专利名称：一种利用基因工程培育新型不育系的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和分子育种技术领域，特别是涉及一种利用基因工程培育新型不育系的方法，具体涉及到利用基因工程技术开发新型芸薹属物种细胞核不育系，将不育系转移到其它物种，一系两用，实现新的两系法种子生产的方法。
背景技术：
杂种优势利用为解决全球粮食危机起了举足轻重的作用。杂种优势是否能够成功应用取决于是否有育性彻底、操作方便和不存在与不育基因连锁的不良性状的不育系，以及是否有对应的恢复完全和没有与不良性状连锁的恢复系。目前作物不育体系主要有三类，一类是细胞质不育，有时也被称为细胞质和细胞核互作不育系；第二类为细胞核雄性不育；第三类为基因工程雄性不育。第一类不育类型操作相对简单，不存在核不育系中需要去掉50%可育株情况；第二类细胞核雄性不育一般育性彻底，配制组合自由，容易出现强优势组合，特别是隐性核不育，许多材料都可以作为其恢复系，并且不受细胞质的影响；第三类为基因工程雄性不育，一般育性彻底和含有除草剂基因，制种纯度高，转育相对容易。下面以油菜为例，介绍其不育系利用情况。目前我国栽培的油菜中，主要是甘蓝型油菜。利用雄性不育系生产杂交种是我国油菜杂种优势利用的主要途径。目前我国选育的杂交油菜品种，大约有50%杂交种主要是利用amMA和Polima等细胞质雄性不育系生产。有40%的杂交种是利用细胞核雄性不育系制种，包括30%的无上位性基因控制的隐性核不育和10%的上位基因控制的隐性核不育和显性核不育系，剩下的杂交种主要是化学杀雄制种其它类型。用于甘蓝型油菜育种的细胞核雄性不育基因材料主要有3类一类是受两对显性基因Ms和Rf互作控制的核不育材料，如宜3A ；—类是由双隐性基因(mSlmSlmS2mS2)控制的核不育材料，如117A;另外一类是基因互作类型，如甘蓝型油菜核不育系20118A不育基因型为 aabbRfRf 或 aabbRfrf。细胞质雄性不育(CMS)迄今为止，已报道的油菜CMS系约有20个，在生产中比较常用的有以下几个(1)萝卜胞质不育系统；O) Nap胞质不育系统Nap CMS)，又称Siiga— Thompson系统；(3)波里马胞质不育系统(Polima CMS、Pol CMS或波里马CMS) ； (4)陕2A 胞质不育系统(陕2A CMS或Sian 2A CMS) ； (5)M1胞质不育系统(Ml CMS)。其中，从所配三系杂交种的数量和杂交种的推广面积来看，最有实用价值的油菜CMS为Polima CMS、陕 2A CMS两大系统和萝卜胞质不育系统。尽管a!an2A和Polma细胞质雄性不育系为中国甚至世界油菜做出了重要贡献，但其细胞质单一，并且易受温度影响，育性的不稳定性导致可育和不育的转变，杂交种制种纯度下降，一定比例的不育株的存在影响了杂交种产量潜力的发挥。所以发掘和创建新型雄性不育细胞质一直是油菜品种改良的重要课题。Ogu CMS是一个新的油菜胞质雄性不育类型(刘后利，1985;傅廷栋，2000)。目前改良后的Ogu不育系具有以下优点几乎所有的甘蓝型油菜品种都是它的保持系；在不同的温光条件下甘蓝型油菜萝卜质不育材料的不育性表现都非常稳定，不受环境条件影响， 并且其不育性彻底，无微粉现象发生，但受剧烈温差影响出现死花蕾现象，恢复基因来源单一，恢复系转育繁琐，育种周期相对较长。德国NPZ公司发现的一种新的不育类型MSL，在国外使用比较广泛。具有恢复系非常多，育性彻底的优点，但也有保持系比较难培育和不育系死蕾严重的现象。细胞工程雄性不育最具有代表性的为TA^-barnase基因及转基因杂种油菜。 Goldberg最早在烟草花器中发现TA^启动子。Marlani等研究发现，外源的TA^核酸酶基因在绒毡层中特异表达时，致使绒毡层细胞败育，花粉发育不正常而表现为雄性不育。同时，有人将绒毡层专一启动子TA^与核酸抑制物基因构成融合基因导人植物，与上述导入 TA29核酸酶基因后得到的雄性不育株杂交，在Fl杂交种中，由于TA^核酸抑制物基因表达，抑制了 TA^核酸酶的活性，从而育性恢复。现在这一技术已经大面积推广。