专利名称：猪轮状病毒疫苗候选基因的原核表达及其真核表达载体的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因领域，具体涉及猪轮状病毒VP4、VP7疫苗候选基因的原核表 达及其真核表达载体的构建。
背景技术：
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus, PRV)属弧肠孤病毒科轮状病毒属成员，是引起 仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。PRV主要存在于病猪及带毒猪的消化道，随粪便排到外界环境后，污染饲料、净水、 垫草及土壤等，经消化道途径使易感猪感染。排毒时间可持续数天，严重污染环境，加之病 毒对外界环境有顽强的抵抗力，使轮状病毒(Rotavirus，RV)在成猪、中猪、仔猪之间反复 循环感染，长期扎根于猪场。因此，快速准确的诊断和有效免疫预防是本病防制的关键。病 毒外衣壳蛋白VP4和VP7是RV的主要免疫保护性抗原，由其刺激机体产生的抗体对中和病 毒、消除感染起主要作用；并且这两个基因的克隆及表达，对于制备新型疫苗和特异性诊断 抗原具有重要意义。近年来，国内外众多学者都深入开展了新型轮状病毒疫苗的研究工作，并取得了 新的进展，但是轮状病毒纳米疫苗的研制目前还没有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪轮状病毒VP4、VP7疫苗候选基因的原 核表达及其真核表达载体构建的方法，以克服现有技术的缺点和不足。为达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现所述猪轮状病毒VP4、VP7疫苗候选基因的原核表达及其真核表达载体的构建方 法，包括猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达、轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表 达载体PFastbacl重组载体的构建及转染，以及轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl 15 表达载体PPIC9K重组载体的构建。所述猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达的方法，具体如下从猪肺中提取总RNA，根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白 VP4基因核酸序列设计引物，经RT-PCR扩增得到猪VP4基因的编码区，插入pMD18_T载体 中；再经限制性内切酶BamHI和B10I双酶切，将回收的片段插入原核表达载体pGEX_4T_l 中，命名为PGEX-4T-1-VP4 ；重组质粒pGEX_4T-l_VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细 胞，经IPTG诱导、SDS-PAGE电泳分析，得到分子量为58KDa的重组融合蛋白；经超声破碎 后，SDS-PAGE电泳分析其为包涵体。所述轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl重组载体的构建 及转染方法，具体如下根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白VP4、VP7基因核酸序列设计引物，用RT-PCR方法扩增出PRV的核衣壳蛋白VP4、VP7基因；将得到的猪VP4、 VP7基因的编码区插入pMD 18-T载体中；再经限制性内切酶EcoRI和Β ο I双酶切，将 回收的VP4、VP7基因片段克隆到昆虫表达载体PFastbacl上，将重组质粒分别命名为 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 ；将 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 质粒分别转 化入DHlOBacl感受态细胞中，使其与辅助质粒发生转座重组；通过蓝白斑筛选、PCR鉴定 结果表明获得了含有轮状病毒基因的杆状病毒的阳性重组子；纯化该线性杆状病毒重组子 使其转染昆虫细胞，3d后收获重组病毒，根据细胞形态变化及PCR鉴定表明重组病毒转染 sf9细胞成功；收集病毒上清，将其含有VP4、VP7病毒上清分别命名为Al、Bl ；分别将Al、 Bl代病毒接种于sf9中，待细胞大量病变后收收集细胞，PCR鉴定为阳性病毒，其上清分别 命名为A2、B2代病毒。所述轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl 15表达载体PPIC9K重组载体的构建 方法，具体如下根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白VP4、VP7基因核酸序列 设计引物，用RT-PCR方法扩增出PRV的核衣壳蛋白VP4、VP7基因片段；将得到的猪VP4、 VP7基因的编码区插入pMD18-T载体中；再经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，将回收 的VP4、VP7基因片段克隆到酵母细胞表达载体PPIC9K上，将其命名为PPIC9K-3-VP4、 PPIC9K-3-VP7。所述猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达的方法在蛋白的大量纯化中的应用。所述轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl重组载体的构建 及转染方法在昆虫细胞sf9中蛋白表达及疫苗的研制中的应用。所述轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl 15表达载体PPIC9K重组载体的构建 方法在毕赤酵母细胞中表达蛋白中的应用。本发明选取编码VP4的基因片段，采用带有GST标签序列的pGEX-4T-l原核表达 载体，获得了表达。GST促进融合蛋白的表达，使GST和VP4共同被诱导表达。在GST与VP4 蛋白之间存在凝血酶酶切位点，可以将GST从融合蛋白中切除，从而进一步纯化目的蛋白， 这为下一步猪轮状病毒疫苗研究奠定基础。本发明所表达的目的蛋白是以包涵体的形式表达于细胞质中。这种方式可以获得 大量目的蛋白，但是因以包涵体形式存在的目的蛋白在翻译过程中不能正确折叠，而且翻 译后不能经过糖基化，故很少具有生物活性。包涵体只有在体外经过充分变性、复性重折叠 后才能恢复正常的生物活性。蛋白经简单变性、洗涤和复性后可作抗原用。本发明对PRVVP4、VP7基因的克隆和杆状病毒转染成功，为以后VP4、VP7基因在昆 虫细胞sf9中的表达奠定了基础。获取的基因除了可以用于PRV基因结构和不同血清型间 基因差异的研究，还可以用于制备探针检测PRV和进行RV分型。该基因的真核表达产物具 备天然的蛋白特性，可以作为检侧PRV特异性的诊断抗原以及多血清型基因工程疫苗的必 备成分，避免了以活病毒做抗原和疫苗的局限性和危险性。同时，VP4、VP7基因的克隆与表 达，为进一步研究PRV的分子生物学特性奠定了基础。本发明对PRV VP4、VP7基因在PPIC9K质粒的克隆成功，为以后VP4、VP7毕赤酵母 GS15细胞中的表达奠定了基础。目的基因在毕赤酵母GS115中表达可以克服在大肠杆菌 中表达蛋白修饰不足而影响其功能的缺陷，同时在毕赤酵母GS115中蛋白表达相对于昆虫细胞表达等其他真核细胞表达的费用相对较低，适合大规模的发酵培养表达、生产目的 蛋白，为以后疫苗的生产开辟途径。但其表达的蛋白在功能与在哺乳动物细胞及昆虫细胞 表达的蛋白之间有无差距还有待于进一步研究。获取的基因除了可以用于PRV基因结构和 不同血清型间基因差异的研究，还可以用于制备探针检测PRV和进行RV分型。同时，VP4、 VP7基因的克隆与表达，为进一步研究PRV的分子生物学特性奠定了基础。
