专利名称：具有血小板粘附和聚集抑制活性的双特异性单链抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的双特异性单链抗体，特别是涉及具有抗血小板粘附和聚集活性的新的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体，其制备方法及其在抑制血小板粘附和聚集，以及抗血栓形成中的应用。
血栓栓塞性疾病，如心肌梗死、脑血管血栓形成等，是严重危害人类健康，导致人体死亡的主要原因之一。此外，血栓形成还是许多疾病(如肾小球肾炎、糖尿病小血管病变等)发病机制中所涉及的一种重要病理过程。因此，预防和治疗血栓形成，已成为当前临床上普遍采用的方法。血小板在血栓形成过程中起着十分重要的作用。在正常血液循环过程中，血小板处于静止状态。然而，一旦发生血管壁损伤，血小板就会通过其表面膜糖蛋白(GP)Ib-IX复合物中的Ib受体，与血浆von Willebrand因子(vWF)结合并粘附于受损血管处暴露的内皮下组织。粘附的血小板被内皮下组织或局部形成的凝血酶所激活，引发释放反应和花生四烯酸代谢过程。由前者分泌释放的ADP或由后者形成的血栓烷(TX)A2均可导致血小板聚集。血小板聚集受血小板GPIIb/IIIa受体的调解。被激活的GPIIb/IIIa受体通过纤维蛋白原分子在相邻的血小板之间形成横桥，构成血小板聚集的骨架，最终导致血栓形成。血小板释放的TXA2等产物还可进一步与血浆蛋白作用，促进血栓的形成。因此，有效地抑制各阶段中血小板的作用，是预防或治疗血栓形成性疾病的重要途径。GPIIb/IIIa拮抗剂可直接抑制血小板聚集的共同最终途径，所以是比目前已知并在临床上普遍使用的阿斯匹林、噻氯匹啶等其他抗血小板制剂作用更强、更为特异的抗血小板药物。这些药物主要包括三类单克隆抗体(McAb)，人工合成的肽类和非肽类小分子物质。例如，已研制成功并临床应用的人源化抗CD61表位GPIIb/IIIa单克隆抗体7E3(C7EFab，商品名ReoPro)。另外，具有序列RGD(Alg-Gly-Asp)(其为血小板受体配基所共有的特征性序列)的integrelin型环肽也已投入临床应用(参见美国专利6,168,925号)。
为了克服鼠源性McAb具有免疫原性，以及完整抗体的组织穿透性差等缺陷，人们试图基于基因工程和蛋白质工程技术制备各种新型抗体。单链抗体(scFv)就是利用DNA重组技术，通过一个接头序列将抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因相连接并表达产生的的抗体片段。根据不同的研究和应用目的，将两条不同来源的scFv组合成为具有两种不同抗原结合特征的新型抗体(即双特异性单链抗体)，是本领域技术人员普遍关注的研究方向。而且，为了拓展在临床诊断和治疗中和应用，通常选用来源不同的scFv来构建双特异性单链抗体(bisFvs)，这样，bisFv便集中了双功能抗体和单链抗体的两方面特点。因此，无论是作为免疫阻断剂还是药物导向载体，用于免疫成像诊断还是靶细胞识别，双特异性单链抗体在临床上均具有更大的应用潜力。
本发明的一个目的是提供一种具有抑制血小板粘附和聚集活性的双特异性单链抗体。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双特异性单链抗体是由具有抗GPIbα活性的SZ-2单链抗体和具有抗GPIIIa活性的SZ-21单链抗体融合而成的，并且两者之间存在有一个接头序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的双特异性单链抗体基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的接头序列是(Gly4Ser)1-3.
本发明的另一个目的是提供如序列表中SEQ ID NO13所示的编码SZ2/SZ21双特异性单链抗体的DNA序列及其功能等同物。
本发明的再一个目的是提供携带上述DNA序列的重组表达载体。
本发明的再一个目的是提供被所说的重组表达载体转化或转染的宿主细胞。
本发明的再一个目的是提供生产如上限定的双特异性单链抗体的方法，该方法包括
(1)提供SZ2和SZ21的重链和轻链可变区DNA编码序列；(2)通过接头序列(Gly4Ser)1-3将步骤(1)得到的SZ2或SZ21轻、重链可变区的DNA编码序列连接成单链抗体编码序列；(3)将步骤(2)得到的SZ2、SZ21单链抗体DNA编码序列通过接头序列(Gly4Ser)1-3可操作地连接到适当的表达载体上；(4)用步骤(3)的重组表达载体转化或转染适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的宿主细胞，并从所说的细胞和其培养基中回收所需的目的多肽。
本发明的再一个目的是提供如上限定的双特异性单链抗体在生产抗血小板粘附和聚集的药物中的应用。
本发明的再一个目的是提供如上限定的双特异性单链抗体在免疫成像诊断中的应用。
图1显示pET22-21-L-2重组质粒的构建示意图。
图2显示pET22-21-L-2重组质粒的酶切鉴定。其中泳道1为DNA/EcoRI+HindIII分子量标准物；泳道2为pET22-21-L-2的EcoRI单酶切产物；泳道3为pET22的EcoRI单酶切对照物；泳道4为pET22-21-L-2的BamHI/NotI双酶切产物；泳道5为pET22-21-L-2的BamHI/NotI/EcoRI/SalI酶切产物；泳道6为SZ-21的PCR产物；泳道7为接头序列的PCR产物；泳道8为100梯度(ladder)DNA分子量标准物。
图3显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体在大肠杆菌中诱导表达后，菌体蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。其中泳道1为蛋白质标准物；泳道2为未诱导的细菌溶菌产物；泳道3为诱导的细菌溶菌产物；泳道4为诱导的细菌菌体蛋白沉淀；泳道5为诱导的细菌菌体蛋白上清；泳道6为纯化的蛋白质表达产物。A为未诱导的细菌溶菌产物的Western印迹分析结果；B为诱导的细菌溶菌产物的Western印迹分析结果。
图4显示以流式细胞术检测的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的血小板结合活性。框A为血小板阴性对照；框B为SZ-2单克隆抗体与血小板结合阳性对照；框C为SZ-21单克隆抗体与血小板结合阳性对照；框D显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体与血小板的结合。
图5显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体与血小板裂解液结合的Westem印迹分析。泳道1为蛋白质分子量标准物；泳道2为SZ-2单克隆抗体与血小板裂解液结合的阳性对照；泳道3为SZ-21单克隆抗体与血小板裂解液结合的阳性对照；泳道4显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体与血小板裂解液的结合。
