专利名称：松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及植物病害的分子检测，涉及松赤枯病的早期快速分子检测方法，尤其涉及的是一种松赤枯病病原菌分子检测的引物及其检测试剂盒。
背景技术：
松赤枯病是松树中、幼林叶部的主要病害，广泛分布于我国，且有逐渐蔓延扩大之势。其除为害马尾松外(Pinus massoniana Lamb),还侵染其它松树，如云南松(Pinus yunnanensis)、黑松(P. thunbergii)、华山松(Pinus armandii Franch)、黄山松(P. huangshanensis)、湿地松(P. elliottii)、火炬松(P. taeda)、海岸松(P. pinaster) >油松(P. tabulaeformis)、加勒比松(P. caribaea)、岛松(P. insular is)、南亚松(P. Iatteri)、落叶松(Larix sp.)、金钱松(Pseudolarix amabilis)。各种寄主中，以马
尾松、云南松、湿地松、火炬松以及黄山松受害最重，本病常与赤落叶病或落针病同时混生。松赤枯病病原菌是属半知菌类、黑盘孢目多毛孢属的枯斑拟盘多毛孢菌(Pestalotiapsisfunerea Desm)。凡松林分布地区，多有此病为害。被害严重的林分似火烧,提早落叶,严重影响生长，目前在四川的达县、宜宾、绵阳、内江、南充等地林区均有松赤枯病的发现。以往检测植物真菌病害病原菌主要有形态学观察法。真菌形态鉴定方法是指通过观察真菌菌落特征，利用光学显微镜、电子显微镜等仪器观察真菌的菌丝形态、产孢结构和孢子的形态结构特征，并比对相关资料来确定真菌的分类地位。采用常规直接或培养后镜检的形态学鉴定方法来发现和确认病原菌，其操作繁琐、费时、并且需要高度的专业知识。尤其对于那些生长条件特殊、形态相似的菌株要通过传统的表型特征鉴定方法来加以鉴别显得非常困难，许多时候只能鉴定到属这一级别。酶联免疫法在国外已经形成商品化生产，但是每种病原菌都需要特异的酶标记抗体，标记过程比较复杂，价格比较昂贵，且存在假阴性和假阳性问题。基因芯片技术虽然能够同时进行多种真菌的鉴定，但只局限于已知的常见病原真菌，对非常见菌、突变菌或者新菌种则无能为力，且成本过高。质谱技术在微生物鉴定中具有快速准确的优点，但由于质谱鉴定必须是纯化培养的单克隆菌落，操作复杂且所需的专业技术要求较高，设备购置和维护费高昂。随着分子生物学手段的发展与应用，利用真核生物在rDNA的ITS区段既具保守性又在科、属、种水平上均有特异性序列的特性，对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异性引物来检测真核生物的方法已越来越被广泛的认可和应用。rDNA内转录间隔区(ITS)作为一种遗传标记(遗传标记是指可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性，具有可遗传性和可识别性。生物中任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记)，已经被广泛应用于微生物菌种分类与鉴定。现有方法利用ITS序列对病原真菌进行鉴定前，须先经过纯菌株的分离纯化，真菌DNA的提取，PCR扩增以及亚克隆等一系列繁琐的过程。这种方法存在如下缺点(I)至少需要3-7天时间，费时费力；(2)对目前无法培养或难培养的真菌很难进一步鉴定和分析；(3)分离和培养单胞存在较高的技术难度；(4)繁琐的真菌DNA提取步骤；(5) PCR扩增片段。这些缺点极大地限制了病原菌的快速鉴定，贻误了病情。严重影响了林木的正常生长发育，对林业生产造成了巨大的经济损失。
发明内容
本发明旨在提供一种松赤枯病病原分子检测引物及其检测试剂盒，以实现对松赤枯病早期的快速检测。针对目前松赤枯病病原菌在生物学检测上所需周期长的问题，通过提取云南松针叶总DNA，针对松赤枯病的ITS碱基特异序列设计筛选出了一对具有高特异性的引物，用于植物组织的灵敏、快速的病原菌分子试剂盒。该试剂盒可用于松针遭受枯斑拟盘多毛孢菌侵染但在松针上未出现该病的症状(病症、病状)时快速、灵敏地检测出是否有该菌存在，从而对松赤枯病引起病害显症之前的早期检测具有十分重要的意义。该松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒，包括以下组分超纯水d. d. H2O16μ L ;上游引物 F(5 ' -3' )2μ L :GTCAACCAGCGGAGGGAT ;下游引物 R(5 ' -3' )2μ L CGCCGTTGTATTTCAGGAG ；25μ L Premix。