图1为PRV VP4基因PCR扩增结果，其中M :DNA marker DGL 2000，1 阴性对照， 2 :VP4基因PCR产物。图2为PMD18-T-VP4菌落PCR筛选结果，其中M :DGL 2000，1-4 菌落PCR产物。图 3 为 PMD18—T-VP4 测序结果。图4为PGEX-4T-1-VP4菌落PCR筛选结果，其中M :DGL 2000，1-4 菌落PCR产物。图5为重组载体和轮状病毒VP4基因检测结果，其中M Ikb DNAladder Marker, 1 :PGEX-4T-lBamH I and XhoI 酶切，2 :PGEX-4T-l_VP4BamH I and XhoI 酶切，3 :VP4PCR产 物。图6为IPTG诱导蛋白检测结果，其中M 低分子量标准蛋白；1 =GST, 2-3 PGEX-4T-1-VP4诱导结果；4未诱导菌。图7为IPTG诱导蛋白检测结果，其中M 低分子量标准蛋白；1_3分别为;3h、4hjh 诱导结果；4-5 超声离心后沉淀和上清。图8为PMD18-2-VP4菌落PCR筛选结果，其中M :DL 2000 ； 1-2 菌落PCR产物。图 9 为 PMD 18-2-VP7 酶切检测结果，其中 M :DL 2000 ；1-2 :PMD18-2_VP7EcoRI 和 XhoI酶切。图 10 为 PFastbacl-2_VP4 菌落 PCR 筛选结果，其中 M :DL 2000 ； 1-4 菌落 PCR 产 物。图 11 为 P! astl3acl-2-VP7 菌落 PCR 筛选结果，其中 M :DL 2000 ;1_4 菌落 PCR 产 物。图12为重组质粒酶切检测结果，其中M :1KB Ladder DNA Marker, 1 PFastBacl-2-VP7EcoRI 和 XhoI 酶切；2 :PFastbacl-2_VP4EcoRI 和 XhoI 酶切。图 13 为 PFastBacl-2_VP4，PFastBacl-2_VP7 酶切检测结果。图14VP7测序检测结果。图15为sf9单层对照细胞。图16为sf9单层转染细胞。图17为VP4病毒液PCR检测结果。图18为VP7病毒液PCR检测结果。图19为PPIC9K-VP4基因PCR扩增结果。图20为PPIC9K-VP7基因PCR扩增结果。图 21 为 PPIC9K-3-VP4 和 PPIC9K-3-VP7 菌落 PCR 筛选结果。图22为重组质粒酶切检测结果。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。实施例1猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达1.材料1.1病料、菌株及质粒病料PRV肺组织，本实验室保存。菌株感受态细胞T0P10、BL21 (DE3) (gen印low Ltd)。质粒质粒载体pMD 18-T Vector购自宝生物工程(大连)有限公司，原核表达载 体PGEX-4T-1质粒由山东农业大学动物遗传实验室惠赠。1. 2酶和主要试剂酶AMV反转录酶、rTaq DNA聚合酶购自宝生物工程(大连)有限公司；限制性内 切酶BamHI，Xhol等购自NEB公司。主要试剂TRNZOL-A+购自天根公司；RNA酶抑制剂RNase、DNAMarkerDL2000.DNA Marker DL10000、小量胶回收试剂盒(Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0)，均购 自宝生物工程(大连)有限公司；蛋白胨、酵母提取物购自OXXID LTD。Tris碱购自鼎国； Goldview染料购自赛百盛。1. 3抗生素氨苄青霉素用ddH20配制成100mg/ml，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C保存备用； 卡那霉素(Kan)用ddH20配制成100mg/ml，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C保存备用；庆 大霉素(Gen)用ddH20配制成7mg/ml，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，-20°C保存备用；四环素 (Tet)用ddH20配制成10mg/ml，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C保存备用。1. 4X-gal用N，N- 二甲基甲酰氨配制成100mg/ml，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C避光保存备用。1. 5IPTG用ddH20制成100mol/L，用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C避光保存备用。1. 6主要仪器设备Sigma低温离心机，BIO-RAD PCR扩增仪，DYY-III稳压稳流电泳仪(北京六一仪 器厂)，HZS-H水浴振荡器，37°C恒温培养箱，紫外凝胶成像分析系统(UVP公司，英国)，紫 外分光光度计(Pharmacia BiotechINC)，SK-1涡旋快速混勻器等。2.方法2. IPRV肺组织中RNA的提取RNA提取按TRNZOL-A+提取总RNA说明书进行。2. 2PRV-VP4 基因 RT-RCR 扩增2.2. 1引物的设计与合成根据Genebank上公布的PRV-VP4基因序列设计一对引物，并引入BamHI，Xhol位 点，标记为VP4-F、VP4-R，其序列如下，斜体为酶切位点。预期扩增VP4基因产物长度为 881bp，引物由上海生物工程有限公司合成。VP4-F/R 序列
VP4-F-AGCAGGATCCATGGCTTCGCTCATTTATAGACAVP4-R-TAACCTCGAGTAACCTCGAGGACCATTTATAACCCAATCC2. 2. 2 反转录20 μ 1反应体系如下PRV 病毒 RNA5. 0 μ 15 X Reverse transcriptase Buffer 4. 0 μ 1dNTP Mixture (IOmmo 1/L)Ι.ΟμΙVP4-R(10ymol/L)Ι.ΟμΙRNase 抑制剂Ι.ΟμΙAMV Reverse Tanscriptase (5U/μ L) Ι.ΟμΙDEPC 处理水7· O μ 1在冰上混合后，室温lOmin，42°C Ih后冰上冷却2_;3min ；_20°C保存备用。2. 2. 3PCR 反应PCR 反应体系(50 μ 1)模板(cDNA)2. O μ 110 X Buffer (Mg2+free)5. O μ 1MgSO44· O μ 1dNTP (IOmM)Ι.ΟμΙVP4-F(10yM)2. O μ 1VP4-R(10yM)2. O μ 1rTaq g|0. 5 μ 1ddH2033. 5 μ 1在冰上混合。PCR反应条件94°C预变性:3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸90s，循环 35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中IOOV电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2.3目的片段的回收按小量胶回收试剂盒说明书进行目的片段的回收。2. 4感受态细胞的制备用CCMB80化学法制备感受态细胞，菌种为大肠杆菌E. Coli TOPlO及BL21 (DE3)。2. 5PMD18-T与目的片段的克隆2. 5. 1连接T载体在10 μ 1体系下，按pMD 18-T载体连接试剂盒说明如下PMD18-T1 μ 1VP44μ 1SlutionI5μ 1于冰上混合后，16°C连接过夜。2. 5. 2 转化