缺点是在培育新的杂交组合时，不育系和恢复系要同时转育，育种周期较长。核不育育种是油菜杂种优势利用的重要途径之一，特别是隐性核不育系表现稳定，恢复系广，易选配强优组合，易于回交转育获得新的不育系，并且一般不受恢保关系的限制，近年来应用较多，主要有双隐性核不育和三隐性核不育等。然而目前隐性核不育多采用两系法，虽然恢复系很多，配制组合容易，但在制种时需要拔掉一半的可育单株，造成重大的人力资源浪费。近几年，也有人发现了具有上位抑制基因的三隐性核不育和显性核不育，虽然部分解决了拔掉一半可育单株的问题，但临保系选择比较费时费力，在培育不育体系时花掉很多时间和精力，影响了育种速度。在隐性核不育系制种时，若去掉50%可育株不及时，会导致可育株和不育株杂交而影响制种的纯度。虽然油菜杂种优势利用应用广泛，但各种不育系都有自己的不足。若将隐性细胞核不育的恢复系广泛、组合配制容易、育性彻底、并且不受环境影响等优点，与基因工程的抗除草剂基因结合，然后再将两系育种可以简化育种程序结合起来，将大大提高制种效率和制种纯度。目前尚未有关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用基因工程培育新型细胞核雄性不育系的方法。该方法利用基因工程导入三类基因隐性核不育基因、筛选用的抗除草剂基因及携带有诱导启动子的恢复基因。可克服目前油菜隐性核不育两系法制种时需要拔除一半可育单株的问题，利用抗除草剂基因可以提高制种纯度，为芸薹属的杂种优势利用提供新的途径。本发明的思路如下
从报道的隐性核不育基因中选择一种控制甘蓝型油菜隐性核不育的基因及其等位的恢复基因。以35S启动子连接隐性核不育基因，以及抗除草剂基因，接着以化学物质或光诱导型启动子连接对应的恢复基因，构建三类组合基因。以基因工程方法将其导入甘蓝型油菜中，获得转基因不育株系，喷洒化学试剂(若恢复基因携带的启动子为化学试剂诱导型启动子，喷洒试剂后不育转变为可育)或光照处理(若恢复基因携带的启动子为光照诱导型启动子，则可以种植在不同纬度或不同海拔的区域使不育转变成可育)诱导恢复基因的表达和获得相应的种子，此种子为不育系种子，所得单株可以与其它材料(绝大部分为恢复系)测配配制杂交组合；此不育系在转育时可以直接与优良材料回交多次，然后根据需要喷洒除草剂筛选出目标单株，可简化转育程序和节约转育时间。本发明依次通过如下步骤实现
1)采用植物表达载体PCAMB1301作为甘蓝型油菜转基因载体，将35S启动子连接隐性核不育基因以及抗除草剂基因，再以诱导型启动子与等位恢复基因连接，构建三类组合基因的表达载体pCAMB 1301 ；
2)连接产物转化大肠杆菌菌株DH10B，在含有卡拉霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，阳性的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株LBA4404，得到阳性工程菌株；
3)采用常规的农杆菌介导法进行甘蓝型油菜遗传转化；
4)TO代植株检测为阳性的单株观察育性表现，通过RT-PCR和Southern杂交检测，确定阳性转基因隐性核不育单株；将成功导入不育基因的不育单株根据启动子类型苗期喷施化学试剂或光照处理，调节诱导型启动子，恢复基因表达，使不育变成可育单株，然后收获种子；
5)不育系的转育以成功导入目的基因的不育单株为母本、以甘蓝型油菜为父本杂交， 回交出现育性分离，AA:Aa= 1 :1的分离比，以除草剂喷施处理，杀死纯合的可育单株，留下杂合的可育株继续回交，重复若干代直至杂合可育株综合性状与轮回亲本相似，再将杂合不育株自交，将其中的不育单株作为大规模配制杂交组合的母本；
6)将不育系转化为自身保持系不育单株通过喷施化学诱导剂或光照处理，调节诱导型启动子，使不育株育性恢复，自交保留种子，第二年继续种植，在无诱导处理的情况下仍然表现不育；
7)将不育株做母本，以具有恢复基因的材料做恢复系，按规常规制种流程配制杂交组
I=I ο上述方法步骤1)所述的诱导型启动子是指化学试剂诱导型启动子或光照诱导型启动子。化学诱导是指杀虫剂诱导系统EcR，化学试剂是指含有蜕皮激素的杀虫剂。本发明具有如下的优点
