专利名称：应用levovirin 治疗病毒感染的制作方法
本申请要求1999年12月30日申请的美国专利申请第09/471,513号的权益，后一申请要求美国临时申请第60/164,366号和第60/164,365号的权益，所述专利申请内容均通过引用整体结合到本文中。
在细胞因子相关性治疗方法中，给予细胞因子调节Th1/Th2平衡向Th1型应答或Th2型应答方向转移。例如，Knight等人提出，促进Th1细胞产生的细胞因子IL-12(白细胞介素-12)可用于治疗爱滋病，因为已经证实，对鼠艾滋病毒或Rauscher白血病病毒(RLV)感染的小鼠给予IL-12，有效恢复细胞介导性免疫[Knight，S.C.和Patterson.S.，Annu.Rev.Immunol.1994.15593-615]。再例如，Gracie，J.A.等人证明，给予小鼠IL-18对产生Th1型应答具有关键性的多效活性。[Gracie等人，J Clin Invest 1999 Nov 15；104(10)1393-1401]。虽然给予细胞因子一般导致目标细胞因子相对特异性增加，但是长期给予细胞因子可能出现各种问题。例如，重组细胞因子的生产相对昂贵，而从天然材料中分离非重组细胞因子一般较难，因为在天然材料中细胞因子的浓度非常低。更大的问题在于细胞因子的制品通常需要纯度非常高以避免重复给药引起过敏反应。而且，根据细胞因子性质，其在患者体的耐受性可能较差。
在非细胞因子相关性方法中，应用细胞因子以外的免疫调节物质调节Th1型应答和Th2型应答之间的平衡。例如，SprietsmaJ.E.[Sprietsma J.E；Med Hypotheses 1999 Jul；53(1)6-16]提出，锌离子(Zn++)和一氧化氮(NO)与谷胱甘肽(GSH)及其氧化型GSSG一起，可能有助于调节对抗原的免疫反应。该作者还详细报道了Zn++、NO和/或GSH的不足使Th1/Th2平衡转向Th2，而Zn++、NO和/或GSH的补给可以使Th1/Th2平衡转向Th1。给予Zn++或GSH/GSSG特别有利，因为这些物质即使在高浓度时也是无毒的，而且生产成本低廉。此外，Zn++和GSH/GSSG制品可以口服方式给予，因此大大降低了过敏反应的风险，特别是当所述制品不是超纯时。但是，给予Zn++和/或GSH/GSSG似乎仅有利于从Th2为主的状态恢复Th1/Th2平衡，而给予Zn++和/或GSH/GSSG是否可以从正常的Th1/Th2平衡增强Th1型应答还不清楚。
再例如，通过引用结合到本文的美国专利申请09/156.646中论述了一种方法，发明者利用核苷类似物病毒唑(1-(5-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)调节Th1/Th2型应答的平衡。使用病毒唑特别有利于病毒感染的治疗，因为病毒唑不仅调节免疫应答转向Th1型应答，还可以作为病毒复制的抑制剂。例如，病毒唑已被成功应用于丙型肝炎的治疗。这一效果部分是因为抗病毒作用，部分是因为调节细胞因子平衡。
尽管病毒唑在病毒数量和免疫状态方面表现出令人满意的效果，但是长期给予较高剂量的病毒唑常常伴有若干副作用，包括白细胞减少和溶血性贫血。为了减少副作用的发生或其严重性，已有介绍同时给予病毒唑和IFNα-2B[Reichert，O.等，1998；Lancet 35183-87]。但是，同时给予病毒唑和IFNα-2B大大增加治疗费用。而且，长期给予IFNα-2B增加了由其引起新的副作用的风险。
尽管在病毒性疾病的治疗中应用病毒唑较成功，但病毒唑的使用因为各种副作用的产生仍然存在问题。所以，需要提供改进的方法和组合物来调节Th1/Th2平衡以治疗病毒感染，而且其副作用较轻或者无毒性副作用。
