专利名称：蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其基因工程生产方法
技术领域：
本发明涉及棉纤维改良基因工程，尤其是涉及一种蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其基因工程生产方法。
背景技术：
棉纤维作为一种天然纤维，一直是纺织业和其相关产业的主要原材料。棉纤维由棉花种皮的表皮细胞分化产生。成熟棉纤维中纤维素含量达90％以上，同时含有一部分蛋白。棉纤维的品质，主要决定于纤维强力、长度、伸长度等性状。这些性状主要受基因型控制，环境因子和栽培对其影响低于20％。随着分子生物学研究的深入和植物转基因技术的逐渐成熟，用基因工程方法改良棉纤维品质，将成为培育优质棉的重要手段。目前，美国、澳大利亚等国都投入大量资金进行棉纤维的分子生物学研究。美国Agrocetus公司的科学家M.E.John博士等克隆了数个棉纤维特异表达的基因(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773；John ME，Plant Mol Biol，1996，30297-306；John ME，Critical Reviews in Biotechnology，1997，17(3)185-203)，并利用棉纤维特异表达启动子将外源合成PHB的基因转入棉花，使棉花纤维中产生脂肪聚酯复合物-PHB(多羟基丁酸酯)(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1996，9312768-12773)。
角蛋白可分为两类，一类是α-角蛋白，一类是β-角蛋白。蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白丝心蛋白是β-角蛋白。丝心蛋白分子是片层结构，链间主要以氢键连接，层间主要靠范德华力维系。由于这种结构方式使丝纤维具有很高的抗张强度，又有很柔软的特性。
蚕丝由蚕丝心蛋白组成，国外已从蚕中分离到了蚕丝心蛋白基因(Yoshimi，K等，Gene.110(1992)151-158)。蚕丝心蛋白由两条链组成，一条重链和一条轻链，其中重链350kDa大小，轻链25kDa大小。
将蚕丝心蛋白轻链基因转入棉花，在棉纤维中特异表达，以改进棉纤维的纤维韧性及柔软性等。这是一种新的思路和技术，具有重大的实用意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种蚕丝心蛋白转基因棉纤维，即应用基因工程途径将蚕丝心蛋白基因转入棉花，使棉纤维中产生蚕丝心蛋白成分，改良棉纤维的韧性、弹性等。
运用本实验室从亚洲棉基因组文库中分离到棉纤维特异表达的启动子；克隆出蚕丝心蛋白基因，并在原核细胞中表达，制备蚕丝心蛋白抗体；接着构建由棉纤维特异启动子驱动蚕丝心蛋白基因的转基因二元载体，转化棉花后，对转基因棉花进行了组织化学染色、PCR等分子验证。现T2代正处于生长期，纤维成熟后进一步应用Western blot验证棉纤维中蚕丝心蛋白的表达；最后对转基因棉花纤维进行显微结构、强力、弹性等品质特征分析，并分析其长度、强度等各种性能。转基因棉花纤维T1代棉纤维已经检测，其强度、弹性等都有增强。本发明技术方案详述于后。
本发明提供一种转蚕丝心蛋白基因棉纤维及其基因工程上产方法，利用棉花转基因技术，在棉纤维中特异表达蚕丝心蛋白基因，能生产出全新的基因工程棉花，使棉纤维产生蚕丝心蛋白成分，使棉纤维强力提高，手感等更好。
本发明蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其转基因工程方法及鉴定包括1、棉纤维特异表达的GAE6基因的克隆以亚洲棉DNA为模板进行PCR扩增。所用引物为参阅文献(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)设计的，分别为E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。
PCR产物纯化后，采用TA克隆方法装入pGEM-T载体(购自Promega公司)中，转化XL1-Blue(本实验室保存菌种)，然后对插入片段进行PCR鉴定和酶切鉴定(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta PhytophysiologicaSinica，2000，26(2)143-147)。DNA序列由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室技术组用Appliedbiosystem373型全自动荧光序列分析仪测定。序列用PCGENE软件系统分析。
以PCR-96孔板方法筛选亚洲棉基因组文库，正向引物为E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物为E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。经7轮筛选，将阳性孔噬菌体稀释后铺板，挑取单个噬菌斑到SM溶液中，再以PCR鉴定阳性噬菌斑，依照Stratagene的实验指南释放质粒，得到一个阳性克隆，命名为GAE6-3A，经多种酶切鉴定其插入片段长8.0千碱基对。
