专利名称：具毒杀植物线虫活力的生防真菌Gloeotinia的制备方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法。
背景技术：
植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据 hser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京中国农业出版社，pl-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3%，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有刚间可见症状或专化性特征而未引起注意(Sasser，1986)， 此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。在我国主要有根结线虫、大豆胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等病原线虫造成严重危害，尤其根结线虫是世界农业上为害最大的一类病原线虫，病害发生后，一般减产10% 左右，严重的高达 75% 以上，甚至绝收(Whitehead A. G. , 1998. Plant Nematode Control. ISBN0851991882CAB hternational)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，高毒高残留，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3 55-66)，一些有效的化学杀线剂的应用陆续受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。早在60年代Olthof等在观察食线虫真菌Arthrobotrys oligospora Fres.捕食线虫的过程中提出了真菌产生杀线虫代谢物质的假说。1984年Thorn等发现高等担子菌 Pleurotus spp.产生毒素毒杀线虫，1992年Kwork等证实该毒素为癸烯二酸，至今从高等真菌的次级代谢物中寻找杀线虫活性物质已成为新的研究热点。如大黄酚chrysophanol 不仅是普遍的植物新陈代谢物而且也广泛存在灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、多孢木霉(Trichoderma polysporum)、鹿角毛壳菌(Chaetomium elatum)、豌豆深褐斑菌 (Ascochyta pisi)和莲点霉属菌(Phoma spp.)中，大黄素emodin分布也广可从灰绿曲霉许多担子菌和地衣等真菌中获得，它们对根结线虫有微弱毒性。生物碱phenoxazone首先从血红密孑Llif Pycnoporus sanguineus中获得，后来又从虎皮香杏菌Calocybe gambosa 的发酵菌丝体中分离出对南方根结线虫M. incognita的ED50为50yg/ml。环缩肽白僵菌素beauvericin可从球孢白僵菌Beauveria bassiana、玫烟色拟青霉Paecilomyces fumosoroseus和镰刀属菌Fusarium spp.中分离得到，发现它对M. incognita有微弱活性。 1997年，Mayer和Merner等从奥尔类脐菇Omphalotus olearius的发酵液中分离到一高活性环十二缩肽物质omphalotin对根结线虫的ED50为0. 75 μ g/ml,比商品杀线虫剂阿维菌素更具活性而且无抗菌性、不毒害植物，具有商业利用前景。
真菌产生的次生代谢产物具有丰富的结构多样性，因此真菌作为线虫的生防因子展现出巨大的发展前景。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，寻找具有高效杀线虫活性物质生防真菌，为进一步研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。
发明内容
本发明的目的是筛选获得对植物线虫具高杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从中获取具杀线虫活性的代谢产物，开发新的杀线虫生物农药，其中，所述的植物线虫是南方根结线虫Meloidogyne incognita，大豆胞囊线虫Heterodera glycines 禾口水稻干尖线虫 Aphelenchoides besseyi。本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的真菌菌株Snef5是Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4549。Snef5是在利用选择性培养基分离白僵菌过程中发现的一种与白僵菌相伴生的特殊真菌，该菌株分离于吉林省辽源市采集的被白僵菌侵染的茧蛹上，而且这种真菌对植物线虫具有良好杀线虫活性，因此被深入研究其发酵及其对靶标线虫的毒杀作用。本发明涉及真菌菌株Snef5或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是根结线虫的防治。为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明， 给出了下列实施例。
具体实施例方式本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，是由本发明的真菌Snef5经过常规的液体发酵培养后提取制备的。本发明的真菌菌株Snef5通过试管斜面菌种培养后，再经扩大发酵培养来制备，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。实施例1 菌株Snef5的培养Snef5的单菌落接种到试管斜面的琼脂培养基上，培养基配方为PSA培养基马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂17g、水1000ml，28°C培养7d，获得试管斜面菌种。再将试管斜面菌种接种到150mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，培养基配方为含(NH4)2SO4 3. 67g、KCl 0. 96g、FeSO4 0. 02g、K2HPO4 0. 64g、MgSO4 · 5H20 1. 04g、蔗糖 28. 3g、蒸馏水 1000ml, pH 为 7. 2，25°C 28°C下，摇床转速以 150r · mirT1 200r · mirT1、 发酵16 。培养好的发酵液用滤纸经布氏漏斗抽滤，去除菌丝体，获得滤液中的杀线虫活性物质。将发酵滤液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。实施例2 菌株Snef5的杀线虫活性测定将发酵滤液在原液的基础上依次稀释为2X、5X、10X、20X、50X，分别对大豆胞囊线虫J2、南方根结线虫J2和水稻干尖线虫进行杀线虫活性试验。在经灭菌的特制的贝氏小皿内中加入稀释2X的试验用发酵液各lmL，以加ImL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入大豆胞囊线虫、南方根结线虫或水稻干尖线虫约100条，放入25°C培养箱中，24h和4 分别记录线虫死亡率，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。
权利要求
1.一种具有杀线虫活性的生防真菌Snef5，其特征在于该菌株为Gloeotinia nematicida,已于2011年1月M日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo. 4549。
2.权利要求1所述的菌株Snef5斜面菌种的制备方法，其特征在于培养基配方马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂17g，水1000ml，25°C培养7d，获得试管斜面菌种。
3.权利要求1所述的菌株Snef5具杀线虫活性液体发酵液的制备方法，其特征在于液体发酵培养基配方(NH4) 2804 3. 67g，KCl 0. 96g，FeSO4 0. 02g, K2HPO4 0. 64g，MgSO4 · 5H20 1. 04g，蔗糖 28. 3g，蒸馏水 1000ml，25 °C 28 °C，摇床转速 150r · mirT1 200r · mirT1，发酵16他，培养好的发酵液用滤纸经布氏漏斗抽滤，去除菌丝体，获得滤液中的杀线虫活性物质。
4.一种杀线虫制剂，其特征在于包含有效量的权利要求1所述的真菌或权利要求3 所述的菌株发酵滤液作为活性成分。
5.权利要求1所述的真菌或权利要求3所述的真菌发酵滤液在植物寄生线虫生物防治中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的植物寄生线虫为根结线虫 Meloidogynespp.、大豆胞囊线虫 Heterodera glycines 禾口水禾酉干尖线虫 Aphelenchoides besseyi。
全文摘要
本发明涉及一株具毒杀植物线虫作用的真菌的培养方法及其代谢物制备方法，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的真菌菌株Snef5为Gloeotinia nematicida，已于2011年1月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4549。该真菌菌株Snef5的分类地位是子囊菌门Ascomycota，子囊菌纲Ascomycetes，柔膜菌目Helotiales，丝核菌科Sclerotiniaceae，Gloeotinia属真菌。通过液体发酵培养制备，其代谢产物对植物寄生线虫中的重要病原线虫包括根结线虫、大豆胞囊线虫和水稻干尖线虫具有很高毒力，杀线虫效果明显，具良好的应用开发前景。
文档编号A01N63/04GK102250775SQ20111004924
公开日2011年11月23日 申请日期2011年3月2日 优先权日2011年3月2日
发明者刘彬, 朱晓峰, 段玉玺, 王媛媛, 赵迪, 陈立杰 申请人:沈阳农业大学