图6显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体对瑞斯托霉素诱导的血小板聚集的抑制活性。框A为阴性对照；框B为SZ-2单克隆抗体(10μg/mL)+瑞斯托霉素诱导的血小板(阳性对照)；框C为SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体(20μg/mL)+瑞斯托霉素诱导的血小板。
图7显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体对凝血酶诱导的血小板聚集的抑制活性。框A为阴性对照；框B为SZ-2单克隆抗体(10μg/mL)+凝血酶诱导的血小板(阳性对照)；框C为SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体(20μg/mL)+凝血酶诱导的血小板。
图8显示SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体对ADP诱导的血小板聚集的抑制活性。框A为阴性对照；框B为SZ-21单克隆抗体(10μg/mL)+ADP诱导的血小板(阳性对照)；框C为SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体(30μg/mL)+ADP诱导的血小板。
本发明涉及具有血小板粘附和聚集抑制活性的双特异性单链抗体，特别是涉及由已知分别对血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa具有特异结合活性的SZ-2和SZ-21单链抗体融合而成的双特异性单链抗体。本发明进一步涉及以DNA重组技术生产所说的双特异性单链抗体的方法及其应用。本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体通过特异地结合血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa，有效地抑制血小板的粘附和聚集。
SZ-2是最初由本发明人和其同事制备的一株针对GPIbα的单克隆抗体(阮长耿等，中国科学(B辑)，948-963，1986)。该单克隆抗体不仅可抑制瑞斯托霉素/博托霉素诱导的血小板聚集，即抑制GPIb与vWF的特异性结合，而且还可抑制凝血酶或I型胶原蛋白及血小板活化因子诱导的血小板聚集。为降低鼠原性SZ-2抗体对人体的免疫原性和分子量，探讨其在治疗血栓性疾病中的应用，我们已成功构建并表达了SZ-2单链抗体(阮长耿等，血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2单链抗体的构建、表达及功能研究，中华血液学杂志，待出版)。
同样，SZ-21也是由本发明人和其同事制备的一株新的抗GPIIb/IIIa单克隆抗体(阮长耿等，中华医学杂志，67(2)76-78，1987)。体外和体内试验表明，SZ21抗体可抑制血小板的聚集反应，并能抑制活体动物模型的动静脉血栓形成。我们已成功地构建并表达了SZ21单链抗体(阮长耿等，血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21基因克隆及单链抗体的构建、表达，免疫学杂志，17(3)200-203，2001)。研究证明，我们制得的单链抗体保留了亲本抗体的抗血小板和纤维蛋白原结合能力，并表现有明显的抗血小板聚集和抗血栓形成活性。
对血栓性疾病发病机理以及现有抗血栓药物局限性的深入分析后，我们认识到现有抗血小板制剂基本上只是抑制血小板功能的某一个环节，虽然GPIIb/IIIa拮抗剂是抑制血小板聚集的最终共同途径，但此前由活化的血小板所释放的生物活性物质，同样会对出/凝血的生理平衡产生消极影响。因此，希望制备一种既可抑制血小板的始动活化途径，又可抑制血小板聚集的最终共同途径的新型抗血小板抗体。
本发明人在已分别获得了SZ2和SZ21单链抗体的基础上，应用基因工程和蛋白质工程原理及操作，对两单链抗体进行重组和拼接，得到本发明的新的双特异性单链抗体，从而完成了本发明。
为了实现上述发明目的，可以按照本领域技术人员已知的技术(如参见J.Sambrook，E.F.Fritsck&T.Maniatis，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，2nd ed，Cold Spring Harbour Press，NY，1989)进行基因的分离或合成、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养，以及表达产物的分离与纯化等操作。至于单克隆抗体的制备技术，也是本领域普通技术人员所熟知的。简单地说，用血小板免疫BALB/C小鼠，然后处死动物并分离脾细胞。然后，在聚合剂例如聚乙二醇存在下，将脾细胞的单细胞悬液于骨髓瘤细胞(SP2/0)按适当的细胞比例接触并融合。用常规HAT培养基筛选已融合的杂交瘤细胞。然后，用Western印迹法、免疫沉淀法、酶联免疫吸附法等方法鉴定所需的特异性阳性抗性细胞株。
例如，可应用RT-PCR技术，从SZ2、SZ21杂交瘤细胞中扩增出SZ2和SZ21重链与轻链可变区的DNA编码序列，通过一个接头序列[(Gly4Ser)1-3]将轻链和重链可变区的DNA编码序列连接在一起，并将所得到序列克隆到适当的原核表达载体例如pET22(SZ2)和pET20(SZ21)中，以构建得到所需的表达载体pET22-SZ2scFv和pET20-SZ21scFv(阮长耿等，血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-2单链抗体的构建、表达及功能研究，中华血液学杂志，待出版；阮长耿等，血小板膜糖蛋白单克隆抗体SZ-21基因克隆及单链抗体的构建、表达，免疫学杂志，17(3)200-203，2001))。可根据pET22-SZ2scFv载体中(Gly4Ser)1-3接头的DNA序列，设计并合成一对PCR引物。然后，ET22-SZ2scFv表达载体为模板，PCR扩增得到相应接头的DNA编码序列。借助PCR扩增中引入的适当酶切位点，将所说的多肽编码序列拼接到我们以前构建的，并已知携带SZ-2单链抗体多肽之编码序列的pET22-SZ2scFv载体中SZ-2scFv编码序列的5’末端。然后，再设计并合成另一对适当的PCR引物，从已知携带SZ-21scFv编码序列的重组载体pET20-SZ21scFv中扩增得到编码SZ-21scFv的DNA序列。将该序列可操作地连接到上述pET22-SZ2scFv载体中引入了接头序列的SZ-2多肽编码序列的5’端，从而得到用于表达本发明的双特异性单链抗体(SZ2/SZ21)的重组表达载体pET22-21-L-2(参见实施例1)。如此得到的重组表达载体携带了本发明双特异性单链抗体的编码序列，并且该序列基本上如SEQ ID NO13所示。