DNA序列由宝生物工程公司Applied biosystem373型全自动荧光序列分析仪测定，所得的GAE6-3A克隆上游启动子长1457个碱基对，其核苷酸序列见SEQ ID No.1。
将该启动子克隆于含有内含子的GUS基因前，基因枪法转化了正常的棉花胚珠和突变体无絮棉胚珠，培养2天后进行组织化学染色检查GUS的活性，结果发现在正常胚珠中染色为多为深蓝色并且GUS阳性比例远远高于突变体，说明该启动子具有棉纤维特异性。
2、蚕丝心蛋白基因的克隆提取即将吐丝的蚕总RNA，反转录合成了cDNA，根据文献(YoshimiKikuchi等，Gene，1992，110151-158) 设计合成引物FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)和FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)，PCR扩增克隆了蚕丝心蛋白基因，其核苷酸序列见SEQ ID No.2，并亚克隆至pGEM-T载体(购自Promega公司)中构建了质粒TFBN。序列测定表明所克隆的蚕丝心蛋白基因FBN核苷酸序列与已发表的蚕丝心蛋白基因同源性达99％，并将其克隆到原核表达载体中以检测其表达。
3、蚕丝心蛋白抗体的制备割取聚丙烯酰胺凝胶电泳中蚕丝心蛋白特异表达条带免疫兔(蚕丝心蛋白量为100-200μg)，每3周加强一次，免疫4次，一周后取血清作为蚕丝心蛋白抗体以用于Western-blot检测。
4、转基因表达载体HAN的构建(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，2002年3月11日，保藏编号为CGMCC NO.0726)使用中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供的BKT质粒(Yu Xiao-hong，Zhu Yong-qing等，ActaPhytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)，BKT质粒经SacI/BamHI双酶切后与TFBN经BamHI/EcoRV双酶切后连接。后用HindIII/SacI双酶切后与2301质粒经HindIII/Sac I双酶切后连接，构建了由GAE6-3A启动子驱动的植物转基因二元载体HAN(含有35S启动子启动的含有内含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-。
5、棉花转化电击法将构建的转化载体导入根癌农杆菌LBA4404中，应用农杆菌法转化棉花。同时大量提取质粒，于棉花开花当天经花粉管途径注射入子房中进行转化，转化棉花苏抗103、苏抗310、苏8、苏12、中20、石远321、渝棉等多个品种。共获得棉花种子1000粒。
6、转基因棉花的分子生物学鉴定转基因棉花的分子验证，包括组织化学染色、PCR、Southern杂交，棉纤维中蚕丝心蛋白的Western分析等。
取棉花种子进行无菌培养，待萌发3天后取根尖进行组织化学染色植物组织浸泡于GUS染色液中，37℃温浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脱色一次。在解剖镜下观察并照相。共获得GUS阳性植株(根尖染成蓝色)55棵。
选取GUS活性强的51棵植株，提取DNA后进行PCR检测，应用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)进行PCR，复性温度为54℃，25个循环后，取1μl反应产物，应用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5’TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再扩增30个循环，其中22棵棉花扩增出特异条带。
7、转基因植物的Western检测取转基因棉花的棉纤维，用液氮充分研磨后，加入适量的蛋白提取缓冲液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巯基乙醇)，4℃，15,000rpm，离心10分钟后，取上清液，按卡马斯亮蓝法测定蛋白含量。各取5μg总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，然后用Bio-Rad电转移装置转移到硝酸纤维素膜上(50mA电流转移2hr，4℃)，按Sambrook方法(1989)进行杂交以检测蚕丝心蛋白基因的表达。兔抗蚕丝心蛋白基因多克隆抗体以1∶300、第二抗体羊抗兔IgG抗体(购自Promega公司)以1∶2500稀释使用。显色剂为BCIP和NBT(购自Promega公司)。
8、转基因棉纤维的品质分析转基因棉花纤维的显微结构分析，强度、长度等品质特征分析。发现强度、长度、光泽等指标都有改良。