本发明主题的一个方面是，给予LevovirinTM增强患者Th1型应答(相对于Th2型应答)，特别设想了Th1型应答绝对增加。本发明主题的再一方面是，体内给予LevovirinTM，优选静脉注射给予或者口服给予，其中LevovirinTM的优选剂量为0.1mg/kg-1.0mg/kg。
根据以下详细介绍的本发明优选实施方案和附图
可以更清楚了解本发明的各种目的、特性、方面和优点，附图中的相同数字代表相同组分。
图2图示合成LevovirinTM的合成方案。
图3A-C图示LevovirinTM和病毒唑对Th1型应答各组分的各种生物效应。
图4图示与LevovirinTM和病毒唑治疗有关的伴刀豆球蛋白A注射小鼠的血清ALT水平。
发明详述本文使用的术语“病毒感染”是指任何阶段的病毒感染，包括潜伏期、休止期或静止期、急性期以及抗病毒免疫产生及维持期。因此，术语“治疗”包括产生或恢复患者免疫系统免疫力的各个方面，以及减弱或抑制病毒复制的各个方面。
此外，本文使用的淋巴因子是辅助T细胞产生的细胞因子亚群，一般认为可分为两个亚类，Th1和Th2。Th1细胞(更新的说法是1型细胞)产生白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNFα)和干扰素γ(IFNγ)，主要负责诸如迟发型超敏反应和抗病毒免疫的细胞介导免疫。相反，Th2细胞(更新的说法是2型细胞)产生白细胞介素IL4、IL5、IL-6、IL-9、IL-10和IL-13，主要与促进体液免疫应答有关，例如可见于过敏原反应的应答，例如IgE和IgG4抗体同种型转换(Mosmann，1989，Annu Rev Immunol，7145-173)。
本文进一步使用的术语Th1和Th2“应答”包括Th1和Th2淋巴因子分别诱导产生的全部效应。所述应答尤其还包括相应细胞因子产生增加、相应淋巴细胞增殖增强，以及其他与细胞因子产生增加有关的作用，包括运动作用。Th1型应答的一般特征为IL-2、TNF-α和IFN-γ增加，而Th2型应答的典型特征为IL4、IL-5、IL-6和IL-10增加。
在一个优选实施方案中，CD4淋巴细胞数约500细胞/微升的HIV感染患者，接受30天的治疗，每天注射一次总剂量为0.5mg/kg体重的LevovirinTM水溶液。
本发明主题的可选择方面是，所述HIV感染不需要限于约500细胞/微升的CD4淋巴细胞数，而是也可以包括较低的CD4淋巴细胞数，包括CD4淋巴细胞数500-300个、300-150个和150个以下。相似地，较高的CD4淋巴细胞数(即＞500个)也列入考虑中。还应进一步了解到，除了病毒效价和CD4淋巴细胞数外的各种临床标记也可能是合适的，包括检测所述HIV病毒存在的直接和间接试验。例如，直接试验包括PBMC和血浆HIV的定量培养、定性和定量PCR方法等。间接试验包括定性和定量ELISA方法等。
关于所述病毒感染的病毒类型，设想所述病毒感染的治疗不是只针对某一特定类型或某一亚型的HIV病毒，还应了解到除了HIV外的各种病毒也列入考虑中。一般考虑的选择病毒感染包括可用LevovirinTM的D-异构体病毒唑治疗的病毒感染。特别考虑的选择病毒感染包括HCV感染和HBV感染。
本发明主题的其它选择方面是，LevovirinTM的给药方式不必限于连续30天每日注射一次，而可以包括选择给药频率和途径。例如，在需要给予较大剂量LevovirinTM时，可以考虑每天注射二至四或者更多次。相似地，在需要长时期保持LevovirinTM高血浆浓度时，可以考虑持续给药。例如，更长期给药可以包括使用连续输注、渗透泵或持续释放植入物。还应进一步了解到，所述给药途径不只限于注射，而合适的给药途径包括口服、经皮、鼻内、肺部给药等途径。因此，可选择的LevovirinTM制剂形式可以包括片剂、糖浆、凝胶、气雾剂等。还可以考虑体外给予LevovirinTM。例如，可以把预定量的全血或全血的分离部分与LevovirinTM体外预温育，以促进或产生针对免疫原性刺激的免疫应答。