(1)将T0P10感受态细胞从_70°C冰箱内取出，快速融化，冰浴15min。0)5 μ 1连接产物加100 μ 1 Τ0Ρ10感受态中，冰浴30min。(3)42°〇热激9086(；，冰浴 1 2min。(4)加800 μ 1无抗生素的LB液体培养基，37°C摇床上培养1小时。(5)4500r/min离心％iin，预留200 μ 1左右上清悬浮沉淀，取100 μ 1均勻涂布于 含IPTG、X-gal和Amp的LB琼脂平板上。(6) 37°C先正置培养30min再倒置培养14 16h。2. 5. 3阳性质粒克隆筛选在PCR管中各加入17. 2μ 1的ddH20，用接种环挑取白色菌落接到含有17. 2μ 1的 ddH20的PCR管中，沸水煮5min，低速离心后冰浴，以此做模版。PCR反应体系(25 μ 1)如下模板17. 2μ1IOXBuffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgC12(25mM)2. 0 μ 1dNTP (IOmM)Ι.ΟμΙrTaq(5U/l)酶0. 3 μ 1VP4-F(10yM)Ι.ΟμΙVP4-R(10yM)Ι.ΟμΙPCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，循环 35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况，并拍照保存，阳性克隆命名为PMD18-T-VP4。2. 5. 4阳性克隆的序列测定挑取一个阳性菌落接种于3ml含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养12_14h 后送上海生物工程有限公司测序。2. 6目的基因的原核重组表达载体的构建和鉴定2. 6. 1 原核表达载体 pGEX-4T-l载体pGEX-4T-l的启动子为tac启动子，具有Amp抗性，诱导表达的蛋白以GST形 式表达。2. 6. 2 抽提质粒 PMD18-T-VP4，pGEX_4T_l用小量质粒回收试剂盒提取质粒。2. 6. 3酶切1)PMD18-T-VP4质粒酶切体系如下质粒20. Ομ IOXbuffer 3. 0 μ 110XBSA3. 0 μ 1BamHI2. 0 μ 1XhoI2. 0μ 1加水至40μ 1，37°C水浴3-4小时。2) pGEX-4T-l质粒酶切体系如下0138]质粒0139]IOXbuffer0140]10XBSA15. 0μ 1 3. Ομ 1 3. Ομ 1 2. Ομ 1 2. Ομ 10141]BamHI0142]XhoI加水至40μ 1，37°C水浴3-4小时。用胶回收试剂盒分别回收目的片段，方法同2. 3。2. 6. 4 连接酶切纯化回收后的pGEX-4T-13 μ 1，VP4 基因产物 5 μ 1, Buffer for T41ul, T4 连 接酶1μ1，16 连接过夜。2. 6. 5 转化连接物转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，步栾同2. 5. 2。2. 6. 6阳性重组质粒筛选鉴定1)菌落PCR筛选在PCR管中各加入17. 2μ 1的ddH20，用接种环挑取白色菌落接到含有17. 2μ 1的 ddH20的PCR管中，沸水煮5min，低速离心后冰浴，以此做模版。PCR反应体系(25 μ 1)如下模板17. 2μ110 X Buffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgCl2 (25mM)2. 0 μ 1dNTP(IOmM)1. 0μ 1r^TaqGU/yl)酶0· 3 μ 1VP4-F(10yM)1. 0μ 1VP4-R(10yM)1. 0μ 1PCR反应条件94"C预变性5min，94°C变性30s，60"C退火30s，72°C延伸60s，循环 35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况，将含有该目的片段的质粒命名为PGEX-4T-1-VP4。2)阳性重组质粒酶切鉴定质粒pGEX-4T-l-VP45. 0 μ 1IOXbufferΙ.ΟμΙ10XBSAΙ.ΟμΙBamHI0. 5 μ 1XhoI0. 5μ 1ddH202 μ 1反应总体积为10 μ 1，37°C，水浴3小时。取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶 中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶成像系统观察扩增情况。3)pGEX-4T-l-VP4阳性重组质粒测序挑取一个阳性菌落接种于3ml含Amp的LB液体培养基中，37°C振荡培养12_14h后送上海生物工程有限公司测序。2. 7 重组菌 pGEX-4T-l-VP4 诱导表达(1)挑取阳性重组菌pGEX-4T-l-VP4的单菌落，接种于3mL含Amp (50 μ g/μ 1)的 LB液体培养基中，于37°C摇床中200rpm过夜培养。(2)按1 100稀释到含Amp的LB液体培养基中，37°C 200rpm振摇培养至对数生 长期0D600约0. 5-0. 8，加入终浓度为1. OmM的IPTG，其中有一管未加IPTG作为对照。(3) 370C 200r/min振摇诱导培养3、4、釙后分别收集菌液。2. 8表达蛋白的SDS-PAGE电泳(1)各取出200μ 1菌液4500rpm离心4min，弃上清。(2)菌体沉淀用200μ IddH2O洗一次，4500rpm离心％iin，弃上清。(3)沉淀各用 20 μ 1 的 ddH20 溶解，加入 20 μ 1 2 X protein loading buffer (还 原型)，沸水煮5min，取20ul左右上样。(4)80伏电压电泳20-3011^11后加大电压至120伏到电泳结束。(5)用考马斯亮蓝染液浸泡凝胶，在脱色摇床上染色约1小时。(6)染色液回收，凝胶用水冲洗后，加入脱色液，在摇床上平缓摇动脱色至条带显 现。2. 9重组蛋白可溶性分析挑取阳性重组菌的单菌落，接种于3mL含Amp的LB液体培养基中，37°C活化过夜 后，1 100稀释到IOOml含Amp的LB液体培养基中，37°C 200r/min振摇培养至对数生长 期0D600约0. 5-0. 8，加入终浓度为1. OmM的IPTG，37°C 200r振摇诱导培养4- 收集菌体。