与棉纤维相比，蚕丝心蛋白在光泽、强度、长度、手感等方面有明显的优势。本发明最大的优点和特点，是用基因工程的方法将蚕丝心蛋白基因引入棉纤维，所产生的转基因棉纤维便遗传性地具有蚕丝的某些性状而无需混纺，从而为棉纤维家族提供了新的成员，为棉纤维改良提供了一条新的途径。将丝心蛋白基因转入棉花中并使其在棉纤维中特异表达，可使转基因棉纤维含有蚕丝的成分，使转基因纤维具有新的特性，强度改善，手感等更好。
尽管以品种间杂交为主的传统育种培育了一些具有较好纤维性状的棉花品种，但是受到远缘杂交不亲和的局限，而且也不可能将动物毛、丝的性状引入棉花。通过基因工程提高纤维品质是棉花育种研究的新领域，这使所有生物的基因、甚至合成基因都成为可供利用的外源基因。通过遗传转化等方法将特定的外源基因导入棉花并使其稳定地遗传表达，以改良特定的性状。应用棉纤维特异表达的启动子可使蚕丝心蛋白基因在棉纤维中特异表达而不在其它部位表达，避免影响棉花植株的性状。
图1为GAE6基因克隆的酶切分析图。
其中泳道1为1kb Ladder Marker DNA分子标准物，泳道2-6分别为GAE6-3A克隆经EcoRI，EcoRI+HindIII，NcoI+EcoRI，HindIII，BamHI酶切产物。
图2为蚕丝心蛋白基因植物转基因载体HAN的构建图。
TFBN蚕丝心蛋白基因的中间载体；BKT中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供的菌种；BFN蚕丝心蛋白基因的中间载体；2301中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供基因表达载体；HAN蚕丝心蛋白基因的植物表达载体；Fibroin蚕丝心蛋白基因；GAE6-3A promoter/E6 promoterE6启动子(棉纤维特异表达的启动子)；Keratin角蛋白基因；35S promoter35S启动子；AMP氨苄青霉素抗性基因；Kanamycin(R)卡那霉素抗性基因；NOS-T终止子；GUSβ-葡萄糖苷酸酶基因。
图3为转基因植物PCR阳性鉴定电泳图。
泳道1为转基因质粒正对照，泳道2-5为转丝心蛋白基因转基因棉花，泳道6为未转基因棉花，泳道7为体系负对照。
图4为基因同源性比较图。
其中QueryFibroin，由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室克隆得到的蚕丝心蛋白轻链基因。
Sbjctfibroin light chain precursor(已发表蚕丝心蛋白轻链基因)。
具体实施例方式
实施例1 棉纤维特异表达的GAE6基因的克隆(1)亚洲棉叶片DNA的少量提取取约100毫克叶片加液氮迅速研磨成粉末，加入500μl抽提缓冲液(500mmol/L NaCl；50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)；50mmol/L EDTA(pH8.0)；1％β-巯基乙醇)；加入60μl 20％的PVP及100μl10％的SDS，混匀；65℃水浴20分钟，加入160μl 3M的KAc(pH4.8)，冰浴30分钟；4℃，15,000rpm离心10分钟，上清移入新管，加0.6倍体积的异丙醇，混匀；冰浴10分钟；4℃，12,000rpm离心5分钟，弃去上清，75％乙醇洗涤后抽干，加入500μlTE溶解；加入等体积的酚∶氯仿∶异丙醇(25∶24∶1)抽提1-2次；12,000rpm室温离心10分钟，吸上清至新管，加入等体积的异丙醇，1/10体积3N的NaAc(pH5.2)，-20℃放置5分钟；4℃，15,000rpm离心10分钟，75％乙醇洗涤沉淀，抽干后获得DNA，溶于100μlTE中。
(2)GAE6基因片段的扩增及序列分析以亚洲棉DNA为模板进行PCR扩增。两个引物分别为E61(5’GCAACCATAGCCATGGCT 3’)和E62(5’GCTTAGTGGACTCGTAGG 3’)。PCR反应体系MgCl2(10×)3μl，PCR反应缓冲液(10×)3μl，dNTPs(2.5μMeach)3μl，E61(25μM)0.5μl，E62(25μM)0.5μl，模板(0.1μg/μl)1μl，牛血清白蛋白(10mg/ml)0.3μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，最后加水至30μl。PCR反应条件94℃预变性10分钟；然后94℃变性40秒，54℃复性30秒，延伸30秒，共30个循环；最后，72℃延伸7分钟。PCR反应后获得一特异扩增产物GAE6基因片段。
PCR产物经Wizard柱(Promega公司)纯化后，采用TA克隆方法将扩增片段装入pGEM-T载体中，转化XL1-Blue，然后对扩增片段进行PCR鉴定和酶切鉴定。DNA序列由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室技术组用Applied biosystem373型全自动荧光序列分析仪测定。结果表明所克隆片段与已发表海岛棉的E6基因高度同源(John ME等，Proc Natl Acad Sci USA，1992，895769-5773)。