关于LevovirinTM的剂量，还设想了各种合适选择剂量，包括0.5mg/kg-0.1mg/kg或更低剂量，也包括0.5mg/kg-1.0mg/kg或更高剂量。一般来说，合适的剂量取决于多项参数，包括病毒感染类型、病毒感染阶段、需要的LevovirinTM血浆浓度、治疗时间等。例如，一些病毒感染较低血浆浓度LevovirinTM就可以获得治疗成功，而其他病毒感染可能需要较高的剂量。
本发明主题更进一步的选择方面是，LevovirinTM可以与另外的药用活性物质联合应用而有助于治疗所述病毒感染。考虑另外的药用活性物质包括抗病毒剂和免疫调节物质。例如，抗病毒剂包括蛋白酶抑制剂、或核苷酸和核苷类似物，而免疫调节物质可以包括细胞因子。
尽管不希望受任何特定理论的限制，但是认为给予LevovirinTM与患者体内Th1型应答相对于Th2型应答的增加有关，特别认为Th1型应答相对于Th2型应答的增加是因为Th1型应答绝对增加。所述细胞因子水平因此可能个别增加或者全面增加。例如，预计对活化人PBMC给予LevovirinTM可能导致IL-2平均峰值水平相对于活化对照水平增加至少70％(重量)。另一方面，预计对活化人PBMC给予LevovirinTM可能导致IFN-γ平均峰值水平相对于活化对照水平增加至少20％(重量)，或者TNF-α平均峰值水平相对于活化对照水平增加至少50％(重量)(另见图3A-C)。再例如，预计Th1型应答增强可能包括IL-2、IFN-γ和TNF-α的平均峰值分别增加(相对于活化对照水平)42％(重量)、125％(重量)和72％(重量)。
特别应该了解的是，尽管病毒唑与LevovirinTM在可治疗病毒感染类型上多少存在重叠，但是LevovirinTM的毒性显著降低。例如，经口给予小鼠180mg/kg剂量的病毒唑，持续四周，产生显著的溶血性贫血和白细胞减少症，而LevovirinTM没有产生任何可观察到的临床病状。而且，特别认为，LevovirinTM治疗病毒性疾病主要基于调节Th1/Th2平衡转向Th1为主的应答，而主要治疗基础不在于直接的抗病毒作用。本文使用的术语“直接抗病毒”作用或活性是指药物对病毒装配或复制的直接作用或活性。相反，认为由免疫系统一个或多个组分至少部分介导引起的病毒活性或复制的减弱不是“直接抗病毒”作用或活性。同样，还应了解到，根据本发明主题进行治疗时的Th2型应答相对减少可能对与Th2型应答增加有关的疾病特别有利(例如HCV感染)。
实施例1LevovirinTM的合成1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖(1)于室温在氩气环境中通过注射器在15分钟内将新鲜配制的无水甲醇HCl(40ml，在0℃下在甲醇中鼓泡通入无水HCL气体至总重增加4g制得)加入至L-核糖(50.0g，333.33mmol)的无水甲醇(500ml)搅拌溶液中。加入甲醇HCl后，于室温搅拌该反应混合物3-4小时。然后加入无水吡啶(100ml)，并在高真空下以低于40℃的温度蒸发至干。再加入无水吡啶(100ml)，重复这一过程。该残余物以无水吡啶(250ml)溶解后，在氩气环境中冰浴降温至0℃。通过滴液漏斗在15分钟内将乙酸酐(100ml)加入至这一冷却的搅拌溶液中。在加入乙酸酐后，于室温除湿环境下搅拌该反应混合物24小时。然后将该反应混合物蒸发至无水。所得残余物分配在乙酸乙酯(400ml)和水(400ml)之间，然后在乙酸乙酯中萃取。将水层用乙酸乙酯(100ml)重新萃取。用水(400ml)、饱和NaHCO3溶液(2×300ml)、水(300ml)和盐水(200ml)清洗混合的乙酸乙酯萃取液。该有机萃取物经无水Na2SO4干燥后，过滤，将滤液蒸发至无水。该残余物在高真空下用无水甲苯(2×150ml)共蒸发。所得无水油状残余物(92g，95％)直接在以下反应中的使用，而不需要进一步表征。
