯江彩鲤外部形态可量性状的比例变化。表1兴国红鲤与"全红"体色瓯江彩鲤外部形态的可量性状比例<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>自上世纪70年代以来，对兴国红鲤开展了系统选育工作，它已成为一个优良的水产养殖品种，品种登记号GS01001-1996。自2000年以来，也对瓯江彩鲤开展了选育工作，目前已选育至第5代，即将选育成为一个水产良种。为保护两个鱼类良种的育种成果与知识产权，为以后养殖生产提供一种有效的品种鉴定方法，发明人在对通过多年的研究，发现这两种鱼在线粒体COII基因和tRNA一基因各存在一个特异性的单核苷酸差异位点(SNP)，可以用于它们的群体鉴定和品种区分。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种鉴别兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤的群体区分和品种鉴别方法。本发明所要解决的技术问题通过如下技术方案实现—种鉴别兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别方法，包括下列步骤(1)根据外部形态取出待鉴定的红鲤；(2)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA;(3)以提取的基因组DNA为模板，根据COII基因和tRNA一基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含C0II基因的第408位和tRNA一基因第16位核苷酸；(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；(5)检测SNP位点，进行结果判定(a)检测CO1I基因的第408位点(COII-408)，若该位点为核苷酸G，则为兴国红鲤；若该位点为核苷酸A，则为"全红"体色瓯江彩鲤；或者(b)检测tRNALys基因第16位点(tRNALys-16)来加以确证，若位点tRNA"M6为核苷酸T，则为兴国红鲤，若为核苷酸C，则为"全红"体色瓯江彩鲤。所述引物序列为C0II-tRNALys-F(5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA_3，)禾口C0II-tRNALys-R(5，-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA_3，)。还可以采用其它能进行PCR扩增的引物。COII基因和tRNA一基因的SNP位点如下表2所示表2C0II基因和tRNA"s基因的SNP位点<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>本发明方法是通过扩增红鲤线粒体DNA的COII基因和tRNA"s基因序列，检测这两个基因序列的单核苷酸多态性位点(SNP)而实现。本发明可有效、准确地进行鉴别兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤，从而为我国这两种红鲤的品种保护和遗传管理提供一种技术手段，具有极强的实用价值。图1是兴国红鲤的照片。图2是"全红"体色瓯江彩鲤的照片。具体实施例方式为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体例，进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1通过本实施例对本发明方法进行验证。(1)取兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤样本选取兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤各30尾，有足够数量，因此获得的结果具有统计学意义，准确可靠。(2)DNA提取取每尾鱼的尾鳍组织约0.2cm2，装入1.5ml的离心管中，加入400yLSTE缓冲液(30mmol/LTris_HCl，pH8.0，200mmol/LEDTA，50mmol/LNaCl)。混匀后加入浓度为10%的SDS90iiL和20mg/mL的蛋白酶K10yL，55"消化810h;加入等体积饱和酚于转轮上缓慢转动lh，10，000r/min离心8min，吸取上清液加入等体积的混合液(酚氯仿异戊醇=25:24:1);缓慢转动30min，以10，000r/min的速度离心8min，取上清液加入等体积的氯仿和异戊醇混合液(氯仿:异戊醇=24:1)，缓慢转动5min，10，000r/min离心5min，取上清液后，加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，再用70%的乙醇洗涤，干燥，加入300yL的TE液溶解备用。(3)PCR扩增与产物克隆、测序根据已有鲤线粒体基因组全序列，设计一对用于扩增COII基因和tRNA一基因的引物，引物序列为COII-tRNALys-F(正向引物)5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA-3'和COII-tRNALys-R(反向引物)5'-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA-3'。以提取的DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体积为50yL，内含5iiLPCR缓冲液(1Ommol/LTris-HCL，pH9.0，50mmol/LKCL，30mmol/LMgCL2，0.01%的明胶)，2iiLdNTP混合液(每种dNTP0.lmmol/L)，4iiL的弓|物(0.2iimol/L)，2iiL基因组DNA(50ng/ii1)，2iiLTaq酶(2IU)，35yL的蒸馏水。扩增反应条件为94。C预变性5min，接下来进行30个循环，每个循环包括94°C30s，54°C30s，72°Clmin，30个循环后，72。C延伸5min。扩增的目的序列产物以琼脂糖电泳检查，观察只有一条扩增产物片段。纯化PCR扩增产物，连接插入载体pUC18，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，筛选重组子进行内切酶酶切和PCR检验。然后选取重组子于3730型Bigdye-Terminator全自动测序仪上进行测序。(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对用BioEdit软件对测序结果进行重排和同源比较，与GenBank中的鲤线粒体DNA全序列(序列号NC_001606)对照，确定COII基因的启始位置和启始密码子ATG。在COII基因最后一个氨基酸的密码子GCC+T不完全终止子后(GCCT)，紧接着的是tRNA一基因的开始位点CGC。两种红鲤的COII基因和tRNA"s基因序列分别为SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。(5)筛选核苷酸变异位点查找上述单核苷酸变异位点，根据位点差异鉴定这两种红鲤。