(3)从亚洲棉基因组文库中筛选GAE6基因根据上述(2)中所得片段顺序合成两个引物，正向引物为E605’CCATGGCTTCCTCACCAA 3’，反向引物为E635’GGCATTCTTGTTGTAGTAG 3’。以PCR-96孔板方法筛选亚洲棉基因组文库，取1μl基因组文库(λ-ZAP)溶液(约108pfu)与400μl XL1-Blue菌液共培养30分钟后，分置于96孔板各孔中37℃培养8～9小时。每列8孔各取5μl混匀，各取1μl作PCR。选取阳性列的各孔分别作PCR。取阳性孔混合物进行倍比稀释作PCR，以能扩增出条带的最大稀释度进行稀释，再铺96孔板。经7轮筛选，获得一阳性克隆。
该阳性克隆依照Stratagene的实验指南释放质粒。在1.5ml离心管中加入200μl XL1-BLUE细胞，200μl阳性噬菌斑SM溶液，1μl ExAssit helper噬菌体(Stratagen公司)，混匀，37℃温育15分钟。将混合液转至3ml LB中，37℃振荡培养2-2.5小时。2,000g离心15分钟，吸出上清液。70℃温育15分钟，4,000g离心15分钟，吸出上清液。两个1.5ml离心管中各加入200μl新鲜的SOLR细胞，并分别加入上述上清液100、10μl，37℃温育15分钟，各取10-50μl铺LB(含100μg/ml Amp)平板，37℃培养过夜。挑单克隆鉴定。经限制性酶切结果显示该克隆PCR扩增片段约为8.0kb(参见图1)。DNA测序表明该基因为亚洲棉的E6基因，上游启动子长1457个碱基对，命名为GAE6-3A，见SEQ ID No.1。
实施例2 GAE6-3A启动子的表达特异性从棉花基因组文库中分离出棉纤维特异表达启动子，并将该启动子克隆于含有内含子的GUS基因前，基因枪法转化了正常的棉花胚珠和突变体无絮棉胚珠，培养2天后进行组织化学染色检查GUS的活性，结果发现在正常胚珠中染色为多为深蓝色并且GUS阳性比例远远高于突变体，初步说明该启动子具有棉纤维特异性。
实施例3 蚕丝心蛋白基因的克隆(1)蚕丝心蛋白基因RNA的提取取0.1-3g即将成熟的蚕，用液氮研磨成粉末后，转移到50ml的离心管中，加入3ml预冷的提取缓冲液(1M Tris/HCl，50mM EDTA，1.4％SDS(w/v)，0.1％DEPC，Ph9.5)混匀，再加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混匀称。冰上放置1小时，不时颠倒混匀。12,000rpm，4℃离心10分钟。将水相转移至另一离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，混匀后，12,000rpm，4℃离心10分钟。取水相，加入1/2体积的高盐溶液和1/2体积的异丙醇，混匀后-70℃放置30分钟。10,000rpm，4℃离心5分钟，弃去上清，沉淀溶于2ml的DEPC水中。加入1/3体积的8M的LiCl溶液，混匀后，-20℃放置过夜。10,000rpm，4℃离心5分钟，弃去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤后，晾干，用DEPC水溶解。
(2)蚕丝心蛋白基因的扩增提取蚕的RNA后，用TaKaRa公司的反转录试剂盒，反转录成cDNA。20μl体系，42℃反应30分钟，反转录产物在沸水中煮5分钟。
反转录体系MgCl2(25mM)4μl，10xRNA PCR Buffer2μlRnase Free dH2O8.5μldNTP Mixture(10mM)2μlRnase Inhibitor(40U/μl)0.5μlReverse Transcriptase(5U/μl)1μlOligo dT-Adaptor Primer(2.5pmol/μl)1μl
蚕RNA(1μg/μl)1μl取1μl反转录产物，应用引物FBN2(5’GATATCTTAGACGTGAACCTGGCTG 3’)和FBN4(5’CGGGATCCATCGGTGACCATCAATCAATAC 3’)扩增克隆了蚕丝心蛋白基因并测定了其序列。
PCR反应体系10x PCR Buffer 10μldNTP Mixture(2.5μM each) 8μlFBN2(25μM) 3μlFBN4(25μM) 3μl蚕的RNA反转录产物 1μlExTaq DNA polymerase(5U/μl)0.5μlddH2O 74.5μlPCR条件94℃预变性5分钟；然后94℃变性40秒，54℃复性30秒，延伸50秒，共35个循环；最后，72℃延伸7分钟。反应后获得特异的长789bp的扩增片段，克隆至pGEM-T载体中获得TFBN。DNA测序及序列分析表明其为蚕丝心蛋白基因，其核苷酸序列见SEQ ID No.2，与已发表的蚕丝心蛋白基因的同源性达99.2％。