将上述反应中得到的糖浆(92g)溶于冰醋酸(300ml)中，并在室温下用乙酸酐(75ml)处理。将所述溶液在氩气环境中冰浴降温至0-5℃。在15分钟内缓慢加入浓硫酸(21ml)。于室温搅拌该反应混合物14小时，然后倾倒至碎冰(500g)上，搅拌直至冰融化。加入水(500ml)并用三氯甲烷(CHCl3)(2×300ml)萃取。用水(3×400ml)、饱和NaHCO3溶液(2×300ml)、水(200ml)和盐水(200ml)清洗所得的三氯甲烷萃取液。清洗后的有机萃取液经无水MgSO4干燥后，过滤、蒸发无水得到油状残余物(99g)。该残余物用无水甲苯(200ml)共蒸发，然后溶于乙醚(200ml)中，将之在10℃下冷却一天后得到无色晶体。用正己烷∶乙醚(2∶1，50ml)过滤、清洗该结晶固体，然后干燥得到60.5g产物。
甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(3)和甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-5-甲酸酯(4)将甲基-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(25.4g，200mmol)、1，2，3，5-四-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖(63.66g，200mmol)和二(对硝基苯基)磷酸酯(1g)的混合物放入一个RB烧瓶(500ml)中。将该烧瓶放入预加热至165-175℃的油浴中，在水抽真空下搅拌25分钟。通过置于抽吸器与RB烧瓶之间的冰冷收集器收集置换出来的醋酸。然后将烧瓶从油浴中拿出，冷却。当烧瓶温度达到约60-70℃时，加入乙酸乙酯(300ml)和饱和NaHCO3(150ml)溶液，在乙酸乙酯中萃取。将水层用乙酸乙酯(200ml)重新萃取。先后用饱和NaHCO3溶液(300ml)、水(300ml)和盐水(200ml)清洗混合的乙酸乙酯萃取液。该有机萃取物经无水Na2SO4干燥后，过滤，将滤液蒸发至无水。将残余物溶于乙醇(100ml)，并用甲醇(60ml)稀释，然后将之在10℃下冷却12小时后得到无色晶体。用最低温度的乙醇(20ml)过滤、清洗该固体，然后在高真空下用固体NaOH干燥得到60g(78％)的滤液。将所述滤液蒸发至无水并以ChCl3→乙酸乙酯(9∶1)作为洗脱液从硅胶柱上提纯。从所述滤液中分离出两种产物流速较快的产物8.5g(11％)和流速较慢的产物5g(6.5％)。流速较慢的产物相当于结晶产物。发现流速较快的产物即化合物(4)，是以泡沫形式获得的。化合物(3)的产量是65g(84％)。
1-β-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺(5)将甲基-1-(2，3，5-三-O-乙酰基-β-L-呋喃核糖基)-1，2，4-三唑-3-甲酸酯(62g，161mmol)置于一个钢瓶中并在0℃下用新鲜制备的甲醇氨(350ml，通过在0℃下向无水甲醇通入无水HCl气体直至饱和制得)处理。关闭钢瓶并在室温下摇动18小时。然后将钢瓶冷却至0℃，打开后将内容物蒸发至无水。所述残余物用无水乙醇(100ml)处理并蒸发至无水。所得的残余物用丙酮研磨得到固体产物，该固体产物用丙酮过滤和清洗。在室温下将所得固体产物干燥过夜，然后溶于乙醇(600ml)和水(10ml)的热混合液中。通过在加热板上加热和搅拌后所述乙醇溶液的体积减至150ml。将所述热的乙醇溶液冷却后得到无色晶体，将其用丙酮过滤、清洗并真空干燥。将过滤液进一步浓缩得到另外的物质。总产量为35g(89％)。