PCR扩增反应采用50 μ I体系，其中5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各 2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L0反应在iCycler-PCR仪上进行，程序为95°C变性4min ;95°C变性30s，56°C复性30s，72°C延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，10°C保存。上述松赤枯病病原特异分子检测试剂盒体的使用方法Al样品处理对所采貌似健康的针叶样品，使用75%的酒精进行表面消毒处理后，保存于-70°C备用。A2提取松针总DNA:(I)取l-2g松针转移到灭菌的研钵里，加入2-3次液氮进行充分研磨，以下步骤使用的植物基因组DNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供。(2)将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μ 165°C预热缓冲液GPl的离心管中(实验前在预热的GPl中加入巯基乙醇，使其终浓度为O. I % )，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65°C水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。(3)加入700μ1氯仿，充分混匀，
12,OOOrpm(-13, 400Xg)离心5min。(4)小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700 μ I缓冲液GP2，充分混匀。(5)将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12，000rpm(-13，400Xg)离心30sec，弃掉废液。(6)向吸附柱CB3中加入500 μ I缓冲液GD, 12，OOOrpm(-13, 400 Xg)离心30sec,倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(7)向吸附柱CB3中加入600μ I漂洗液PW，12，OOOrpm(-13，400Xg)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。(8)重复操作步骤7。(9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(-13, 400 Xg)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。(10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12，OOOrpm (-13, 400 Xg)离心2min，将溶液收集到离心管中。A3PCR 反应将提取的松针基因组DNA作为模板，使用筛选出来的特异性引物进行PCR扩增。50 μ L反应体系包括:5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 μ L (10 μ mol/L)，ddH20 16 μ L。反应在 iCycler-PCR 仪上进行，程序为95°C变性 4min ;95°C变性 30s, 56°C复性30s，72°C延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，10°C保存。本发明用于松赤枯病病菌分子通过Genbank已有该菌的ITS区序列(AF405299. I)进行设计，最后筛选出了一对具有高特异性的一对PCR引物(AF-F/R)，该引物的序列为上游引物F (5' -3' ) GTCAACCAGCGGAGGGAT 18bp下游引物R(5' -3/ ) CGCCGTTGTATTTCAGGAG 19bp
A4PCR扩增产物分析将5μ LPCR产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增出的条带判断，如果能特异性地扩增出420bp左右产物，即可判断云南松松针中存在松赤枯病病菌；反之则不存在该病原菌。本发明根据rDNA ITS区具有种内保守、种间变异的特点，以ITS序列为基础，设计特异性引物对病原菌进行分子检测。筛选出一对特异性引物，优化PCR反应体系，扩增ITS序列，凝聚糖电泳检测显示420bp左右的条带，PCR产物经过测序后的BLAST比对，证实了从松针中提取的病原菌为枯斑拟盘多毛孢。此方法大大提高了病原菌的鉴定效率，对于松赤枯病引起病害显症之前的早期监测具有十分重要的意义。具有以下的技术优势和积极效果
(I)操作简便快速本实验方法对样品进行简单处理、PCR扩增和常规的琼脂糖凝胶电泳后即可以判断结果，一般整个检测过程可在7个小时内完成。相对于之前通过PCR方法鉴定植物病原菌的方法(至少需要3-7天)而言，省去了菌株的分离纯化、菌株的培养、菌丝DNA的提取以及亚克隆等繁琐过程，减少了技术难度，省力省时，还能鉴定出不可培养或难培养的病原菌，大大提高了鉴定的效率和范围。(2)特异性强本发明检测方法是利用松赤枯病的rDNA基因ITS区具有种内保守、种间变异的特点，筛选出特异性强的引物以及优化反应体系。对枯斑拟盘多毛孢菌引起的松赤枯病具有很强的特异性。为有针对性地开展松赤枯病的防治，及时解决松赤枯病问题提供了强有力的技术支持。