将菌体用20ml PBS洗2次，然后用PBS悬浮细菌，经超声波裂解，12000r离心 15min,沉淀也用20ml PBS溶解，分别取适量超声后上清和沉淀加2倍上样缓冲液，煮沸裂 解5min，用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE检测。3.结果分析3. 1PRV-VP4 蛋白基因的 RT-RCR 扩增猪轮状病毒(PRV)肺组织所提取的RNA，经RT-PCR扩增，得到一段约890bp的片 段，与预期结果一致，见图1。3. 2PMD18-VP4 菌落 PCR 检测结果挑4个白色菌落PCR检测结果，有两个菌落为阳性，得到一段约890bp的片段，与 预期结果一致，见图2。3. 3阳性克隆的测序结果VP4基因PCR产物与PMD 18-T连接转化后，筛选的阳性克隆测序结果如下，从中可 以看出此基因已成功引入了 BamHI (GGATCC)，XhoI (CTCGAG)酶切位点，结果如图3所示。3. 4重组原核表达载体的菌落PCR筛选与酶切鉴定PMD18-T-VP4质粒与原核表达载体pGEX_4T_l经BamHI和XhoI酶切、回收、连接 后，通过菌落PCR鉴定，结果4个菌落有3个为阳性，PCR产物大小为890bp，如图4所示。所得的重组质粒pGEX-4T-l-VP4经BamHI和XhoI酶切鉴定，结果出现约5000bp 和890bp的条带，为阳性质粒，如图5所示。
3. 5pGEX-4T-l阳性克隆的测序结果VP4基因PCR产物与pGEX_4T_l连接转化后，筛选的阳性克隆测序结果与3. 3相 同，从中可以看出此基因已成功引入了 BamHI (GGATCC)，XhoI (CTCGAG)酶切位点。3. 6重组菌诱导表达重组菌pGEX-4T-l-VP4经IPTG诱导4h后，10 % PAGE的SDS-PAGE电泳分析，所得 重组融合蛋白的分子量约58KDa，其中GST大小为^KDa,目的蛋白大小约为32KDa，与预期 结果相同，见图6所示。3. 7重组蛋白可溶性分析重组菌pGEX-4T-l-VP4经IPTG分别诱导3、4、5h，于3、4、5h时分别收集菌液，10% 的SDS-PAGE电泳分析，诱导3、4、证蛋白表达量相差不大。重组菌体超声裂解后，经10% 的SDS-PAGE电泳分析，目的蛋白在超声后沉淀中，上清液中没有，说明重组蛋白为包涵体， 见图7所示。实施例2轮状病毒基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl重组载体的构建及转 染1.材料1.1病料、菌株及质粒病料猪肺组织(PRV)菌株同实施例1细胞昆虫细胞sf9由本实验室保存(Invitrogen)。质粒昆虫表达载体PFastbacl由本实验室保存，其余同实施例1。1. 2酶和主要试剂酶K0D-Plus酶购自硕盟生物，其余同实施例1。主要试剂同实施例1。1.3培养基及试剂配制SFX-insect培养基购自大连宝生物公司。其余同实施例1。1.4主要仪器设备同实施例1。2.方法2. IPRV肺组织中RNA的提取同实施例1。2. 2引物的设计与合成根据Genebank上公布的猪轮状病毒VP4、VP7基因序列设计一对引物，并引入 EcoRI，XHOI位点，上游序列弓丨入GCCACCATGG序列。下游序列引入6个组氨酸序列，标记为 2-VP4-F、2-VP4-R ；2-VP7_F、2_VP7-R序列如下，斜体为酶切位点。重组载体转座重组后检 测引物标记为M13-F、M13-R。引物由上海生物工程有限公司合成。昆虫细胞sf9细胞表达载体扩增引物2-VP4-F :CGCAGAATTCGCCACCATGGCTTCGCTCATTTATAGACA2-VP4-R :ATCTCTCGAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGACCATTTATAACCCAATCC2-VP7-F :CGCAGAATTCGCCACCATGGATGGTATTGAATATACCACAG
2-VP7-R :ATCTCTCGAGCTAGTGATGGTGATGGTGATGTACTCTGTAATAAAATGCAGCM13-F :GTTTTCCCAGTCACGACM13-R :CAGGAAACAGCTATGAC2. 3反转录PRV病毒RNA5. Ομ 15 X Reverse transcriptase Buffer4. Ομ 1dNTP Mixture (IOmmo1/L)1· 0μ 12-VP4/VP7-R(10ymol/L)1· 0μ 1RNase抑制剂1· 0μ 1AMV Reverse Tanscriptase(5U/μ L)2. 0μ 1DEPC处理水5. 0μ 1反应体系在冰上混合后，室温10min，42°C Ih后冰上冷却2_;3min ；_20°C保存备用。2. 4PCR反应PCR反应体系(50 μ 1)模板(cDNA) 2. 0 μ 110 X Buffer (Mg2+free) 5. 0 μ 1MgSO4 4· 0 μ 1dNTP (2mM) 5. 0 μ 12-VP4/VP7-F(10yM) 2. 0 μ 12-VP4/VP7-R(10yM) 2. 0 μ 1KOD-Plus 酶(1U/μ L) 2. Ομ 1ddH20 28. Ομ 1在冰上混合。PCR反应条件94"C预变性3min，94°C变性30s，60"C退火30s，68"C延伸90s，循环35次，最后68°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2. 5PMD18-T-2-VP4/VP7 构建2. 5. IPCR 产物沉淀:KOD-Plus酶扩增的PCR产物加十分之一体积的乙酸钠再加2. 5倍的无水乙 醇，-20°C放置1-2小时，12000rpm离心lOmin，弃上清，70%的乙醇洗一次，烘干，30 μ 1的 ddH20溶解沉淀。2. 5. 2 加 A 尾反应反应体系(25μ 1)模板5. 0 μ 110 X Buffer (Mg2+free) 2. 5 μ 1MgCl2(25mM)1. 5μ 1dATP (IOOmM)0. 5 μ 1BSA (0. 1% )5. 0 μ 1
rTaq 酶0. 3 μ 1ddH2010. 2μ 1PCR产物与反应体系在冰上混合后，72°C lh,加A反应后产物用胶回收试剂盒回 收，方法同实施例1。2. 5. 3PMD18-T 与 PCR 产物连接方法同实施例1。2. 5. 4 转化连接物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，步栾同实施例1。2. 5. 5阳性克隆质粒挑菌筛选鉴定方法同实施例1，筛选出的阳性重组菌将其命名为PMD18-2-VP4和PMD18-2-VP7。2. 5. 6质粒抽提方法同实施例1。2. 5. 7酶切鉴定质粒PMD18-2-VP4 和 PMD18-2-VP7 酶切体系如下质粒5. 0 μ 1IOXbufferΙ.ΟμΙ10XBSA Ι.ΟμΙEcoRI 0. 5 μ 1Xhol0. 5μ 1ddH20 2 μ 1反应总体积为10μ 1，37°C，水浴3小时，取5μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中 IOOV电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶成像系统观察扩增情况。2. 6PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 载体构建2. 6.1 酶切质粒PMD18-T-2-VP4 和 PMD18-T-2-VP7 酶切体系如下质粒20. 0 μ 1IOXbuffer4. 0 μ 110XBSA4. 0 μ 1EcoRI2. 0 μ 1XhoI2. Ομ 1加水至40 μ 1，37°C水浴3-4小时。PFastbacl质粒酶切体系如下质粒15. Ομ IOXbuffer3. O μ 1IOXBSA3. O μ 1EcoRI2. O μ 1XhoI2. Ομ 加水至30 μ 1，37°C水浴3_4小时，用胶回收试剂盒分别回收目的片段酶切4 μ g阳 性质粒，方法同实施例1。