作为构建本发明的重组表达载体的起始质粒，可使用任何一种能够在细菌细胞中稳定地保留并复制的质粒载体。这样的起始质粒包括但不只限于pET22b、pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等。但本发明中优选的是高效表达质粒pET22b。
可使用任何一种适当的方法(如CaCl2处理法)将如上得到的重组表达载体转化或转染到适当的原核或真核宿主例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)PlysS中，并在适于表达上述SZ2/SZ21多肽的条件下培养被转化或转染的宿主细胞。培养并增殖细胞后，根据细菌细胞所获得的抗药性来选择转化株。在使用大肠杆菌宿主的情况下，最好利用药物抗性基因作为选择标志基因，例如氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因及博来霉素抗性基因等。
可经简单地离心分离出培养物上清，然后用各种分离和纯化技术从培养物上清和细胞裂解产物中分离并纯化SZ2/SZ21多肽产物。用于纯化和回收所需多肽的方法包括但不只限于硫酸铵沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和层析或这些方法的不同组合。
本发明的纯化的SZ2/SZ21双特异性单链抗体多肽基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列，在不致于对所说多肽的生物学活性造成实质性影响的前提下，可以在序列中加入、删除、取代和置换个别或部分氨基酸，例如删除N或C末端的一个或多个氨基酸、删除或置换全序列中的接头部分、将序列中的一个或多个氨基酸改换成具有相似带电性/疏水性的氨基酸或D型氨基酸等。本领域技术人员也可以理解到，这些改动和改变将落入本发明待批权利要求范围内。
本发明还提供了如SEQ ID NO13所示的编码SZ2/SZ21双特异性单链抗体的DNA序列及其功能等同物，该DNA序列融合了编码SZ2和SZ21单链抗体的编码序列，并且在两者之间加入了一个接头序列。所说的接头序列不表达任何功能性多肽产物，但可有效地改善融合产物的柔曲性和稳定性。同时，本发明还提供了携带上述DNA序列的重组表达载体。所说的重组表达载体可以是适于在原核或真核宿主中表达的重组表达载体，但本发明优选的是pET22-21-L-2。另外，本发明还提供了被所说的重组表达载体转化或转染的原核或真核宿主细胞，特别是大肠杆菌细胞。应特别指出的是，本发明的编码SZ2/SZ21双特异性单链抗体的DNA序列包括但不仅限于如序列表中SEQ ID NO13所示的序列。本领域技术人员可以理解到，在不改变其所编码的氨基酸序列的条件下，对所说的DNA序列的任何加入、删除、取代或置换均将落入本发明待批权利要求范围内。
本发明进一步提供了生产如上限定的双特异性单链抗体的方法，该方法包括
(1)提供SZ2和SZ21的重链和轻链可变区编码序列；(2)通过接头序列(Gly4Ser)1-3将步骤(1)得到的SZ2或SZ21轻、重链可变区的DNA编码序列连接成单链抗体编码序列；(3)将步骤(2)得到的SZ2、SZ21单链抗体DNA编码序列通过接头序列(Gly4Ser)1-3可操作地连接到表达载体上；(4)用步骤(3)的重组表达载体转化或转染适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的宿主细胞，并从所说的细胞和其培养基中回收所需的目的多肽。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的SZ-2和SZ-21抗体的DNA编码序列，可以是基于SZ-2和SZ-21抗体多肽的已知氨基酸从头合成的；也可以是借助适当的引物以聚合酶链式反应(PCR)方法，从已知携带SZ-2单链抗体之DNA编码序列的重组质粒中扩增地到的；或应用RT-PCR技术，从SZ2和SZ21杂交瘤细胞中扩增出SZ2和SZ21的重链和轻链可变区基因后彼此连接而成的。为本发明目的，可使用任何一种能够在细菌细胞中稳定地保留并复制的质粒载体。例如，用于构建本发明的重组表达载体的起始质粒包括但不只限于pET22b、pTZ18R、pBR322、pKK223-3、pUC18、pUC19、pUC119等。但本发明中优选的是高效表达质粒pET22b。另外，用于表达本发明双特异性单链抗体的宿主细胞可以是能够在适当条件下表达外源融合蛋白质的任何原核细胞、真核细胞、植物细胞或昆虫细胞。但为本发明目的，其中优选的是原核细胞，特别是大肠杆菌细胞。可以使用本领域已知的硫酸铵沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、亲和层析等常规方法或这些方法的不同组合，分离并纯化本发明的融合蛋白质，以得到纯度大于或等于98％的蛋白质产物。
可以使用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹试验等方法检测表达产物的血小板结合能力，并使用瑞斯托霉素、凝血酶或ADP诱导的血小板聚集试验研究表达产物的血小板结合功能。结果强有力地表明，如上得到的表达产物不仅具有与血小板暨血小板表面膜糖蛋白Ib和IIIa结合活性，而且能够有效地抑制瑞斯托霉素、凝血酶或ADP诱导的血小板聚集(参见实施例3和4)。
本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体能够识别并结合血小板表面膜糖蛋白(GP)Ib和IIIa，从而可有效地抑制血小板粘附和聚集功能。因此，本发明的SZ2/SZ21双特异性单链抗体既可抑制血小板始动活化环节(即血小板粘附功能)，又可抑制血栓的最终形成过程(即血小板聚集功能)。
由于本发明的双特异性单链抗体既可与GPIIIa结合又可与GPIb结合，致使两者互为导向，实现双价结合，从而比其前体多肽具有更好的特异性和稳定性。另外，本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的分子量相对较小(约64KDa)，所以其免疫原性也相对较低。再者，由于该抗体不带有Fc末端，因此不会因其与网状内皮系统的结合而导致血小板细胞的破坏。
本发明的双特异性单链抗体具有结合血小板表面膜糖蛋白Ib和IIIa的活性，即该双特异性单链抗体同时具有单链抗体SZ-2和SZ-21的双重活性，所以，其不仅可抑制血小板始动活化环节(即血小板粘附功能)，而且，还可抑制血栓的最终形成过程(即血小板聚集功能)。本发明的双特异性单链抗体还具有单克隆抗体所固有的高特异性和高亲合力的优点。因此，本发明的新型单链抗体可以作为一种新的抗血栓侯选药物，具有常规抗血栓药物不可比拟的优点和潜在应用价值。另外，基于本发明双特异性单链抗体的上述这些活性和优点，其还可作为一种高特异性和高亲合力诊断试剂，用于动、静脉血栓的无损伤性影像诊断。
