专利名称：促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能性生物活性肽技术领域，具体涉及促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法与应用。
背景技术：
近年来随着人们对肽的深入了解，发现有一部分肽对各类生物的功能性具有重要的调节作用，这部分肽被称为活性肽或功能性肽。目前，越来越多的研究开始关注活性肽对 微生物的生理调控作用。据报道有一类天然肽具有抗菌作用，对革兰氏阳性菌有显著的抑菌效果。发现柞蚕抗菌肽能有效杀死革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌，但对一些革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌却无抑制作用。另外，活性肽对微生物生长和代谢的促进作用也多有报道。杨兰利用豆柏大曲培养过程中米曲霉产生的酶系对豆柏进行可控酶解获得分子量小于3ku的促发酵肽，可调控米曲霉的代谢，对酱油成曲蛋白酶的生成具有明显的诱导和提高作用。张清丽发现酪蛋白木瓜蛋白酶水解肽(分子量小于3ku)能有效的促进酸奶发酵并提高了酸奶的品质，经逐级分离纯化获得了三个(6肽或7肽)具有显著促乳酸菌生长活性的酪蛋白肽。大豆蛋白经微生物发酵或蛋白酶水解将大分子降解成小分子，形成低分子肽。大豆肽能促进微生物细胞的生长和代谢。大豆多肽可以促进乳酸菌、酵母菌、双歧杆菌和霉菌的增殖，并能促进面包酵母的产气作用。寡肽能促进瘤胃常驻菌群的繁殖。张容真等报道大豆水解蛋白对乳酸菌的增殖具有促进作用，认为添加1%的大豆水解蛋白能够使保加利亚乳杆菌的增殖速度提高将近一倍。赵冬梅等研究蛋白酶解大豆蛋白得到1.4 ku分子量段以下的大豆肽对细菌和酵母菌的培养实验，发现对酵母细胞的生长具有显著的促进作用。因此运用大豆肽对酿酒酵母生理活性进行调控具有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的是提供一种促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法及其应用。促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法，包括如下步骤
(1)大豆分离蛋白按1:15(w/v, g/mL)溶于水，80-90°C热处理10-30 min ；
(2)添加适量木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶于50-55°C恒温酶解6 IOh后，煮沸10-30min灭酶，酶解物6000g-10000g离心5-10 min ；
(3)过不同分子量截留的滤膜，收集不同分子量段的大豆肽，冷冻干燥；不同分子量段的大S·肽包括分子量小于Iku的大S·肽(SP1),分子量为l 3ku的大丑肽(SP2),分子量为3飞ku的大豆肽(SP3)，分子量为5 IOku的大豆肽(SP4)，以上各段大豆肽总含量占大豆分离蛋白质量70%以上。进一步的，步骤(3)最终得到分子量小于Iku的大豆肽和分子量:Γ5 ku的大豆肽，即所述生物活性肽。进一步的，步骤(2)所述木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量分别为底物蛋白的O. 2-0. 4% 和 O. 4-0. 6% (w/w)；
上述制备方法制得的生物活性肽的应用，即将生物活性肽添加至发酵液中。进一步的,所述应用中，分子量小于Iku的大S·肽添加量为发酵液质量O. 1^0. 3%时能显著促进酵母生长；分子量3 5 ku的大豆肽添加量为发酵液质量O. Γ0. 3%时能显著提高酵母的耐乙醇性能。所述发酵液中的酵母为酿酒酵母iSaccharomyces Pastorianus^0与现有技术相比，本发明采用了以上技术方案，具有如下优点和效果
(I)本发明在大豆蛋白在木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的协同作用下，所得大豆蛋白水解物具有促酵母生长和提高酵母耐乙醇功能。
(2)分子量在小于I kDa大豆肽添加量为O. Γθ. 3%时能显著促进酵母生长；分子在3 5 kDa大豆肽添加量为O. Γ0. 3%时能显著提高酵母的耐乙醇性能。
图I是发酵24h时酿酒酵母FBY0095在30°C和厌氧条件下YNB培养基中(添加不同浓度乙醇)的生长状况对比图。图2是发酵24h时酿酒酵母FBY0095在30° C和厌氧条件下YNB培养基中(添加不同浓度乙醇)的存活率对比图。
具体实施例方式以下结合实例和附图对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。实施例I 制备方法
(1)大豆分离蛋白按1:15(w/v, g/mL)溶于水，90°C热处理IOmin ；
(2)分别添加大豆分离蛋白重量O.2%和O. 4%的木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，于55°C恒温酶解6h后,煮沸10 min灭酶,酶解物IOOOOg离心5min ；
(3)过不同分子量截留的滤膜，收集到分子量小于Iku的大豆肽(SP1)，分子量为f3ku(SP2)的大 妝，分子量为3 5ku (SP3)的大 妝，分子量为5 IOku (SP4)的大 妝，以上各段大S·肽总含量占大S·分尚蛋白质量72%,冷冻干燥；
米用YNB培养基(酵母为酿酒酵母pastorianus):葡萄糖O. 5% (w/v,g/mL),酵母氮源培养基(YNB) O. 17% (w/v, g/mL)。发酵条件接种量为4g (酵母泥)/L,12°C厌氧发酵24 h。发酵前将各分子量大豆肽以0.1% (w/v, g/mL)加到培养基中。采用血红计数板法计算发酵过程中的生物量，以考察在不同浓度乙醇的胁迫下不同分子量大豆肽对酵母细胞生长的影响，见图1，其中，*:相对未加乙醇时空白的显著性(/ 〈0.05);+:相对添加4% (w/v, g/mL)乙醇时空白的显著性(/X0. 05) ; Δ :相对添力口 8% (w/v, g/mL)乙醇时空白的显著性0°〈0. 05) ; □:相对添加12% (w/v，g/mL)乙醇时空白的显著性G°〈0. 05)。由图I可知，小分子量的大豆肽对酵母细胞有促进作用，特别是分子量小于Iku的大豆肽有显著的(/X0. 05)作用。在未添加乙醇的条件下，添加SPl的细胞量比空白提高了22. 49%，比添加SPH (大豆蛋白酶解液)的细胞量提高了 9. 57%。随着培养基中添加的乙醇浓度升高，SPl的促生长作用降低，在添加12% (w/v, g/mL)乙醇条件下，添加SPl的细胞量比空白提高了 12. 07%。
实施例2 制备方法
(1)大豆分离蛋白按1:15(w/v, g/mL)溶于水，80°C热处理30 min ；
(2)添加适量木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶于50°C恒温酶解IOh后，煮沸30min灭酶，酶解物IOOOOg离心10 min ；
(3)过不同分子量截留的滤膜，收集到分子量小于Iku的大豆肽(SP1)，分子量为f3ku(SP2)的大 妝，分子量为3 5ku (SP3)的大 妝，分子量为5 IOku (SP4)的大 妝，以上各段大S·肽总含量占大S·分尚蛋白质量73%,冷冻干燥； 米用YNB培养基(酵母为酿酒酵母pastorianus):葡萄糖O. 5% (w/v,g/mL),酵母氮源培养基(YNB) O. 17% (w/v, g/mL)。发酵条件接种量为4g (酵母泥)/L,12°C厌氧发酵24 h。发酵前将各分子量大豆肽以O. 3% (w/v, g/mL)加到培养基中。采用次甲基兰染色法监测发酵过程中酵母的生物活性，以考察在不同浓度乙醇的胁迫下不同分子量大豆肽对酵母细胞存活率的影响，见图2，其中* :相对添加8% (w/v，g/mL)乙醇时空白的显著性0°〈0. 05) ; + :相对添加12% (w/v, g/mL)乙醇时空白的显著性0°〈0. 05)。由图2可知，在8% (w/v, g/mL)乙醇浓度条件下，在培养基中添加SP2、SP3和SP4使酵母的存活率分别比空白提高了 12. 56%、14. 60%和13. 03%，而SPH和SPl是酵母的存活率分别比空白(Control)降低了 5. 96%和6. 59%。当培养基中添加乙醇浓度为12% (w/V，g/mL)时，SPl使酵母细胞存活率显著降低0°〈0. 05)，SP3使酵母细胞存活率显著升高(7X0.05)。这一结果说明，在高浓度乙醇胁迫下，小分子量肽(Mw〈lku)不能使酵母细胞活性提高，而大分子量肽，特别是分子量为3飞ku的大豆肽可以显著地使酵母细胞活性提高。以上仅为部分实例，本发明所提供的技术方案均可实现。
权利要求
1.促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)大豆分离蛋白按1:15(w/v, g/mL)溶于水，80-90°C热处理10-30 min ； (2)添加适量木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶于50-55°C恒温酶解6 10h后，煮沸10-30min灭酶，酶解物6000g-10000g离心5-10 min ； (3)过不同分子量截留的滤膜，收集不同分子量段的大豆肽，冷冻干燥；不同分子量段的大S·肽包括分子量小于Iku的大S·肽(SP1),分子量为l 3ku的大丑肽(SP2),分子量为3飞ku的大豆肽(SP3)，分子量为5 IOku的大豆肽(SP4)，以上各段大豆肽总含量占大豆分离蛋白质量70%以上。
2.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(3)最终得到分子量小于Iku的大豆肽和分子量3 5 ku的大豆肽，即所述生物活性肽。
3.根据权利要求I所述的制备方法，其特征在于步骤(2)所述木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶的添加量分别为底物蛋白的O. 2-0. 4%和O. 4-0. 6% (w/w)0
4.权利要求f3任一项所述制备方法制得的生物活性肽的应用，其特征是将生物活性肽添加至发酵液中。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征是分子量小于Iku的大豆肽添加量为发酵液质量O. I O. 3% ;分子量3 5 ku的大丑肽添加量为发酵液质量O. I O. 3%。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵液中的酵母为酿酒酵母(Saccharomyces pas tori anus)。
全文摘要
本发明公开了促酵母生长和提高酵母耐乙醇性能的生物活性肽的制备方法与应用。制备方法以大豆分离蛋白为原料，用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对其进行水解，离心收集大豆肽，过不同分子量截留的滤膜，获得不同分子量的大豆肽。本发明获得分子量在小于1ku大豆肽添加量为0.1~0.3%时能显著促进酵母生长，分子量在3~5ku大豆肽添加量为0.1~0.3%时能显著提高酵母的耐乙醇性能。
文档编号C12N1/38GK102965421SQ20121043070
公开日2013年3月13日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者赵海锋, 赵谋明, 任娇艳, 赵强忠, 崔春 申请人:华南理工大学