2. 6. 2酶切产物回收用小量胶回收试剂盒，同实施例1。2. 6. 3PFastbacl载体与目的基因连接PFastbacl酶切回收产物3 μ 1，PCR酶切回收产物5 μ 1，T4buffer 1 μ 1，T4连接 酶1 μ 1 (总体积lOul)，16°C连接过夜。2. 6. 4 转化取5μ 1连接产物加到lOOulTOPIO感受态细胞中，同实施例1。2. 6. 5阳性质粒筛选同实施例1，筛选出的阳性重组菌将其命名为Pi^stl3aCl-2-VP4、 PFastbacl-2-VP7。2. 6. 6阳性重组菌序列测定PFastbac 1-2-VP4,PFastbac 1-2-VP7 阳性菌落经 LB 液体培养基培养 14_16h 后送 上海桑尼科技有限公司测序鉴定。2. 7PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 转座重组载体构建重组载体转入DHlOBacl感受态细胞后，与细胞内其中一辅助质粒发生转座重组。2. 7. IDHlOBac感受态细胞的制作方法同实施例1。2. 7. 2重组质粒转化与转座方法同实施例1。2. 7. 3重组菌落PCR鉴定筛选取20 μ L菌液3000rpm离心!Bmin后，加ddH20,100°C水浴5min，最后低速离心使液 体集中离心管底部。用转座重组后载体固有引物M13-F、M13-R以此做模板进行PCR反应。体系(25μ L)如下:模板17. 2μ110 X Buffer (Mg2+free)2. 5 μ 1MgSO44· 0 μ 1dNTP (IOmM)1·0μ1r^TaqGU/yL)酶0. 3 μ 1M13-F(10yM)1·0μ1M13-R(10yM)Ι.ΟμΙPCR 反应条件94°C预变性 3min，94°C变性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 5min，循 环35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2. 7. 4重组质粒抽提方法同实施例1。2. 7. 5重组质粒PCR鉴定筛选PFastbac-VP4和VP7转座重组质粒稀释10倍后取1 μ L做模板，引物M13-F、 2-VP4-F分别与M13-R组合检测VP4转座重组质粒；M13-F、2_VP7_F分别与M13-R组合PCR检测VP7转座重组质粒。模板IOXBuffer (Mg2+free)MgCl2dNTP (IOmM)rTaq (5U/ μ L)酶2-VP4/2-VP7/M13-F(10 μ Μ)M13-R(10yM)1.0μ 1 2. 5μ 12.5μ 1 1. Ομ 1 0. 3μ 1 1· Ομ 1 1· Ομ 1PCR 反应条件94°C预变性 3min，94°C变性 45s，55°C退火 45s，72°C延伸 5min，循 环35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中IOOV电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2. 8昆虫细胞转染2. 8. 1昆虫细胞sf9复苏(1)现将lOmlSFX-insect昆虫细胞培养基转移至25cm2培养瓶中，然后加入10% 血清，于27°C培养箱中预热待用。(2)从液氮中取出细胞管，置37°C水浴中轻轻搅动使其快速融化。
(3)当管内细胞融化后，迅速用75 %酒精棉球擦拭清洁管壁，干燥后置于冰浴中。(4)直接将细胞悬浮液转移至准备好的25cm2培养瓶中，于27°C无CO2培养箱中孵 育池，使细胞贴壁。(5)吸弃上清，加入新鲜SFX-insect昆虫细胞无血清培养基培养3_4天，细胞恢复 好后，用于细胞传代培养。2. 8. 2昆虫细胞sf9培养Sf9细胞在复苏培养开始的Mh内，换两次SFX-insect无血清培养基，3_4天后 细胞长至90%铺满培养瓶壁时，超净台中，吸弃旧的培养基，加入Iml培养基用无菌吸管吹 打贴壁细胞，使成细胞悬浮状态。吸弃0. 7ml悬浮液，留0. 3ml于瓶中，同时加入IOml新鲜 的培养基，于27°C CO2的培养箱中培养，3-4天后，继续同法传代。2. 8. 3昆虫细胞sf9冻存(1)在倒置的显微镜下观察，观察细胞处于对数生长期，切贴壁率达90%以上。(2)以lmlSFX-insect培养基吹打贴壁细胞，使细胞悬浮％ ；然后转移到离心管中 IOOOrpm离心4min，吸弃上清，加入Iml含有30% FBS和10% DMSO的SFX-insect培养基， 使细胞重新悬浮。(3)现将细胞于4°C冰箱中预冷15-30min，迅速转移入-20°C冰箱中，30min-lh，再 转移入液氮罐上层(约-80°C )过夜，最后使其没入液氮中长期保存。2. 8. 4重组质粒转染sf9昆虫细胞株(1)倒置显微镜下观察细胞生长良好，每个视野至少90%细胞贴壁率，在六孔板 中接种约9\105个细胞于^115 乂-^1紹(^无血清培养基中，271培养箱中使细胞贴壁lh。(2)在无菌管中配液溶液A 每次转染，稀释1 μ g质粒约1 μ 1于99 μ 1的不含抗生素的SFX-insect培养基中。溶液B 稀释6 μ 1 cellfectin转染试剂于94 μ 1的不含抗生素的SFX-insect培养基中。(3)混合两种溶液，轻轻混勻，室温孵育15-45min。(4)用2ml不含抗生素的培养基洗孔一次。(5)在A、B混合物中加入0. 8mlSFX-insect培养基轻轻混勻，从六孔板吸出洗液 后覆盖上述Iml混合物，27°C、无(X)2培养细胞证。(6)移去转染混合物并用培养基洗孔2次，加入aiilSFX-insect培养基，继续培养 24-72h。(7)从培养24h开始，每隔24h在倒置显微镜下观察细胞形态，并与没有转染的正 常细胞作对照。初步判断细胞转染成功与否。待细胞变大脱落并开始破碎时。收集上清， 并低速离心除去溶液中细胞及其碎片。上清液可于4°C避光保存待用，也可于-70中长期保 存待用。含有VP4病毒上清记为Al ；含有VP7病毒上清记为Bi。2. 8. 5PCR鉴定重组病毒将收集Al、Bl的病毒上清取出约100μ 1煮沸5min，冰浴仍却后，7000rpm离心 IOmin,取上清作模板进行PCR检测，25 μ IPCR反应体系如下模板2. 0μ 1IOXBuffer (Mg2+free)2. 5μ 1MgCl2 (25mM)4. 0μ 1dNTP(IOmM)1. 0μ 1rTaq(5U/μ L)酶0. 3μ 12-VP4/VP7-F(10yM)1. 0μ 12-VP4/VP7-R(10yM)1. 0μ 1加水至25 μ 1，在冰上混合。PCR反应条件:94°C预变性:3min，94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸90S，循环35次，最后72°C延伸IOmin0取5 μ 1扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2. 8. 6重组杆状病毒感染正常细胞观察细胞形态，待细胞大量脱落并开始裂解时，收集细胞及上清混合液，IOOOrpm 离心^iin后。取100 μ L、10 μ L、1 μ L病毒液分别加入6孔板中正常的细胞中，含有VP4的 3孔病毒上清分别极为Α2-1、Α2-2、Α2-3 ；含有VP7的3孔病毒上清分别记为Β2-1、Β2-2、 Β2-3。每隔24h观察细胞形态。待细胞出现变形脱落并开始裂解时，收集细胞并用A2-3、 B2-3上清做PCR检测。体系及反应条件同上3. 2. 8. 5。2. 8. 7病毒液保存将鉴定为阳性的病毒液，加2%胎牛血清后，与4°C避光保存；如果长期保存要放 于-70°C冰箱中。3.结果分析3. 1PRV-VP4、VP7 基因的 RT-RCR 扩增