以下借助非限制性实施例举例详细描述本发明。本领域技术人员可以在不背离本发明的基本精神和原则前提下，改变或改动本说明书中描述的某些技术内容或技术环节，但人们可以理解到，这些平行的改变或改动均将包括在本发明的待批权利要求范围之内。
实施例1pET22-21-L-2表达载体的构建本实施例旨在举例说明用于表达本发明的SZ2/SZ21双特异性单链抗体多肽的重组表达载体的构建。
(1)重组质粒pET22-2scFv的构建(a)SZ-2可变区基因的克隆使用Triol试剂盒(Gibco BRL)，从能够分泌SZ-2抗体并生长良好的杂交瘤细胞(阮长耿等，中国科学(B辑)，948-963，1986)中提取总RNA。使用随机引物，逆转录合成cDNA。然后以此合成的cDNA为模板，并使用下列轻/重链引物P15’-AGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGG(SEQ ID NO1)和P25’-TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG(SEQ ID NO2)，以及P35’-GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA(SEQ ID NO3)和P45’-GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC(SEQ ID NO4)，分别扩增SZ-2的VH和VL基因。以常规方法纯化并回收这些PCR扩增产物后，将他们连接到pUC-Tm(上海生工生物工程公司)载体上。用所得到的连接反应产物转化感受态大肠杆菌TG1细胞，并于培养后在X-gal和IPTG显示标志下挑选白色菌落。选择阳性克隆进行DNA测序(VH和VL基因序列见GenBank，基因序列登录号为VHAF468835；VLAF468836)。
(b)SZ-2单链抗体表达载体的构建将如上得到的克隆载体VH-Tm和VL-Tm并分别用Pst I/Bst EII和Sac I/Xho I双酶切，回收并纯化VH、VL片段后，依次将它们克隆到PSW1-ScFv(英国剑桥大学MCR实验室Winter博士惠赠)载体中。用所得到的重组质粒转化感受态TG1细胞并从被转化的细胞中抽提质粒DNA，然后以酶切法初步鉴定阳性重组子。以阳性重组子为模板，并使用引物P55’-CCAGGTCGACCTGCAGGAGTCAGG(SEQ ID NO5)和P65’-TATGCGGCCGCCTCGAGCTTGGTCC(SEQ ID NO6)，扩增如上得到的VH-VL连接片段。将所得到的连接片段克隆到pUC-Tm载体中，以酶切法筛选阳性克隆。测序并用Sal I/Not I双酶切后，回收并纯化所需的小片段。然后将它们与已用同样酶切的表达载体pET22b连接，得到定名为pET22-2scFv的重组质粒。
(2)重组质粒pET20-21scFv的构建(a)SZ-21可变区基因的克隆使用Triol试剂盒(Gibco BRL)，从能够分泌SZ-21抗体并生长良好的杂交瘤细胞(阮长耿等，中华医学杂志，67(2)76-78，1987)中提取总RNA。使用随机引物，逆转录合成cDNA。然后以此合成的cDNA为模板，使用(1)中所述的同样引物和方法扩增VH和VL基因。以常规方法纯化并回收PCR扩增产物后，将他们连接到pUC18(Invetrogen)载体上。用连接反应产物转化TG1感受态大肠杆菌，然后在X-gal和IPTG显示标志下挑选白色菌落。选择阳性克隆进行DNA测序(VH和VL基因序列见GenBank，基因序列登录号为VHAF354053；VLAF354054)。
(b)SZ-21单链抗体表达载体的构建将如上得到的VH和VL基因片段先后克隆到PSW1-ScFv载体中，并用所得到的重组质粒转化感受态TG1细胞。从被转化的细胞中抽提质粒DNA，并以酶切法初步鉴定阳性重组子。以阳性重组子为模板，使用引物P75’-ATTCTGCAGTCGGATCCGGAGTCAGGACCTGAGCTG(SEQ ID NO7)和P85’-TTAGCGGCCGCGAGCTTGGTCCCCCCTCC(SEQ ID NO8)扩增VH-VL连接片段。将所得到的连接片段克隆到pUC18载体中，得到重组载体VHVL-pUC18。用BamH I/Not I双酶切该克隆后，回收并纯化所需的小片段。然后，将它们与已用同样酶切处理的表达载体pET20b连接，得到定名为pET20-21scFv的重组质粒。
(3)pET22-21-L-2表达载体的构建简单地说，按照图1所示的构建流程，首先基于SZ-2单链抗体的氨基酸序列和待引入的接头序列[(Gly4Ser)3]设计并合成一对引物P95’-CACGAATTCCGTCTCCTCAGGTG(SEQ ID NO9)和P105’-GGTGTCGACGATGTCCGATCCG(SEQ ID NO10)，并以已知携带SZ-2编码序列的表达载体pET22-2scFv作为模板，扩增所需的接头片段基因。PCR反应中所使用的扩增体系为pET22-2scFv载体1μg，P9和P10引物各10pmol，10mM dNTP 1μl，Taq plus聚合酶2U，10×反应缓冲液5μl，加水至50μl。热循环条件为94℃5分钟，94℃1分钟，58℃1分钟，72℃30秒，共35个循环，然后72℃延伸7分钟。1.5％Agarose电泳检测扩增产物约70bp，与预期大小一致(图2)。使用QIAEX II胶回收试剂盒(Qiagen)回收并纯化PCR产物。然后，使用含有PUC-Tm载体1μl，PCR纯化产物6μl，T4连接酶1μl(3U)，50％PEG 1μl，10×Buffer 1μl的联接混合物连接18小时。用此连接产物(5μl)转化感受态大肠杆菌TG1(100μl)。将被转化的细菌均匀涂布于含氨苄青霉素及X-gel和IPTG显色标志的琼脂平皿上，37℃保温过夜后挑取白色菌落并以常规碱裂解法抽提重组质粒。根据酶切片段大小，筛选阳性重组子。测序结果表明，扩增产物即为目的基因片段。PCR产物纯化后，用Sal I/EcoR I双酶切，回收并纯化小片段，与同样酶切处理的pET22-2scFv单链抗体表达载体连接后，转化感受态大肠杆菌JM109菌株。将被转化的细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素平皿上，选择阳性克隆并筛选阳性质粒。
