专利名称：构建的一个连作棉田土壤宏基因组文库的制作方法
技术领域：
本发明涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学等领域，特别是把从新疆不同连作年限棉田土壤中分离纯化出土壤微生物30kb-150kb大片段的DNA连接到BAC载体中构建成宏基因组文库，该文库中包含有不同连作年限棉田土壤中原核和真核微生物各种染色体内部基因及其调控信息。本发明针对新疆连作棉田中孕育的大量生物基因资源，利用现代分子生物技术手段从不同连作年限棉田土壤中分离微生物大片段DNA并连接到宏基因组载体当中，在未培养的情况下直接获得了各种连作年限棉田土壤生态环境中各种微生物基因资源。该文库可用于筛选各种不同连作年限棉田微生物资源基因和研究生物基因调控原理等。
背景技术：
从1929年发现青霉素以来，人们已经从微生物中开发了一百多种临床使用的抗生素，抗癌和抗病毒药物。然而，近些年来人类、家畜以及栽培作物病原菌抗(耐)药性迅速发展，新的传染病隐患日益加深，但是从可培养微生物中发现新型生物活性物质的研究却举步为艰，为此科学家们不断的调整研究的材料以及方法，试图高效而持续的从各种环境中开发出丰富的微生物资源。土壤微生物是最有价值的天然产物来源，它们能提供许多工业上十分重要的抗生素以及生物催化剂。各种微生物都有惊人的产生多样化次级代谢产物的能力。Hammond估计地球上的微生物物种多达16X109，广泛分布于各种生态系统中，其中，土壤无论从微生物数量和种类上都是首屈一指的生境。有人用科学的方法估计I克土壤中约有大于10000种不同的微生物，因此，土壤是微生物的大本营。但是，运用现有的技术，只有0.2% 2%的土壤微生物是可培养的，因此土壤中孕育着大量未被开发的生物基因资源。利用土壤环境下的未培养微生物资源是工 业生物技术开发的一个全新领域，也是人类寻找新型功能活性物质和天然药物的天然宝库，具有广阔的开发应用前景。过去十多年在环境微生物培养和高新生物技术上的发展，特别是在基因组相关技术上的飞速发展，为我们从分子水平上了解环境微生物及其生态功能多样性提供了诸多的便利。首先:随着基因组技术的发展，人们开始用分子生物学的方法来研究微生物间的进化关系和遗传信息的功能关系。环境基因组又称多源基因组或宏基因组，是指从环境中提取总的DNA，对其进行遗传学和功能学的研究。优点是不但可以原始地反映环境样品中所有生物的遗传多样性，避开难培养这一技术瓶颈，而且可以把细胞外的DNA—并研究。通过环境基因组的方法可以获得越来越多的DNA序列，且大都是新颖的未被纯培养微生物的序列。运用环境基因组序列不但可以使我们逐渐了解微生物群落功能的复杂性，以及微生物间的相互作用关系，而且可以使我们深入了解未被纯培养微生物的生理和生态特征。研究药物发现相关的新颖基因，自然也要把目标锁定在环境基因组中编码新颖次级代谢产物的基因上。与其他基因工程技术不同，土壤环境基因组技术所需要的DNA片段不是来自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是来自完全未知的土壤样品中，对其可能具有的潜在功能也并不知晓。在土壤总DNA中，编码次级代谢产物的基因经常是成簇存在的，与同一个次级代谢产物相关的基因的生物合成区域和调节区域经常是紧密相连的。这些相连的基因使得克隆到载体中整个次级代谢产物途径基因是一个连续的片段。在药物发现中，生物合成基因和抗性基因也是连在一个片段上的，对于有毒的代谢产物，宿主可以通过共表达的抗性基因带来的抗性机制来避免毒性。这一特点不但简化了对外源片段进行剪切和修饰程序，而且使重组子的筛选更加方便，无疑为功能基因的克隆和表达提供了便利。其次:宏基因组(metagenomics)工程,直接将特定环境中的总体遗传物质，克隆到可培养的宿主细胞中，建立宏基因组文库，从所获得的重组克隆子中筛选活性物质和相关基因(簇)，避开了环境微生物分离培养的难题，在挖掘和利用未培养微生物资源，筛选新颖生物活性物质方面具有极大的潜力。随着对各种生物在DNA分子水平上研究的深入，尤其是人类和水稻基因组计划的实施，构建基因组文库己成为遗传研究实验室的常规策略。它对于分离特定的基因片段，研究基因的表达调控、基因组的组织结构，以及人类和动植物的基因组工程等都有极其重要的作用。构建基因组文库的载体很多，大致可分为噬菌体系列(如早期的噬菌体、COS-mid、PI噬菌体和fosmid等)和 人工染色体系列(如YAC、BAC和PAC等)。