PRV肺组织所提取的RNA，经RT-PCR扩增，分别得到约910bp的VP4基因片段和 IOlObp的VP7片段，与预期结果基本一致。3. 2菌落PCR筛选结果PCR产物先用乙醇沉淀后，经过加A尾后，与PMD18-T载体连接转入T0P10大肠杆 菌后，PMD18-2-VP4挑2个白色菌落进行PCR，PMD18-2-VP7挑4个白色菌落PCR检测。结 果？1 18-2-￥ 42个白色菌落？0 得到一段约91(^ 的片段；全为为阳性；PMD18-2-VP74个 白色菌落有3个白色菌落为为阳性，得到一段约IOlObp的片段，与预期结果一致。结果见 图8。3. 3PMD18-2-VP4/VP7 质粒酶切检测分别选取两个阳性菌落，接入LB液体培养基培养过夜后，抽提质粒。EcoRI和B10I 内切酶进行双酶切检测。结果PMD18-2-VP4经EcoRI和BioI酶切后，只有一个为阳性，产 生2条约2600bp和9 IObp的条带。PMD18-2-VP7经EcoRI和XhoI酶切后，2个质粒全为阳 性，产生2条约^OObp和IOlObp的条带。结果证明成功引入了 EcoRI和BioI酶切位点， 结果见图9。3. 4阳性重组质粒的PCR鉴定选取阳性质粒后，PMD18-2-VP4/VP7质粒和PFastBacl质粒分别用EcoRI和XhoI 内切酶进行双酶切后，分别用胶回收试剂盒回收目的片段。回收后用T4连接酶进行连接， 然后转化入TOPlO大肠杆菌中，分别挑去4个菌落用PCR方法进行初步检测，结果4个菌落 全为阳性，结果见图10和11。3. 5阳性重组质粒的酶切鉴定分别选取两个阳性菌落，接入LB液体培养基培养过夜后，抽提质粒。EcoRI和 XhoI内切酶进行双酶切检测。结果PFastBacl-2-VP4经EcoRI和BioI酶切后，产生2条约 5200bp 和 910bp 的条带。PFastBacl-2_VP7 经 EcoRI 和 XhoI 酶切后，产生 2 条约 5200bp 和IOlObp的条带。结果证明2个质粒全为阳性，并成功引入了 EcoRI和B10I酶切位点，结 果见图12。3. 6阳性重组质粒测序结果PFastBacl-2-VP4和i^astBacl-2-VP7经PCR和酶切鉴定为阳性后，送上海桑尼科 技有限公司测序鉴定。筛选的阳性克隆测序结果如下，其中包含Kozak序列、6个组氨酸序 列以及引入的EcoRI和XhoI酶切位点。3. 7重组质粒转座重组后菌落PCR筛选分别挑取9个白色和1个蓝色菌落进行菌落PCR鉴定，结果PFastBaCl-2-VP4菌 落有7个明显为阳性有一条约3200bp大小的条带，对照蓝斑产生约300bp大小条带，可初 步判定这7个菌落为阳性；FastBacl-2-VP7菌落有6个明显为阳性有一条约3300bp大小的 条带，对照蓝斑产生约300bp大小条带，可初步判定这6个菌落为阳性。结果见图13、14。3. 8阳性转座重组质粒PCR鉴定分别选取两个经PCR鉴定为阳性的菌落，培养抽提质粒后，稀释10倍后做模板， 引物M13-F、2-VP4-F分别与M13-R组合检测PFastBacl-2_VP4转座重组质粒，分别产生约 3300bp 和 1440bp 大小条带；M13-F、2_VP7_F 分别与 M13-R 组合 PCR 检测 PFastBacl_2_VP7 转座重组质粒，分别产生约3400bp和1540bp大小条带，结果与预期结果基本一致。
3. 9PFastBacl-2-VP4/VP7转座重组质粒杆状病毒转染sf9昆虫细胞转染后，分别与Mh、48h、96h、120h对照观察正常细胞和转染细胞形态变化，4 时，对照细胞形态基本没有变化，除少量细胞变形死亡外，其他细胞轮廓清晰，大小均一，胞 体明亮。转染细胞变化明显，表现为细胞体积增大，边缘模糊，轮廓不清，病变后细胞大量 脱落、死亡，并逐渐裂解。以上现象初步说明PFastBaCl-2-VP4/VP7转座重组质粒通过脂质体介导转染昆 虫sf9细胞成功，见图15、16。3. 10 一代和二代重组杆状病毒感染正常细胞后PCR检测病变后细胞大量脱落、死亡并逐渐裂解时，收集细胞，低速离心后取上清，100°C煮 5min，用此做模板用于PCR检测。结果含有VP4/VP7基因的一代和二代病毒都能被检测到， 结果见图17、18。实施例3轮状病毒基因与酵母细胞GSl 15表达载体PPIC9K重组载体的构建1.材料1.1病料、菌株及质粒病料PRRSV肺组菌株同实施例1细胞酵母GSl 15由本实验室保存质粒酵母表达载体PPIC9K(invitrogen)，其余同实施例1。1. 2酶和主要试剂酶K0D Plus酶购自硕盟生物，其余同实施例1。主要试剂同实施例1。1. 3培养基及试剂配制同实施例1。1.4主要仪器设备同实施例1。2.方法2. IPRV肺组织中RNA的提取同实施例1。2. 2PRV-VP4、VP7 基因 RT-RCR 扩增2.2. 1引物的设计与合成根据Genebank上公布的VP4、VP7基因序列设计一对引物，并引入EcoRI、NotI位 点，标记为3-VP4-F、3-VP4-R、3-VP7-F、3-VP7-R，序列如下，斜体为酶切位点，引物由上海生 物工程有限公司合成。昆虫细胞sf9细胞表达载体扩增引物3-VP4-F
CAGAATTCCATCATCATCATCATCATATGGCTTCGCTCATTTATAGACA3-VP4-R :ATCTGCGGCCGCTCATGACCATTTATAACCCAATCC
3-VP7-F CGCAGAATTCCATCATCATCATCATCATATGTATGGTATTGAATATACCACAG3-VP7-R :ATCTGCGGCCGCCTATACTCTGTAATAAAATGCAGC2. 2. 2反转录同实施例1。2. 2. 3PCR 反应PCR反应体系(50 μ 1)模板(cDNA)2. Ομ 1IOXBuffer (Mg2+free)5. 0μ 1MgSO44. Ομ 1dNTP(2mM)5. Ομ 13-VP4/VP7-F(10yM)2. 0μ 13-VP4/VP7-R(10yM)2. 0μ 1KOD-Plus 酶2. 0μ 1(MH2O28. 0μ 1在冰上混合。PCR反应条件94"C预变性3min,94°C变性30s，60"C退火30s，68"C延伸90s，循环35次，最后68°C延伸IOmin0取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶 成像系统观察扩增情况。2. 3PMD18-T-3-VP4、VP7 载体构建2. 3. IPCR 产物沉淀KOD-Plus酶扩增的PCR产物加十分之一体积的乙酸钠再加2. 5倍的无水乙 醇，-20°C放置1-2小时，12000r离心lOmin，弃上清，70%的乙醇洗一次，烘干，30ul的ddH20溶解沉淀。2. 3. 2加A尾反应方法同实施例1。2. 3. 3PMD18-T与PCR产物连接方法同实施例1。2. 3. 4转化连接物转化大肠杆菌T0P10感受态细胞，步骤同实施例1。2. 3. 5阳性克隆质粒挑菌PCR筛选鉴定方法同实施例1。2. 3. 6质粒抽提方法同实施例1。2. 3. 7酶切鉴定质粒PMD18-3-VP4和PMD18-3-VP7酶切体系如下质粒 5. 0 μ 1IOXbuffer 1. 0μ 1