以SZ-21单链抗体表达载体为模板并使用引物P115’-TATTGGCCATGGCGGAAGTCAGGA(SEQ ID NO11)和P125’-TGATCGGAATTCGCCGCGAGCTTGGTCC(SEQ ID NO12)，扩增其中的SZ-21单链抗体片段基因。反应中所使用的扩增体系为SZ-21单链抗体表达载体1μg，P11、P12引物各10pmol，10mM dNTP 1μl，Taq plus聚合酶2U，10×反应缓冲液5μl，加水至50μl。PCR循环条件为94℃预变性5分钟，然后94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分30秒，共35个循环后72℃延伸7分钟。电泳检测(1.0％Agarose)结果表明，扩增产物具有预期的大小(约750bp)(见图2)。将该片段与PUC-Tm载体连接后，进行测序分析以验证之。纯化此PCR产物并用BamH I/EcoR I双酶切，然后回收并纯化酶切片段。将所需的片段与同样酶切处理的上述阳性载体连接后，用连接产物转化感受态大肠杆菌JM109菌株。将被转化的细菌涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的平皿上，选择阳性克隆并酶切筛选阳性质粒(见图2)。结果获得了含完整SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体基因的重组表达载体pET22-21-L-2。SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的DNA编码序列如SEQ ID NO13所示。
实施例2SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体在大肠杆菌中的诱导表达及表达产物的分离和纯化(1)SZ-2/SZ-21双特异单链抗体在大肠杆菌中的诱导表达按照常规方法，用pET22-21-L-2质粒转化感受态大肠杆菌菌株BL21(DE3)plys(Novagen)。然后将被转化的细胞涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素和34μg/ml氯霉素的平皿中。基于抗生素抗性挑取单个阳性菌落(Ampr)并接种至2ml LB培养液(含100μg/ml氨苄青霉素，34μg/ml氯霉素)中，37℃振摇培养过夜。培养后收集细菌细胞，并按1∶20(V/V)接种于50ml含相同浓度抗生素的LB中，37℃继续振摇培养。待A600＝0.6时，加IPTG(1mmol/L)诱导，37℃振摇培养4.5小时。培养完成后，离心收集细菌细菌，进行电泳(10％SDS-PAGE)分析。结果在分子量约64kDa处可见一条明显的蛋白条带(见图3)。
(2)表达产物的Western印迹分析离心收集诱导的和非诱导的细菌并用加样缓冲液裂解后，离心收集上清并将裂解产物转移至硝酸纤维薄膜上。2％BSA封闭后，以Penta-His(Qiagen)为第一抗体，以辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(GAM-HRP)(上海华美公司)为第二抗体，并以氯奈酚为显色剂进行Western印迹分析。结果表明诱导表达的多肽即为本发明的目的多肽(见图3)。
(3)表达产物(包涵体)的分离离心(5000rpm，4℃，10分钟)收获细菌。用含有NaCl(0.15mol)的Tris-HCl(20mmol/L)洗涤液洗1次后，加入1/10(V/V)溶菌液(20mmol/L Tris-HCl，1％Triton X-100，250μmol/LPMSF，100μg/ml溶菌酶)，30℃处理15分钟，然后在冰上超声处理(输出功率80％)10秒钟并以10秒钟间隔反复3～5次，至细胞悬液不再粘稠。再次离心(15000rpm，4℃，20分钟)收集上清及沉淀。向沉淀物中加2.5ml Binding缓冲液(5mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tirs-HCl，6M尿素)，冰中搅拌溶解1小时，4℃离心(16000rpm)20分钟后收集上清并用0.45μm滤膜(Millipor)过滤之。
(4)表达产物的纯化和复性取His-Bind Rasine凝胶(Novagen)1ml装柱，并依次用3倍体积的双蒸水、5倍体积的Charge缓冲液(50Mm NiSO4)和3倍体积的结合(5mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)缓冲液上柱处理凝胶。然后将上述包涵体提取液上柱(流速为10倍柱床体积/小时)，并依次用10倍体积的结合缓冲液和6倍体积的洗涤缓冲液(60mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)洗柱。最后用6倍体积的洗脱缓冲液(300mM咪唑，0.5mM NaCl，20mM Tris-HCl)洗脱所需的蛋白质。本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO14所示。
收集洗脱的蛋白质，分别在400ml下列溶液中透析①2mol/L尿素，1mmol/L氧化型谷胱甘肽；②2mol/L尿素+0.5mmol/L还原型谷胱甘肽；③0.15M NaCl，50mM Tirs-HCl。用PEG20000初步浓缩后，再次超滤(MicroconTM10)浓缩。以Bradford法定量蛋白质，结果纯化SZ-2/SZ-21双特异单链抗体的产量达65mg/L。
实施例3SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的血小板结合活性本实施例描述分别以酶联免疫吸附法(ELISA)、流式细胞术和Western印迹法，检测本发明SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的血小板结合活性。
(1)ELISA法用TEN溶液(Tris，EDTA，)将得自健康人全血的富含血小板血浆(PRP)洗3次，然后以2×105血小板/孔的浓度包被微量滴定板。4℃封闭过夜并用0.5％戊二醛固定。洗涤(PBS)后，向其中加入稀释至不同浓度的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体，并于37℃下保温2小时。然后，以Penta-His作为第一抗体并以GAM-HRP作为第二抗体，进行常规ELISA检测，结果以A492值表示。同时，以BSA-PBS作为阴性对照，并分别以SZ-2和SZ-21单克隆抗体作为阳性对照。结果如下列表1所示。
表1 SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体与血小板结合的ELISA法检测结果(OD492)抗体浓度(μg/ml)10 1 0.1 0.01SZ-2 mAb1.1971.066 0.839 0.171SZ-21 mAb 1.3201.242 1.185 0.985SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体0.8370.558 0.445 0.0872％BSA-PBS 00 0 0从表1所示的结果可以看出，SZ-2/SZ-21双特异单链抗体具有良好的与血小板结合活性。