实施例4 蚕丝心蛋白基因的原核表达及抗体的制备应用BamHI和SacI酶切下蚕丝心蛋白基因，克隆至原核表达载体PET-32b(+)中，获得高效表达。从聚丙烯酰胺凝胶中割取蚕丝心蛋白特异表达条带免疫兔(蚕丝心蛋白量为100-200μg)，隔4周加强一次，后隔1周加强一次，共免疫4次，一周后取血清测定效价，作为蚕丝心蛋白抗体。加入0.02％的叠氮钠保存于4℃或直接保存于-70℃备用。
实施例5 植物转基因载体HAN的构建使用中科院上海植物生理研究所开放实验室提供的已构建好的BKT(YuXiao-hong，Zhu Yong-qing等，Acta Phytophysiologica Sinica，2000，26(2)143-147)质粒，BKT质粒经SacI/BamHI双酶切后与TFBN经BamHI/EcoRV双酶切后连接。后用HindIII/SacI双酶切后与2301(中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供)质粒经HindIII/SacI双酶切后连接，构建了由GAE6-3A启动子驱动的植物转基因二元载体HAN(含有35S启动子启动的含有内含子的GUS基因)-KAN-E6-FBN-35S-GUS-KAN-，参见图2。以上所用酶均购自PROMEGA公司，反应温度条件为37℃温育2小时。
实施例6 棉花的转化(1)农杆菌法转化棉花首先培养细菌农杆菌LBA4404(中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供)培养于附加100μg/μl利福平和300μg/μl链霉素的LB培养基中，28℃振荡过夜。HB101(含pRK2013，中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供)菌株培养于含卡那霉素50μg/μl的LB培养基中，37℃振荡过夜。含中间载体的大肠杆菌(DH5α，中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所分子遗传国家重点实验室提供)于含添加卡那霉素50μg/μl的LB培养基中，37℃振荡过夜；三种培养物各取100μl于Eppendorf管内混合，4000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入1ml LB重新悬浮菌体，短时离下菌体，弃去上清液；菌体重悬于50μl LB中，点于LB平板上，28℃培养过夜；次日将过夜培养的培养皿取出，交叉取2环培养，重新悬浮于100μl LB；倍比稀释上述菌悬液；涂板，即取100-200μl菌液涂布于含100μg/μl利福平，300μg/μl链霉素和卡那霉素50μg/μl的LB平板上，28℃培养2-3天；挑单菌落点于含如上三种抗生素的LB平板上，28℃培养2-3天，再筛选一次；挑取数个菌落进行悬浮培养，PCR和质粒酶切鉴定。三亲杂交将构建的转化载体导入根癌农杆菌LBA440后，应用农杆菌法转化棉花。或用电击法将构建的转化载体导入根癌农杆菌LBA4404中。
(2)花粉管微注射法转化棉花大量提取质粒，用于花粉管微注射法转化棉花苏抗103、苏抗310、苏8、苏12、中20、石远321、渝棉等多个品种。
挑单克隆菌落于500ml LB培养基，振摇培养20小时；5,000rpm离心5分钟收菌，弃去上清液；加入5ml溶液1(成分见《分子克隆》第19页)，混匀；加入10ml溶液2(成分见《分子克隆》第20页)，上下颠倒混匀，室温静置5分钟；加入7.5ml溶液3(成分见《分子克隆》第20页)，温和混匀；7,000rpm离心5分钟，取上清液倒入45ml离心管中，加入7.5ml异丙醇，混匀；7,000rpm离心2分钟。上清液倒入另一支45ml离心管中，加6ml异丙醇，混匀；7,000rpm离心5分钟，弃上清液；沉淀用200μl TE悬浮，转入1.5ml小离心管中，再用200μl TE洗一遍含沉淀的离心管，合并于小离心管中，加入2μl RNase(10mg/ml)，37℃，放置30分钟；加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，振荡30秒。12,000rpm离心5分钟；吸上层溶液至新的Eppendorf管中，加入1/10体积的3N醋酸钠，再加总体积2-3倍的无水冷乙醇，-20℃放置10分钟；10,000rpm离心5分钟，弃上清；加入1ml 70％乙醇冲洗后，干燥；将沉淀溶于TE，10％PEG纯化。
于棉花开花后一天将质粒经花粉管途径注射入子房中进行转化，共获得棉花种子1000粒；实施例7 转基因棉花的分子生物学鉴定转基因棉花的分子验证，包括组织化学染色、PCR、Southern杂交、Northern杂交，棉纤维中蚕丝心蛋白的Western分析等。
(1)组织化学染色取棉花种子进行无菌培养，待萌发3天后取根尖进行组织化学染色植物组织浸泡于GUS染色液中，37℃温浴24h，以70％乙醇和90％乙醇各脱色一次。在解剖镜下观察并照相。GUS染色液25ml磷酸缓冲液(pH7.0)，0.25ml 0.1M K3[Fe(CN6)]，0.25ml 0.1M K4[Fe(CN6)]，1ml 0.5M Na2EDTA，ddH2O 23.5ml，Gluc 50mg。共获得GUS阳性植株(根尖GUS染色为蓝色)55棵。