实施例2测定LevovirinTM和病毒唑作用的细胞因子类型通过密度梯度离心后，用Lymphokwik(One Lambda，Canoga Park，CA)富集T细胞从健康捐血者血液中分离外周血单核细胞。通过塑胶粘附去除污染的单核细胞。纯化的T细胞包括＞99％的CD2+、＜1％的HLA-DR+和＜5％的CD25+，将之保存于RPMI-AP5(含5％自体血浆、1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和0.05％2-巯基乙醇的RPMI1640培养基)中。为了检测细胞因子蛋白的水平，通过加入80ng的葡萄球菌肠毒素B(SEB，Sigma，St.Louis，MI)活化T细胞(0.2ml含0.2*106个细胞)，将之在含有0-10μM LevovirinTM或病毒唑的96孔板上于37℃培养48小时。活化后，分析上清液中细胞源性细胞因子的产量。使用专用于IL-2、IFN-γ和TNF-α的酶联免疫吸附反应(ELISA)试剂盒(Biosource，Camarillo，CA)检测细胞因子。所有的ELISA结果都以pg/ml表示。数据以活化对照的百分数表示，这一百分数是以LevovirinTM或病毒唑存在时活化T细胞的细胞因子水平与未经处理的活化T细胞的细胞因子水平之比乘以100％。因此，细胞因子0效应应为100％活化对照值。图3A-C图示经LevovirinTM或病毒唑处理的T细胞和各种Th1细胞因子之间的剂量反应相似。表1显示病毒唑和LevovirinTM对SEB激活的T细胞表达Th1细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α的作用。目前的数据清楚地表明，LevovirinTM具有显著的治疗以1型细胞因子占主导地位疾病的潜力。治疗方案 IL-2 IFN-γ TNF-αSEB 100 100 100SEB+病毒唑 143±18 131±6 124±4SEB+LevovirinTM131±12 122±3 144±7表1表中细胞因子的所有数据都是以活化对照的平均百分数(+/-标准差)表示的。SEB诱导的1型细胞因子分泌的绝对水平(pg/ml+/-标准差)如下IL-2是640+/-36，IFN-γ是462+/-37，而TNF-α是223+/-27。所有细胞因子的静息水平都＜30pg/ml。
实施例3直接抗病毒活性和细胞毒性试验按Huffman，J.H.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，875-83和Barnard，D.L.等人，Antiviral Chem.And Chemother.1997，8223-223所述方法，体外测试LevovirinTM和病毒唑对流感病毒A和B、副流感病毒1和2和呼吸道合胞病毒的直接抗病毒活性。国家癌症研究所(the National Cancer Institute)使用设计用于检测在病毒复制周期所有阶段起作用的药物的方法[Weislow，O.W.等人，J.Natl..Cancer Inst.1989，81577-586]对抗人类免疫缺陷病毒的活性进行了评估。采用Marion等人，Hepatology 1987，7724-731所述方法，监测抗乙型肝炎病毒(HBV)活性。病毒唑的抗HIV活性和细胞毒性可见以前的资料[McCormick，J.B.，Lancet，1998.II1367-1369]。