1、本发明的甘蓝型油菜细胞核雄性不育系的不育性十分稳定彻底，且不受环境(如低温或高温、光照和逆境)和遗传背景的影响，不育系的不育性和不育株率均为100%，没有死蕾现象，接受花粉能力很强，结实能力强，制种产量高；不存在基因累赘的情况。2、因为基因为隐性核不育基因，恢复系很容易找到，常规甘蓝型油菜中有90%以上的材料含有其恢复基因。恢复基因也不存在基因累赘现象。3、不育系无苗期黄化和蜜腺不发达的问题。4、本发明将不育系与保持系一体化，克服了保持不育系时出现50%可育株的矛盾，省去拔除可育株的步骤，省时省力。不育株率和不育度均为100%，不存在基因累赘现象。5、在需要转育不育株时，对回交后代直接喷施除草剂，杀死纯合的可育单株，保留杂合可育株，省去自交观察育性分离的步骤，节省各项资源，加快育种进程1-2倍。6本发明转育的甘蓝型油菜细胞核雄性不育系不仅可用于甘蓝型油菜和其其它芸薹属物种的杂种优势育种，还可以应用到水稻，玉米，高粱等其它作物中。
具体实施例方式培育甘蓝型油菜新型不育系
1、确定雄性不育基因和诱导性启动子查询已公开的控制花粉发育的基因。原则是 该基因的隐性突变只表现出雄性器官发生退化和花粉彻底败育，而对其它部位没有影响。 MALE STERILE 33 (MS33)是拟南芥一个控制花粉发育的基因，该基因突变会造成雄性不育，花丝变短，花粉发育受阻，导致花粉败育。查询和确认诱导性启动子。可以选择两类， 第一类为低成本、低毒或无毒、诱导后效果持续时间长的药剂，如除草剂、抗虫剂和各种农药，各种低价盐类等药品；第二类启动子为光照诱导型启动子，通过种植在不同纬度或不同海拔的区域使不育转变成可育。如春化有关基因的启动子，在春性油菜里表达，而在半冬性的油菜里不表达，在西北的春油菜区进行种植育性可以恢复，而在长江中游区域和下游区域则表现出不育。本实例中采用杀虫剂诱导系统EcR，此系统是Unger等利用欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)的蜕皮激素配基结合结构域(EcR LBD)、玉米Cl激活域(AD)和 GAL4 DNA结合结构域(DBD)构建化学诱导激活子，喷洒杀虫剂可诱导该启动子发挥作用。2、以表达载体pCAMB1301作为甘蓝型油菜转基因载体。利用高保真PCR的方法，扩增隐性突变基因片段，同理扩增隐性核不育恢复基因片段。将抗除草剂Bar基因与隐性核不育基因片段与35S强启动子连接，同时将隐性核不育恢复基因与诱导型启动子EcR连接， 将具有三个基因和两个启动子的连接片段克隆到PMD19-T载体，提取具有正确基因序列的质粒连接到表达载体PCAMBIA301上，连接好的载体转化大肠杆菌菌株DH10B，在含有卡拉霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，正确的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株LBA4404，遗传转化采用常规的农杆菌转化法。3、提取转基因阳性植株的叶片总DNA，经过PCR鉴定转化植株，PCR采用20ul的反应体系，具体为20ngDNA 模板，IOmM Tris-Hcl, 50mM Kcl, 0. 1% Triton X-100,1. 8 mM MgCl2,0. 1 mMdNTP,0. 2 uM 引物，以及 IU Taq DNA polymerase ；PCR 的扩增条件为94。C预变性 5 min ;94。C lmin，60。C lmin，72。C lmin，；35 循环；72。C lOmin，16。C IOmin ;PCR产物用