10XBSAΙ.ΟμΙEcoRI0. 5μ 1NotI0. 5μ 1ddH202. Ομ 1反应总体积为10 μ 1，37°C，水浴3小时。取5 μ L扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中 IOOV电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶成像系统观察扩增情况。2. 4PIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7 载体构建2. 4. 1 酶切质粒PMD18-T-3-VP4 和 PMD18-T-3-VP7 酶切体系如下质粒15·0μ1IOXbuffer 4. O μ 1IOXBSA4. O μ 1EcoRI2. Ομ 1NotI2. Ομ 1加水至40 μ 1，37°C水浴3-4小时。PPIC9K质粒酶切体系如下质粒15·0μ1IOXbuffer 3. O μ 1IOXBSA3. O μ 1EcoRI 2. O μ 1NotI2. Ομ 1加水至30 μ 1，37°C水浴3-4小时。用胶回收试剂盒分别回收目的片段，方法同实施例1。2. 4. 2酶切产物回收用小量胶回收试剂盒，同实施例1。2. 4. 3PPIC9K载体与目的基因连接PPIC9K载体酶切回收产物3μ 1，PCR酶切回收产物5μ l，T4buffer 1μ1，Τ4连接 酶1 μ 1 (总体积10 μ 1)，16°C连接过夜。2. 4. 4 转化取5μ 1连接产物加到100 μ 1 TOPlO感受态细胞中，方法同实施例1。2. 4. 5阳性质粒PCR筛选方法同实施例1，筛选出的阳性重组菌将其命名为PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3_VP7。2. 4. 6阳性质粒酶切鉴定质粒PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7，酶切体系如下质粒5·0μ1IOXbuffer1. Ομ 1IOXBSA1. Ομ 1EcoRI0. 5 μ 1NotI0. 5μ 1
ddH202. 0 μ 1反应总体积为10 μ 1，37°C，水浴3小时；取5 μ 1扩增产物在1. 0%琼脂糖凝胶中 100V电压电泳30-40min，用紫外灯凝胶成像系统观察扩增情况。2. 4. 7阳性重组质粒序列测定PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3_VP7阳性菌落经LB液体培养基培养14_16h后送上海桑 尼科技有限公司测序鉴定。3.结果分析
3. 1PRV-VP4、VP7 基因的 RT-RCR 扩增PRV肺组织所提取的RNA，经RT-PCR扩增，得到一段约IOlObp的VP7和910bpVP4 片段，与预期结果一致，分别见图19、20。3. 2PMD18-3-VP4/VP7 菌落 PCR 检测结果挑白色菌落PCR检测，PMD18-3-VP4挑选3个菌落结果有全为阳性，得到一段约 910bp的片段，与预期结果一致。PMD18-3-VP7挑选2个菌落结果有全为阳性，得到一段约 IOlObp的片段，与预期结果一致。3. 3PMD18-3-VP4/VP7阳性克隆的测序结果VP4、VP7基因PCR产物与PMD18-T连接转化后，筛选的阳性克隆测序结果如下，从 中可以看出此基因已成功引入了 EcoRI (GAATTC)，NotI (GCGGCCGC)酶切位点。3. 4PPIC9K-3-VP4/VP7重组载体的菌落PCR筛选鉴定结果挑白色菌落PCR检测，PPIC9K-3-VP4挑选3个菌落结果有全为阳性，得到一段约 910bp的片段，与预期结果一致。PPIC9K-3-VP7挑选4个菌落结果有3个为阳性，得到一段 约IOlObp的片段，与预期结果一致，见如图21。3. 5 重组载体 PPIC9K-3-VP4/VP7 酶切鉴定分别选取两个阳性菌落，接入LB液体培养基培养过夜后，抽提质粒。重组载体 PPIC9K-3-VP4,PPIC9K-3-VP4VP7 经 EORI 和 NOtI 内切酶进行双酶切检测，PPIC9K-3-VP4 经 EORI和NOtI酶切后，产生2条分别约9300bp和910bp的条带。PPIC9K-3-VP4VP7经EORI 和NOtI酶切后，产生2条分别约9300bp和IOlObp的条带。结果证明2个质粒全为阳性， 并成功引入了 EcoRI和NotI酶切位点，结果见图22。3. 6PPIC9K-3-VP4/VP7阳性质粒的测序结果PPIC9K-3-VP4和PPIC9K_3_VP7经PCR和酶切鉴定为阳性后，送上海桑尼科技有限 公司测序鉴定。筛选的阳性克隆测序结果，其中包含6个组氨酸序列以及引入的EcoRI和 NotI酶切位点，结果与本实施例3. 3相同。最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参 照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的 技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在 本发明的权利要求范围中。附本申请中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列表 其中SEQ ID No 1 为 PMD18—T-VP4 的序列表。 SEQ ID No 2为引物VP4-F的序列表。SEQ ID No 3为引物VP4-R的序列表。 SEQ ID No 4为引物2-VP4-F的序列表。 SEQ ID No 5为引物2-VP4-R的序列表。 SEQ ID No 6为引物2-VP7-F的序列表。 SEQ ID No 7为引物2-VP7-R的序列表。 SEQ ID No 8为引物M13-F的序列表。 SEQ ID No 9为引物M13-R的序列表。 