表2显示LevovirinTM和病毒唑在各种病毒感染细胞中的直接抗病毒活性和细胞毒性的比较。化合物 活性HB HIV INFL.A INFL.B PARA1PARA3 RSVLevovirinTM直接抗病毒活性 ＞100 ＞600 ＞200 ＞200 ＞1000 ＞1000 ＞1000细胞毒性＞100 ＞600 ＞200 ＞200 ＞1000 ＞1000 ＞1000病毒唑 直接抗病毒活性 ＞100 40 6.1 1.9 40 45细胞毒性 53＞40 56 ＞100 ＞1000 480 100表2病毒的测试范围包括乙型肝炎病毒(HBV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒(INFL)A和B、副流感病毒(PARA)1和3，以及呼吸道合胞病毒(RSV)。抗病毒活性(EC50)或细胞毒性(CC50)以μM表示。
实施例4LevovirinTM在伴刀豆球蛋白A诱导的肝炎中的抗炎活性给BALB/c小鼠(每组6只)腹膜内注射单剂量20μg(1mg/kg)的LevovirinTM或病毒唑或者200μl PBS，1小时后通过尾静脉注射0.3mg的伴刀豆球蛋白A(Con A，Calbiochem，San Diego，CA)。24小时后用甲氧氟烷麻醉小鼠，然后通过心脏穿抽取全血。血液凝固获得血清并将之用于检测丙氨酸转氨酶(ALT)。所述血清中的ALT水平通过一个酶活试验(Sigma)检测，该酶活试验基于对ALT催化其底物丙氨酸和α-酮戊二酸形成产物(丙酮酸和谷氨酸)的比色测量。图4图示病毒唑或LevovirinTM或PBS作用的血清ALT量。病毒唑和LevovirinTM都可以明显使Con A诱导的ALT水平由大约1900U/ml降低至969U/ml±192(病毒唑)以及954U/ml±179(LevovirinTM)。
这样，公开了化合物的特定实施方案和应用以及用LevovirinTM治疗病毒感染的方法。但是，本领域技术人员应该显而易见的是，除了已经讲述的之外，还可有许多不偏离本发明构思的改进。因此，本发明主题只受后附的权利要求书的限制。而且，解释说明书和权利要求书时，所有术语的解释都应是与上下文一致的最宽泛解释。尤其是术语“包含”和“包括”应该解释为是指非独有的要素、组分或步骤，即表示所述要素、组分或步骤可以存在或使用或与其他没有明确指出的要素、组分或步骤组合。
权利要求
1.一种治疗患者病毒感染的方法，该方法包括给予结构1的化合物；其中结构1是
2.权利要求1的方法，其中所述病毒感染选自HIV感染、HCV感染和HBV感染。
3.权利要求1的方法，其中所述给药步骤使所述患者体内的Th1型应答相对于Th2型应答增强。
4.权利要求3的方法，其中所述Th1型应答增强。
5.权利要求4的方法，其中所述Th1型应答增强包括IL-2的平均峰值相对于活化对照水平升高至少70％(重量)。
6.权利要求4的方法，其中所述Th1型应答增强包括IFN-γ的平均峰值相对于活化对照水平升高至少20％(重量)。
7.权利要求4的方法，其中所述Th1型应答增强包括TNF-α的平均峰值相对于活化对照水平升高至少50％(重量)。
8.权利要求4的方法，其中所述Th1型应答增强包括IL-2、IFN-γ和TNF-α的平均峰值相对于活化对照水平分别升高42％(重量)、125％(重量)和72％(重量)。
9.权利要求1的方法，其中所述给药步骤包括体内给药。
10.权利要求1的方法，其中所述给药步骤包括口服给药。
11.权利要求1的方法，其中所述给药步骤包括注射给药。
12.权利要求1的方法，其中所述给药步骤包括给予剂量为0.1-1.0mg/kg体重的所述化合物。
13.一种免疫应答调节剂，它为结构1的免疫应答调节剂
全文摘要
应用治疗患者病毒感染的方法给予1－(β－L－呋喃核糖基)－1，2，4－三唑－3－甲酰胺，所述病毒感染包括HIV感染、HCV感染或HBV感染。
文档编号A61K31/7056GK1409721SQ00817021
公开日2003年4月9日 申请日期2000年12月15日 优先权日1999年12月23日
发明者R·谭 申请人:里巴药品公司