(2)PCR检测选取GUS活性强的51棵植株，提取DNA后进行PCR检测，应用引物P正(5’CACCATTCACCACTTGCTC 3’)和引物FBNR(5’GTTGTTGCTTTGGCTGTTGC 3’)进行PCR，复性温度为54℃，25个循环后，取1μl反应产物，应用引物P3(5’GCTCCTAATTGAGTTGAAATCTTT3’)和FBNP(5‘TTCCGGCGGTTTGGGCCACC 3’)再扩增30个循环，其中22棵棉花扩增出特异条带(参见图3)。
(3)DNA分子杂交a棉花基因组DNA提取方法取1g棉花叶片加液氮研磨成粉末，转移到50ml离心管中，加入5ml抽提缓冲液(500mM NaCl；50mM Tris/Hcl，pH8.0；50mM EDTA，pH8.0；1％β-巯基乙醇)，0.6ml 20％PVP及1ml 10％SDS，轻轻混匀。65℃温育20分钟后，加入1/10体积的5M KAC，冰浴30分钟。4℃，15,000rpm离心10分钟，吸出上清液。加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，冰浴10分钟，4℃，10,000rpm离心5分钟，弃去上清液。沉淀用75％乙醇洗涤后晾干，加入500μl TE溶解。加入适量的RNase，37℃温育30分钟后，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提1-2次。将上层液转移到新管中，加入等体积的异丙醇和1/10体积的3N NaAC(pH5.2)，冰浴10分钟。4℃，12,000rpm离心5分钟后，沉淀用75％乙醇洗涤抽干，溶于100μl TE中。
b DNA杂交任意选取阳性植株，提取基因组DNA，分别以质粒HAN和未转化棉花的基因组DNA为正、负对照进行分子生物学鉴定(Southern)。
(4)转基因植物的Western检测取转基因棉花的棉纤维，用液氮充分研磨后，加入适量的蛋白提取缓冲液(50mM Tris/Hcl，10mM EDTA，pH8.0；1％巯基乙醇)，4℃，15,000rpm，离心10分钟后，取上清液，按卡马斯亮蓝法测定蛋白含量。各取5μg总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，然后用Bio-Rad电转移装置转移到硝酸纤维素膜上(50mA电流转移过夜，4℃)，按Sambrook方法(1989)进行杂交以证明转基因棉纤维中蚕丝心蛋白的表达。兔抗丝心蛋白基因多克隆抗体以1∶300、第二抗体羊抗兔IgG抗体(购自Promega公司)以1∶2500稀释使用。显色剂为BCIP和NBT(购自Promega公司)。
xuliebiao.ST25SEQUENCE LISTING<110>中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所<120>蚕丝心蛋白转基因棉纤维及其基因工程生产方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1457<212>DNA<213>Gossypium arboreum Linn<400>1aattcatagg tataggaaga agccctgtca aatagagatt ttttctttcg accatatttc 60gattgttaat acgatatata aggaccgcta ctacaaatag tactacaccc ttgatcgtga120aatatcgatt gcttgttgaa ccctgtgaat tgcgtgaaag taggatactc caaattcggg180ggtccaagag ttttataaaa cgttcttggt ggaaaaaaat gtgaatgaaa gatcccactg240aattgaattg ggtccatgaa tctaagaaat agtgagaatt ctcctatttt tatttattta300tttgcttagg aagttttact gacactgctt ttatttttcc atcaatcaaa tttaagagac360aattcacttt ttataattaa caaaaaaaaa caaaaagaaa ataaaagaaa ttactttttt420ctttttcgtg ttcgatacaa gatagatgaa atatgaaaaa taaaatgaaa tgaaaatata480ttactagtga tatatcacct ccattatgta ggggaaagaa ataaaaataa tattaattta540tgatacttcc ataatgtggt taaaaataat tatctagtat ttttttgtaa aaaaaaaaag600ttgatatcta tgctactaat gaggtttctt agtgagtttg ttactactaa taaagtttat660