(2)流式细胞术向SZ-2/SZ-21双特异单链抗体(1μg)在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中形成的溶液(总体积为100μl)内，加入3μl PRP(血小板浓度为3×108/ml)并于室温下放置30分钟。洗涤后，以Penta-His作为第一抗体并以荧光素标计的GAM作为第二抗体，在流式细胞仪上进行流式细胞分析。同时，以BSA作为阴性对照，并分别以SZ-2和SZ-21单克隆抗体作为阳性对照。由图4所示结果可以看出，1μg SZ-2单抗与血小板结合率为86％，1μgSZ-21单抗与血小板结合率为87％，而1μg SZ-2/SZ-21双特异单链抗体与血小板结合率为79％，且荧光强度明显高与SZ-2或SZ-21单抗。这些结果表明，本发明的SZ-2/SZ-21双特异单链抗体具有与血小板结合的能力。
(3)Western印迹法从抗凝全血中分离富含血小板血浆(PRP)，用TEN溶液洗3次后，将血小板数调整至1×108/ml。向该血小板悬液中加入1mmol/L PMSF、1％TritonX-100裂解血小板后，离心收集上清，按40μl/孔的加样量，进行还原性SDS-PAGE(8％)电泳。转移至硝酸纤维薄膜上并用2％BSA-PBS封闭后，加SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体37℃温育2小时。以Penta-His为第一抗体，并以GAM-HRP为第二抗体，进行Western印迹分析。同时，以SZ-2或SZ-21单抗作为阳性对照。由图5可见，SZ-2/SZ-21双特异单链抗体既表现有与SZ-2单抗相同的血小板膜糖蛋白(GP)Ib结合活性，又表现有与SZ-21单抗相同的血小板膜糖蛋白(GP)IIIa结合活性。
实施例4SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的血小板粘附和聚集抑制活性本实施例描述分别以瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验、凝血酶诱导的血小板聚集试验和ADP诱导的血小板聚集试验，检测本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体的血小板聚集抑制活性。
(1)瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验取健康人枸橼酸盐抗凝全血，从中分离富含血小板血浆(PRP)，并调整血小板浓度至3×108/ml。取20μl不同浓度的SZ-2/SZ-21双特异单链抗体加入180μl PRP中。同时取SZ-2作为阳性对照，并以PBS作为阴性对照。37℃孵育5分钟后，加入瑞斯托霉素(Sigma，终浓度为1.25mg/ml)以诱导血小板聚集。使用血小板聚集仪检测聚集结果。由图6可见，PBS阴性对照中血小板最大聚集率为74％，SZ-2单抗阳性对照(10μg/mL)中血小板最大聚集率为30％，而SZ-2/SZ-21双特异单链抗体(20μg/mL)中血小板最大聚集率为34％。这些结果清楚地表明，本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体可有效地抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集。
2)凝血酶诱导的血小板聚集试验取健康人EDTA抗凝全血，从中分离富含血小板血浆(PRP)。使用血小板洗涤液(0.5％EDTA-Na2，NaCl 0.137M，KCl 2.7mM，NaHCO312mM，NaH2PO40.36mM，葡萄糖5mM)洗涤后，调整血小板浓度至3×108/ml。取20μl不同浓度的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体加入180μl血小板悬液中。同时，取SZ-2作为阳性对照，并以PBS作为阴性对照。37℃孵育5分钟后，加入凝血酶(珠海Dalte，终浓度为10u/ml)以诱导血小板聚集，并以血小板聚集仪检测聚集结果。由图7可见，PBS阴性对照中血小板最大聚集率为70％，SZ-2单抗阳性对照(10μg/mL)中血小板最大聚集率为13％，而SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体(20μg/mL)中血小板最大聚集率为19％。因此这些结果表明，SZ-2/SZ-21双特异单链抗体可有效地抑制凝血酶诱导的血小板聚集。
(3)ADP诱导的血小板聚集试验取健康人枸橼酸盐抗凝全血，从中分离富含血小板血浆(PRP)，并调整血小板浓度至3×108/ml。取20μl不同浓度的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体加入180μl PRP中，同时取SZ-21作为阳性对照，并以PBS作为阴性对照。37℃孵育5分钟后，加入ADP(Sigma，终浓度为2μM)以诱导血小板聚集，并使用血小板聚集仪检测聚集结果。由图8可见，PBS阴性对照中血小板最大聚集率为73％，SZ-21单抗阳性对照(10μg/mL)中血小板最大聚集率为21％，而SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体(30μg/mL)中血小板最大聚集率为29％。这一结果也同样表明，本发明的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体可有效地抑制凝血酶诱导的血小板聚集。
序列表(1)一般信息(I)申请人江苏省血液研究所(II)发明名称具有血小板粘附和聚集抑制活性的双特异性单链抗体(III)序列数14(IV)通讯地址(A)联系人阮长耿(B)街道十梓街96号(C)城市苏州(D)国家中华人民共和国(E)邮编215006(V)计算机可读形式(A)介体类型3.5英寸软盘(B)计算机IBM PC(C)操作系统WINDOW9(D)软件WORD98(VI)电讯信息(A)电话86-0512-5101708(B)电传86-0512-5101708(2)SEQ ID NO1的信息(I)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO1AGGTCCAGCTGCAGGAGTCTGG(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)长度34碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO2TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)长度34碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO3GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO4GTTAGATCTCGAGCTTGGTCCC(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO5CCAGGTCGACCTGCAGGAGTCAGG(2)SEQ ID NO6的信息(I)序列特征(A)长度25碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO6TATGCGGCCGCCTCGAGCTTGGTCC(2)SEQ ID NO7的信息(I)序列特征(A)长度36碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO7ATTCTGCAGTCGGATCCGGAGTCAGGACCTGAGCTG-(2)SEQ ID NO8的信息(I)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO.8TTAGCGGCCGCGAGCTTGGTCCCCCCTCC(2)SEQ ID NO9的信息(I)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO9CACGAATTCCGTCTCCTCAGGTG(2)SEQ ID NO.10的信息(I)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO10GGTGTCGACGATGTCCGATCCG(2)SEQIDNO11的信息(I)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO11TATTGGCCATGGCGGAAGTCAGGA(2)SEQ ID NO12的信息(I)序列特征(A)长度28碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型DNA(III)序列描述SEQ ID NO12TGATCGGAATTCGCCGCGAGCTTGGTCC(2)SEQ ID NO13的信息(I)序列特征(A)长度1494碱基对(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑结构线性(II)分子类型基因(III)序列描述SEQ ID NO13GAG TCA GGA CCT GAG CTG GTG AAC CCT GGA GCT TCA ATG AAG ATT TCCTGT AAG GCA TCT GGT TAC TCA TTC ACT GGC TAC ACC ATG AAC TGG GTGAAA CAG AGC CAT GGA AAG AAC CTT GAG TGG ATT GGA CTT ATT AAT CCTTAC CAT GGT GGT TCT AGC TAC AAC CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACATTG ACT GTA GAC AAG TCA TCC AGC ACA GCC TAC ATG GAG CTC CTC AGTCTG ACA TCT GAG GAC TCT GCG GTC TAT TTC TGT GCA AGA AGG GAT GCTAAC TAC GTT TTT TTC TTT GAC TAC TGG GGC CAA GGG ACC ACG GTC ACCGTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGCGGA TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA GCA CTC ATG TCT GCA TCTCCA GGG GAG AAG GTC ACC ATG ACC TGC AGT GCC AGT TCA GGT GTA AGTTAC ATT CAC TGG TAC CAG CAG AAG TCA GGC ACC TCC CCC AAA AGA TGGATT TAT GAC ACA TCC AAA CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGTGGC AGT GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AAC ATG GAGGCT GAA GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT AGT AAA CCACCC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG CTC GCG GCG AAT TCC GTC TCC TCAGGT GGA GGC GGT TCA GGC GGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GACATC GTC GAC CTG CAG GAG TCA GGT GGA GGA TTG GTG CAG CCT AAA GGGTCA TTG AAA CTC TCG TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AAT ACC TACGCC ATG AAC TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTG GAA TGG GTTGCT CGC ATA AGA AAT AAA AAT AAT AAT TAT GCA ACG CAT TAT GCC GAGTCA GTG AAA GAC AGG TTC ATC ATC TCC AGA GAT GAT TCA CAA AGC ATGCTC TAT CTG CAA ATG AAC AAC TTG AAA ACT GAG GAC ACA GCC ATG TATTAC TGT GTG AGG CCC TTT AGT ACG GCT ACA GGG GCT ATG GAC TAC TGGGGC CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GGA GGC GGT TCA GGCGGA GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCTCCA TCC AGT CTG TCT GCA TCC CTT GGA GAC ACA ATT ACC ATC ACT TGCCAT GCC AGT CAG AAC ATT AAT GTT TGG TTA AGC TGG TAC CAG CAG AAACCA GGA AAT ATT CCT AAA CTA TTG ATC TAT AAG GCT TCC AAC TTG CACACA GGC GTC CCA TCA AGG TTT AGT GGC AGT GGA TCT GGA ACA GGT TTCACA TTA ACC ATC AGC AGC CTG CAG CCT GAA GAC ATT GCC ACT TAC TACTGT CAA CAG