图I为实施例I中PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；M DL2000Marker ;1_3 :松针尖部；4-6 :松针中部；7-9 :松针基部图2为实施例2中扩增几种树栖真菌菌丝DNA的电泳图谱；M DL2000Marker ；1 枯斑拟盘多毛孢菌；2 CK ；3 :星形拟盘多毛孢菌；4 :散沫拟盘多毛孢菌；5 :针叶树散斑壳菌；6 :松针散斑壳菌；7 :尖孢镰刀菌图3本发明快速鉴定松赤枯病快速检测的方法流程图。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I :植物组织中松赤枯病的检测(I)貌似健康的样品经表面消毒处理后，按叶尖、叶中、叶基剪成三份，分别转移到灭菌的研钵里，用液氮研磨法结合植物基因组DNA提取试剂盒进行提取，该样品的总DNA作为下一步PCR的模版；(2)通过Genbank已有该菌的ITS区序列(AF405299. I)进行设计，最后筛选出了一对具有高特异性的一对PCR引物(AF-F/R)，分别为上游引物F (5' -3' ) GTCAACCAGCGGAGGGAT 18bp下游引物R(5' -3/ ) CGCCGTTGTATTTCAGGAG 19bp(3) PCR反应体系50 μ L包括5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 μ L(10 μ mol/L), ddH20 16 μ L0 反应在 iCycler-PCR 仪上进行，程序为95°C 变性 4min ;95°C变性30s，56。。复性30s，72。。延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，10°C 保存。(4)PCR反应后将产物进行琼脂糖凝胶电泳，见到一条清晰的分子量为420bP的特异条带，因而判断发病组织感染松赤枯病病菌(如图I所示)，将产物送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序，测序样品共15个，共得到8条理想的序列，将整理好的序列复制到Genbank库中并使用BLAST软件进行比对，比对结果，可以确定枯斑拟盘多毛孢菌侵染了样本中的松针叶。实施例2 :引物对松赤枯病的特异性扩增PCR反应体系50yL包括5yL松针基因组DNA原液，25yL Premix，引物各2 μ L(10 μ mol/L), ddH20 16 μ L0 反应在 iCycler-PCR 仪上进行，程序为95°C 变性 4min ;95°C变性30s，56。。复性30s，72。。延伸lmin，进行35个循环；72°C延伸7min，10°C保存。检测结果检测的特异性使用引物AF-F/R对松赤枯病和实验室存有的已报道过的树栖真菌菌丝DNA同时进行PCR反应(反应结果见图2)，扩增出的420bp左右的条带，而对星形拟盘多毛孢菌(Pestalotiapsis Iespedezae)、散沫拟盘多毛孢菌(Pestalotiapsis Iawsoniae)、针叶树散斑壳菌(Lophodermi μ m conigen μ m)、松针散斑壳菌(Lophodermiym pinastri)、尖孢镰刀菌(Fusariymoxysporym)扩增的结果条带较暗或无条带，可以看出AF引物对枯斑拟盘多毛孢菌具有较强的特异性。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.ー种松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分超纯水 d. d. H20 16 μ L ;上游引物 F (5 ' -3 ' ) 2 μ L: GTCAACCAGCGGAGGGAT ;下游引物R(5' -3/ ) 2 yL: CGCCGTTGTATTTCAGGAG ；25 μ L Premix。
2.根据权利要求1所述的分子检测试剂盒体的使用方法，其特征在于，包括以下步骤 A1样品处理；A2提取松针总DNA; A3 PCR反应；将提取的松针基因组DNA作为模板，使用筛选出来的特异性引物进行PCR扩增。50 UL反应体系包括5 μ L松针基因组DNA原液，25 μ L Premix，引物各2 yL(10 ymol/L), ddH20 16 μし反应在iCycler-PCR仪上进行，程序为95で变性4min;95°C变性30 s，56で复性30 s，72 °C延伸1 min，进行35个循环；72 °C延伸7 min, 10 V保存； A4 PCR扩增产物分析将5 μ L PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化こ锭染色后于紫外灯下根据扩增出的条带判断，如果能特异性地扩增出420bp左右产物，即可判断云南松松针中存在松赤枯病病菌；反之则不存在该病原菌。
全文摘要
本发明公开了一种松赤枯病病原菌分子检测的检测试剂盒及其使用方法，包括以下组分超纯水d.d. H2O 16 μL；上游引物F(5′-3′) 2 μL: GTCAACCAGCGGAGGGAT；下游引物R(5′-3′) 2 μL: CGCCGTTGTATTTCAGGAG；25 μL Premix。本发明对松赤枯病检测快速，而且灵敏度高，应用于早期病害检测，为有针对性地开展松赤枯病的防治，及时解决松赤枯病问题提供了有力的技术支持。
文档编号C12Q1/68GK102952883SQ20121043114
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月1日 优先权日2012年11月1日
发明者刘应高, 潘欣, 张岩, 袁川, 王欢, 僬天敏, 朱天辉 申请人:四川农业大学