xuliebiao.ST25ttgcatggtt gagaccttat gcttttcaaa tacccatttt tgaattttaa aaattgtgaa720tttttattat atttaaaaaa caagttattt atataactag taatgtatta ttttgacttt780tttttaatcg agttaatgtt ggttatttcg ttataccaat tcaataaaat attttattta840tattaaatta tagcatactc acgatgtggg tgaagtaaaa ttatttaaca aatatatttt900gaaaaattga taaaaatact aaatgaggtt ttggttgaat agtaagatat aattattaca960aattataaat atgtaggttc aaaatctatc atgtgtatat ttgtactatt attctatata1020aattgataac cttataaaag tatctaattt agtttatggt tgattgatcg ataataccaa1080atttattaaa aattaatatt agtaaagata tatagtacaa aactaaacat aaaattttat1140atgttaagga aatagcggaa aaaatatcat atttgtagaa ctgtttagca gtgtgggaga1200atgggatcat tacaaggaaa aatgaaatat atatcattaa taacaaacat aaaagaaagc1260gtcttttgat aaagttgtta ttggtgtaat gtgaagggac cacaatcatc accattcacc1320acttgctcct aattgagttg aaatcttttt acaacataga aaactagaag atcgcccttt1380cttgcttcat atatatagat tttgtatcat cgcaatttca catcacacac acaagtaaag1440cattagcaac catagcc 1457<210>2<211>789<212>DNA<213>Bombyx mori<220><221>CDS
xuliebiao.ST25<222>(1)..(789)<223><400>2atg aag cct ata ttt ttg gta tta ctc gtc gct aca agc gcc tac gct48Met Lys Pro Ile Phe Leu Val Leu Leu Val Ala Thr Ser Ala Tyr Ala1 5 10 15gca cca tcg gtg acc atc aat caa tac agt gat aat gaa att cca cgc96Ala Pro Ser Val Thr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Asn Glu Ile Pro Arg20 25 30gac att gat gat gga aaa gct agt tcc gta ttc tca cgt gca tgg gac 144Asp Ile Asp Asp Gly Lys Ala Ser Ser Val Phe Ser Arg Ala Trp Asp35 40 45tac gtc gat gac acc gac aaa agc atc gcc atc ctc aac gtt caa gag 192Tyr Val Asp Asp Thr Asp Lys Ser Ile Ala Ile Leu Asn Val Gln Glu50 55 60atc ttg aag gac atg gcc agc cag ggc gac tat gca agt caa gca tca 240Ile Leu Lys Asp Met Ala Ser Gln Gly Asp Tyr Ala Ser Gln Ala Ser65 70 75 80gcg gtg gcc caa acc gcc gga att atc gcc cat cta tct gcc ggt atc 288Ala Val Ala Gln Thr Ala Gly Ile Ile Ala His Leu Ser Ala Gly Ile85 90 95ccc ggt gat gcc tgt gca gcc gct aac gtc att aac tct tac aca gac 336Pro Gly Asp Ala Cys Ala Ala Ala Asn Val Ile Asn Ser Tyr Thr Asp100 105 110ggc gtc agg tcc gga aac ttc gcc ggc ttc aga caa tct ctc ggt ccc 384Gly Val Arg Ser Gly Asn Phe Ala Gly Phe Arg Gln Ser Leu Gly Pro115 120 125ttc ttc gga cac gtg gga caa aac ttg aat ctt atc aat caa ctc gtc 432