GGT CAA AGT TAT CCT CTC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAGCTC GAG(2)SEQ ID NO14的信息(I)序列特征(A)长度498氨基酸(B)类型多肽(C)链型单链(D)拓扑结构线性(II)分子类型多肽(III)序列描述SEQ ID NO14Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Asn Pro Gly Ala Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser GlyTyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu TrpIle Gly Leu Ile Asn Pro Tyr His Gly Gly Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala ThrLeu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu AspSer Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Thr Arg Asp Ala Asn Tyr Val Phe Phe Phe Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly GlyGly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu LysVal Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser GlyThr Ser Pro Lys Arp Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe SerGly Ser Gly Ser Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Gly Thr SerTyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ala AlaAsn Ser Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser AspIle Val Asp Lle Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu SerCys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Aln Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro GlyLys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Asn Lys Asn Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr AlaGlu Ser Val Lys Asp Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asp Ser Gln Ser Met Leu Tyr Leu GlnMet Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Val Arg Pro Phe Ser Thr AlaThr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser SerLeu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val TrpLeu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu IIe Tyr Lys Ala Ser AsnLeu HisThr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu ThrIle Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro LeuThr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
权利要求
1.具有血小板粘附和聚集抑制活性的SZ-2/SZ-21双特异性单链抗体。
2.根据权利要求1的双特异性单链抗体，其中所说的双特异性单链抗体是由具有抗GPIbα活性的SZ-2单链抗体和具有抗GPIIIa活性的SZ-21单链抗体融合而成的，并且两者之间存在有接头序列。
3.根据权利要求1的双特异性单链抗体，其中所说的双特异性单链抗体基本上具有如序列表中SEQ ID NO14所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的双特异性单链抗体，其中所说的接头序列是(Gly4Ser)1-3.
5.如序列表中SEQ ID NO13所示的编码SZ2/SZ21双特异性单链抗体的DNA序列及其功能等同物。
6.携带权利要求5所限定的DNA序列的重组表达载体。
7.被权利要求6的重组表达载体转化或转染的宿主细胞。
8.生产如权利要求1所限定的双特异性单链抗体的方法，该方法包括(1)提供SZ2和SZ21的重链和轻链可变区DNA编码序列；(2)通过接头序列(Gly4Ser)1-3将步骤(1)得到的SZ2或SZ21轻、重链可变区的DNA编码序列连接成单链抗体编码序列；(3)将步骤(2)得到的SZ2、SZ21单链抗体DNA编码序列通过接头序列(Gly4Ser)1-3可操作地连接到适当的表达载体上；(4)用步骤(3)的重组表达载体转化或转染适当的宿主细胞；(5)培养步骤(4)的宿主细胞，并从所说的细胞和其培养基中回收所需的目的蛋白质。
9.如权利要求1所限定的双特异性单链抗体在生产抗血小板粘附和聚集的药物中的应用。
10.如权利要求1所限定的双特异性单链抗体在免疫成像诊断中的应用。
全文摘要
本发明涉及由已知分别对血小板表面糖蛋白GPIbα和GPIIIa具有特异结合活性的SZ－2和SZ－21单链抗体融合而成的双特异性单链抗体。本发明的双特异性单链抗体同时具有单链抗体SZ－2和SZ－21的双重活性，其不仅可抑制血小板始动活化环节(即血小板粘附功能)，还可抑制血栓的最终形成过程(即血小板聚集功能)。因此，本发明的新型单链抗体作为一种新的抗血栓候选药物，具有常规抗血栓药物不可比拟的优点和潜在应用价值。
文档编号C12N15/11GK1445241SQ0211110
公开日2003年10月1日 申请日期2002年3月20日 优先权日2002年3月20日
发明者阮长耿 申请人:苏州大学附属第一医院