序列表<110>上海市农业科学院<120>猪轮状病毒疫苗候选基因的原核表达及其真核表达载体的构建 <160>2<170>PatentIn version 3.3 <210>SEQ ID No 1 <211>887 <212>DNA<213> 猪轮状病毒(porcine rotavirus) <400>1GGATCCATGGCTTCGCTCATTTATAGACAACTACTTACTAATTCATACACAGTCAATCTT61CCTGACGAAATTCAAGAGATTGGATCAGCTAAGTCACAGGATGTTACTATAAATCCTGGT121CCATTCGCACAAACAGGTTATGCACCAGTTAATTGGGGAGCAGGTGAGACTAATGACTCC181ACAACTGTCGAGCCGTTATTAGATGGTCCATACCAACCAACCACTTTCAATCCACCAACA241AGCTATTGGGTACTACTTGCGCCAACTGTAGAGGGCGTAATTATTCAAGGAACAAACAAT301ACCGATAGATGGTTGGCCACTATACTAATTGGACCAAACGTACAAACAACTAACAGAATA361TACAATCTTTTTGGTCAGCAAGTAACTTTATCGGTGGAGAATACGTCACAGACACAATGG421AAGTTCATTGATGTGAGTACAACTACGCCAACAGGAAGTTATACGCAGCACGGACCATTG481TTCTCTACACCAAAATTATACGCTGTAATGAAATTCAGTGGTAGAATATATACATATAAT541GGAACCACACCAAACGCAACAACAGGATACTATTCAACTACTAATTATGACACAGTAAAT601ATGACATCATTTTGTGATTTTTATATTATACCAAGAAATCAAGAAGAAAAATGTACTGAG661TATATCAATCATGGATTACCTCCTATACAAAATACAGGGAATGTTGTGCCAGTATCTTTA721TCGGCTAGAGAGATAGTGCACACAAGAGCTCAAGTTAATGAGGATATTGTTGTTTCAAAA781ACTTCACTTTGGAAAGAAATGCAATGCAACAGAGACATAACCATAAGATTCAAATTTGAT841AGAACAATTATTAAAGCTGGAGGATTGGGTTATAAATGGTCCTCGAG<210>SEQ ID No 2<211>33<212>DNA<213> 猪轮状病毒(porcine rotavirus) <400>AGCAG GATCC ATGGC TTCGC TCATT TATAG ACA 1 5 10 15 20 25 30
权利要求
1.猪轮状病毒VP4、VP7疫苗候选基因的原核表达及其真核表达载体的构建方法，其特 征在于包括猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达、猪轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞 sf9表达载体PFastbacl重组载体的构建及转染，以及猪轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细 胞GSl 15表达载体PPIC9K重组载体的构建。
2.根据权利要求1所述的猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达的方法，其特征在于， 所述猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达如下从猪肺中提取总RNA，根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白VP4基 因核酸序列设计引物，经RT-PCR扩增得到猪VP4基因的编码区，插入pMDIS-T载体中；再经 限制性内切酶BamHI和B10I双酶切，将回收的片段插入原核表达载体pGEX_4T_l中，命名 为pGEX-4T-l-VP4 ；重组质粒pGEX_4T-l_VP4转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，经IPTG 诱导、SDS-PAGE电泳分析，得到分子量为58KDa的重组融合蛋白；经超声破碎后，SDS-PAGE 电泳分析其为包涵体。
3.根据权利要求1所述的轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl 重组载体的构建及转染方法，其特征在于，所述猪轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表 达载体PFastbacl重组载体的构建及转染如下根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白VP4、VP7基因核酸序列设计 引物，用RT-PCR方法扩增出PRV的核衣壳蛋白VP4、VP7基因；将得到的猪VP4、VP7基因的 编码区插入PMD18-T载体中；再经限制性内切酶EcoRI和BioI双酶切，将回收的VP4、VP7 基因片段克隆到昆虫表达载体PFastbacl上，将重组质粒分别命名为PFastbaCl-2-VP4、 PFastbac 1-2-VP7 ；将 PFastbacl-2_VP4、PFastbacl-2_VP7 质粒分别转化入 DHlOBacl 感受 态细胞中，使其与辅助质粒发生转座重组；通过蓝白斑筛选、PCR鉴定结果表明获得了含有 轮状病毒基因的杆状病毒的阳性重组子；纯化该线性杆状病毒重组子使其转染昆虫细胞， 3d后收获重组病毒，根据细胞形态变化及PCR鉴定表明重组病毒转染sf9细胞成功；收集 病毒上清，将其含有VP4、VP7病毒上清分别命名为A1、B1 ；分别将A1、B1代病毒接种于sf9 中，待细胞大量病变后收收集细胞，PCR鉴定为阳性病毒，其上清分别命名为A2、B2代病毒。
4.根据权利要求1所述的轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl15表达载体PPIC9K 重组载体的构建方法，其特征在于，所述猪轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl 15表达载 体PPIC9K重组载体的构建如下根据GeneBank上公布的猪轮状病毒病毒PRV核衣壳蛋白VP4、VP7基因核酸序列设计 引物，用RT-PCR方法扩增出PRV的核衣壳蛋白VP4、VP7基因片段；将得到的猪VP4、VP7基因 的编码区插入PMD18-T载体中；再经限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切，将回收的VP4、VP7 基因片段克隆到酵母细胞表达载体PPIC9K上，将其命名为PPIC9K-3-VP4、PPIC9K-3-VP7。
5.根据权利要求2所述的猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达的方法在蛋白的大量 纯化中的应用。
6.根据权利要求3所述的轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl 重组载体的构建及转染方法在昆虫细胞sf9中蛋白表达及疫苗的研制中的应用。
7.根据权利要求4所述的轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GSl15表达载体PPIC9K 重组载体的构建方法在毕赤酵母细胞中表达蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种猪轮状病毒(porcine rotavirus，PRV)VP4、VP7疫苗候选基因的原核表达及其真核表达载体的构建方法，包括猪轮状病毒VP4基因的克隆与原核表达、轮状病毒VP4、VP7基因与昆虫细胞sf9表达载体PFastbacl重组载体的构建及转染，以及轮状病毒VP4、VP7基因与酵母细胞GS115表达载体PPIC9K重组载体的构建。
文档编号C12R1/19GK102041266SQ200910197158
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月14日 优先权日2009年10月14日
发明者易建中, 肖长峰 申请人:上海市农业科学院