xuliebiao ST25Phe Phe Gly His Val Gly Gln Asn Leu Asn Leu Ile Asn Gln Leu Val130 135 140acc aac cct ggt caa ctc cga tac tct gtc gga cca gcc ctg ggt tgt 480Thr Asn Pro Gly Gln Leu Arg Tyr Ser Val Gly Pro Ala Leu Gly Cys145 150 155 160gcc gga ggt gga aga atc tat gac ttc gaa gcc gct tgg gat gca atc 528Ala Gly Gly Gly Arg Ile Tyr Asp Phe Glu Ala Ala Trp Asp Ala Ile165 170 175tta gcc agc agt gac tct agt ttc tta aat gaa gag tac tgc atc gtc 576Leu Ala Ser Ser Asp Ser Ser Phe Leu Asn Glu Glu Tyr Cys Ile Val180 185 190aag aga ttg tac aac tct cgc aac agc caa agc aac aac atc gct gcc 624Lys Arg Leu Tyr Asn Ser Arg Asn Ser Gln Ser Asn Asn Ile Ala Ala195 200 205tat ata acc gct cac tta ctt cca cca gtt gct caa gtg ttc cac caa 672Tyr Ile Thr Ala His Leu Leu Pro Pro Val Ala Gln Val Phe His Gln210 215 220tca gct gga tca atc aca gac ctc ctg aga ggc gtt ggc aac ggt aat 720Ser Ala Gly Ser Ile Thr Asp Leu Leu Arg Gly Val Gly Asn Gly Asn225 230 235 240gac gcg acc ggt tta gtt gct aat gct caa aga tat att gca caa gca 768Asp Ala Thr Gly Leu Val Ala Asn Ala Gln Arg Tyr Ile Ala Gln Ala245 250 255gcc agc cag gtt cac gtc taa 789Ala Ser Gln Val His Val260
权利要求
1.一种转基因棉纤维，其特征在于，它是动物丝心蛋白转基因棉纤维。
2.如权利要求1所述的转基因棉纤维，其特征在于，所述的动物丝心蛋白是蚕丝心蛋白。
3.一种如权利要求1或2所述的转基因棉纤维的基因工程生产方法，其特征在于，该方法包括如下步骤a.棉纤维特异表达基因的克隆；b.动物丝心蛋白基因的克隆；c.转基因表达载体的制备；d.棉花转化。
4.如权利要求3所述的转基因棉纤维的基因工程生产方法，其特征在于，所述的棉纤维特异表达启动子为GAE6-3A启动子，其核苷酸序列为SEQIDNo.1，长1457个碱基对。
5.如权利要求3所述的转基因棉纤维的基因工程生产方法，其特征在于，PCR扩增了蚕丝心蛋白基因，其核苷酸序列见SEQ ID No.2，并亚克隆至pPGEM-T载体中构建了质粒TFBN。
6.如权利要求3所述的转基因棉纤维的基因工程生产方法，其特征在于，所述的转基因表达载体为HAN，它是由GAE6-3A启动子驱动的植物转基因二元载体，含有35S启动子启动的含有内含子的GUS基因，该载体由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNO.0726。
7.如权利要求3所述的转基因棉纤维的基因工程生产方法，其特征在于，BKT质粒经SacI/BamHI双酶切后与TFBN经BamHI/EcoRV双酶切后连接，后用HindIII/SacI双酶切后与2301质粒经HindIII/Sac I双酶切后连接构建了转基因表达载体HAN。
全文摘要
一种含动物蚕丝心蛋白基因棉纤维及其基因工程方法。应用中棉基因组DNA经PCR扩增了E6基因片段,根据该序列设计引物,用PCR－96孔板方法筛选亚洲棉基因组文库,得到该基因GAE6－3A克隆,其插入片段长约8kb,上游启动子长1457bp,该GAE6－3A启动子在棉纤维中特异表达。提取了蚕的RNA,反转录后扩增克隆了编码蚕丝心蛋白的基因,并将其装入原核表达载体中获得高效表达后,免疫兔制备蚕丝心蛋白抗体。进一步构建了由GAE6－3A启动子驱动的丝心蛋白植物转基因载体,转化棉花,经组织化学染色、PCR及DNA分子杂交验证蚕丝心蛋白基因已转入棉花中。
文档编号C12N15/12GK1369560SQ0211114
公开日2002年9月18日 申请日期2002年3月22日 优先权日2002年3月22日
发明者陈晓亚, 朱勇清, 许可香, 周宝良, 陈松, 林芝萍 申请人:中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所