1%琼脂糖凝胶电泳检测，确定哪些为阳性转基因植株。4、经检测确定为阳性植株的材料开花期肉眼观察育性，收集其花粉以醋酸洋红染液染色，观察花粉粒饱满程度，经检测发现全表现为不育单株的阳性植株花粉育性彻底。对表现不育材料的单株观察其恢复基因的育性恢复情况不育单株苗期通过喷施蜕皮激素类似物杀虫剂，调节诱导型启动子启动表达，同时进行花期育性观察，将可育单株的花粉以醋酸洋红染液染色，观察花粉粒形状，判断花粉育性，经证实在化学试剂诱导的条件下，恢复基因可以表达，自交得到种子。5、将成功表达各基因的转基因植株做母本，进行不育系的转育。挑选综合性状优良的甘蓝型油菜作为父本杂交，Fl全表现可育，与优良单株回交，AA =Aa =1 1的分离比， 以除草剂喷施处理，杀死纯合的可育单株，留下的杂合可育株与综合性状优良的材料继续回交，重复若干代直至杂合可育株综合性状与轮回亲本相似，再将杂合不育株自交，将其中的不育单株作为大规模配制杂交组合的母本。6、不育系繁殖不育单株苗期通过喷施蜕皮激素类似物杀虫剂，调节诱导型启动子，花期出现的可育株上套袋自交，保留不育系种子，第二年将收获的种子种植，在不喷施喷施蜕皮激素类似物杀虫剂情况下不育单株仍然表现为不育，作为配制杂交组合的母本。
7、大面积规范化种植不育株作为母本，以适应本地条件、综合性状优良、配合力高的材料作为父本，在通风，光照条件优良的地域隔离其余甘蓝型油菜材料种植，收获母本不育株的种子作为生产用杂交种。
权利要求
1.一种利用基因工程培育新型不育系的方法，其特征在于，依次通过如下步骤实现1)采用植物表达载体PCAMB1301作为甘蓝型油菜转基因载体，将35S启动子连接隐性核不育基因以及抗除草剂基因，再以诱导型启动子与等位恢复基因连接，构建三类组合基因的表达载体pCAMB 1301 ；2)连接产物转化大肠杆菌菌株DH10B，在含有卡拉霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，阳性的重组质粒通过冻融法导入农杆菌菌株LBA4404，得到阳性工程菌株；3)采用常规的农杆菌介导法进行甘蓝型油菜遗传转化；4)TO代植株检测为阳性的单株观察育性表现，通过RT-PCR和Southern杂交检测，确定阳性转基因隐性核不育单株；将成功导入不育基因的不育单株根据启动子类型苗期喷施化学试剂或光照处理，调节诱导型启动子，恢复基因表达，使不育变成可育单株，然后收获种子；5)不育系的转育以成功导入目的基因的不育单株为母本、以甘蓝型油菜为父本杂交， 回交出现育性分离，AA:Aa= 1 :1的分离比，以除草剂喷施处理，杀死纯合的可育单株，留下杂合的可育株继续回交，重复若干代直至杂合可育株综合性状与轮回亲本相似，再将杂合不育株自交，将其中的不育单株作为大规模配制杂交组合的母本；6)将不育系转化为自身保持系不育单株通过喷施化学诱导剂或光照处理，调节诱导型启动子，使不育株育性恢复，自交保留种子，第二年继续种植，在无诱导处理的情况下仍然表现不育；7)将不育株做母本，以具有恢复基因的材料做恢复系，按规常规制种流程配制杂交组合
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)所述的诱导型启动子是指化学试剂诱导型启动子或光照诱导型启动子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，化学诱导是指杀虫剂诱导系统EcR， 化学试剂是指含有蜕皮激素的杀虫剂。
全文摘要
一种利用基因工程培育新型细胞核雄性不育系的方法，属于作物分子育种技术领域。该方法利用转基因技术将35S启动子与隐性核不育基因以及抗除草剂基因连接，同时将诱导型启动子与恢复基因连接，将三类基因一并转入作物中。转基因的阳性株系在没有诱导条件下，表现为100%不育，通过调节诱导启动子的表达调节恢复基因活性变成可育。收获种子下代种植时，在没有诱导条件下，为全不育系，这样可以繁殖100%的隐性核不育系。不育系可与大量的其它材料(恢复系)杂交，配制杂交组合。本发明转化的阳性株系能够抗除草剂，在不育系转育过程中可以有效的去除纯合可育株，省时省力。应用本发明方法可以提高杂交种纯度、简化保持系的选育和传统不育系的培育程序，突破核不育系在作物杂种优势利用中的瓶颈。隐性核不育株在诱导下自交可育，后代全不育，繁殖不育系和制种均可。
文档编号A01H3/04GK102172212SQ20111005007
公开日2011年9月7日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者付东辉, 付鹰, 吕俊, 李加纳, 肖美丽, 钱伟 申请人:西南大学