首先检测COII基因的第408位点(COII-408)，发现30尾兴国红鲤的该位点都为核苷酸G，30尾"全红"体色瓯江彩鲤的该位点都为核苷酸A。进一步检测tRNALys基因第16位点(tRNALys-16)来加以确证，发现30尾兴国红鲤的该位点为核苷酸T，30尾"全红"体色瓯江彩鲤的该位点都为核苷酸C。通过以上实施例表明，本发明方法对于鉴别兴国红鲤和"全红"体色瓯江彩鲤是准确可行的。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。序列表〈110〉上海海洋大学〈120〉兴国红鲤与"全红"体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别技术〈130>TXPI091938〈160>2〈210>1〈211>768〈212>DNA〈213>兴国红鲤〈400〉1ATGGCACACCCMCGCMCTAGGTTTCCMGACGCGGCCATACCCGTTATAGMGMCTT60CTTCACTTCCACGACCACGCATTMTMTTGTGCTCCTMTTAGCACTTTAGTGTTATAT120ATTATTACTGCMTGGTATCMCCAMCTTACTMTAMTATATTCTAGACTCCCMGM180ATCGAMTTGTATGMCCATTCTACCAGCCGTCATTTTAGTACTMTCGCCCTGCCCTCC240CTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAMTTMCGACCCTCACCTGACMTTAMGCMTA300GGACACCMTGATACTGMGTTACGAGTATACAGACTATGMMTCTAGGATTCGACTCC360TATATAGTACCMCCCMGACCTTGCCCCCGGACMTTCCGACTTCTGGAMCAGACCAC420CGMTAGTTGTTCCMTAGAATCCCCAGTCCGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA■CATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTAMMTGGACGCAGTCCCAGGACGACTAMT540CMGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGTGTTTTACGGACMTGCTCTGAMTTTGT600GGAGCTMTCACAGCTTTATACCMTTGTAGTTGMGCAGTACCTCTCGAACACTTCGM660MCTGATCCTCATTMTACTAGMGACGCCTCGCTAGGMGCTAMTATTGGACAMGCG720TTGGCCTTTTMGCCAMGATTGGTGATTCCCGACCACCTCTAGTGM768〈210>2〈211>768〈212>DNA〈213〉"全红"体色瓯江彩鲤〈400>2ATGGCACACCCMCGCMCTAGGTTTCCMCTTCACTTCCACGACCACGCATTMTMTTATTATTACTGCMTGGTATCMCCAMCTTATCGAMTTGTATGMCCATTCTACCAGCCCTACGCATCCTGTACCTTATAGACGAMTTGGACACCMTGATACTGMGTTACGAGTATTATATAGTACCMCCCMGACCTTGCCCCCCGMTAGTTGTTCCMTAGAATCCCCAGTCCATTCTTGAGCTGTTCCATCCCTTGGCGTACMGCCGCCTTTATTGCCTCACGCCCAGGGGGAGCTMTCACAGCTTTATACCMTTGTAMCTGATCCTCATTMTACTAGMGACGCCTTGGCCTTTTMGCCAMGATTGGTGATTCGACGCGGCCATACCCGTTATAGMGMCTT60GTGCTCCTMTTAGCACTTTAGTGTTATAT120ACTMTAMTATATTCTAGACTCCCMGM180GTCATTTTAGTACTMTCGCCCTGCCCTCC240MCGACCCTCACCTGACMTTAMGCMTA300ACAGACTATGMMTCTAGGATTCGACTCC360GGACMTTCCGACTTCTAGAMCAGACCAC420CGTGTCCTAGTATCTGCTGAAGACGTGCTA■MMTGGACGCAGTCCCAGGACGACTAMT540GTGTTTTACGGACMTGCTCTGAMTTTGT600GTTGMGCAGTACCTCTCGAACACTTCGM660TCGCTAGGMGCTAMCATTGGACAMGCG720CCGACCACCTCTAGTGM768权利要求一种鉴别兴国红鲤和“全红”体色瓯江彩鲤的分子遗传鉴别方法，包括下列步骤(1)根据外部形态取出待鉴定的红鲤；(2)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA；(3)以提取的基因组DNA为模板，根据COII基因和tRNALys基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含COII基因的第408位和tRNALys基因第16位核苷酸；(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；(5)检测SNP位点，进行结果判定(a)检测COII基因的第408位点(COII-408)，若该位点为核苷酸G，则为兴国红鲤；若该位点为核苷酸A，则为“全红”体色瓯江彩鲤；或者(b)检测tRNALys基因第16位点(tRNALys-16)来加以确证，若位点tRNALys-16为核苷酸T，则为兴国红鲤，若为核苷酸C，则为“全红”体色瓯江彩鲤。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述引物序列为C0II-tRNALys-F(5'-CATCACCTTGTCAAGGTGAAA_3，)和C0II-tRNALys-R(5，-CATGGTCAGTCTCAGGATTCA_3，)。全文摘要本发明涉及兴国红鲤(Cyrpinuscarpiovar.singuonensis)与“全红”体色瓯江彩鲤(Cyrpinuscarpiovar.color)的分子遗传鉴别方法，包括下列步骤(1)根据外部形态取出待鉴定的红鲤；(2)提取待鉴定的红鲤的基因组DNA；(3)以提取的基因组DNA为模板，根据COII基因和tRNALys基因设计引物以进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳，纯化和克隆，其中扩增片段包含COII基因的第408位和tRNALys基因第16位核苷酸；(4)测序扩增的目的DNA序列，进行序列比对；(5)检测SNP位点，进行结果判定。采用所述的方法可有效、准确地进行鉴别，从而为我国红鲤的遗传甑别、资源管理与保护提供一项技术手段，具有实用价值。文档编号C12Q1/68GK101787392SQ20091019743公开日2010年7月28日申请日期2009年10月20日优先权日2009年10月20日发明者王成辉申请人:上海海洋大学