前者的克隆能力相对较小(噬菌体24kb左右，cosmid 35 45kb)，许多真核生物的基因，上游启动子序列较长，又含有大而多的内元，如此庞大而复杂的结构，难以作为单一片段克隆于这些载体中。因此，人们开始构建一系列的人工染色体，如酵母人工染色体(yeastartificialchromosome, YAC)、细菌人工染色体(bacterialartif icialchromosome, BAC), Pl 人工染色体(Pl-de-rived artificial chromosome, PAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianartificial chromosome,MAC)等,它们的普遍特点是插入片段较大,一般在IOOkb以上。这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库构建无疑是极为有利的，且其在与外源片段连接后无需进行包装。新疆干旱地区是我国粮棉瓜果生产的重要基地。到2010年它已连续18年成为我国最大产棉区，仅2006年种植棉花面积已达1864万亩,耕种面积占到各类农作物总面积近40%，在宜棉区的棉花播种面积甚至高达90%以上。像新疆这样的农业大省，多年来由于连作(有的长达20年以上)、作物品种单一等多种原因造成作物病虫害日渐加重并有爆发的趋势，而为了控制病虫害的蔓延农药被大量使用，随之而来的是土壤被严重污染，据报道新疆仅仅棉花每年平均施药在十次以上。有毒物质的常年累积反过来又造成农田生物多样性趋向单一，同时快速提高了病原菌的耐药性和抗药性，也就是说如此的恶性循环导致了一个非常突出的现象——农作物的主栽区往往也是病虫害的重灾区，也是农药、化肥、地膜等污染的重灾区。但是，另一方面随着棉花种植面积的不断扩大，连茬现象越来越严重，我们也清楚的观察到两个可惜的现象。一个是，滴灌技术的运用使大量荒地被开垦，而在新开垦的棉花地几乎没有任何病害发生(即便是和发病严重的棉花地相邻)，也就根本无需依靠农药来杀灭病害，而造成这种现象的根本原因是新开垦的土壤微生物原生态结构还未发生大的改变、微生物多样性还未被完全破坏，从而表现出来的土壤生态结构与功能的一致性。另一个是，连年耕作给土壤微生物生态带来负面影响的同时，也起到了富集具有降解农业污染物和转化难利用物质功能的微生物的作用，那么这些微生物必然也具有一些可以开发和利用的资源基因。因此该地区土壤中可能蕴含着新的、还不为人知的基因资源。通过构建，对不同类型、不同耕作方式下的微生物群落结构进行研究，能揭示出微生物群落结构与理化性质的内在联系，从而改善当前的生态环境，并获得新的、有用的基因资源。本发明就是针对不同连作年限棉田土壤中蕴含的大量微生物基因组信息，利用土壤大片段DNA提取技术和BAC载体，通过构建宏基因组文库的方式直接获得了包括非培养微生物基因组信息在内的所有的土壤生物信息。该文库的构建能满足于各种酶基因的分离、抗生素的筛选及分子生物学研究所需要的各种生物调控信息等研究需要。
发明内容
目前构建基因组文库的载体很多，大致可分为噬菌体系列(如早期的噬菌体、COS-mid、PI噬菌体和fosmid等)和人工染色体系列(如YAC、BAC和PAC等)。前者的克隆能力相对较小(噬菌体24kb左右，cosmid 35 45kb)，许多真核生物的基因，上游启动子序列较长，又含有大而多的内元，如此庞大而复杂的结构，难以作为单一片段克隆于这些载体中。因此，人们开始构建一系列的人工染色体，如酵母人工染色体(yeast artificialchromosome, YAC)、细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, BAC), Pl 人工染色体(P1-derived artificial chromosome, PAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianartificial chromosome,MAC)等,它们的普遍特点是插入片段较大,一般在IOOkb以上。这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库构建无疑是极为有利的，且其在与外源片段连接后无需进行包装。对于土壤大片段DNA的提取和回收，我们使用的是优化后的方法，提取的大片段DNA同时满足以下几个要求:①片段要在300kb以上，因为相同的克隆数中片段大所构建的文库包含的信息内容才大，才能够多的涵盖土壤中遗传信息的内容；②纯度高，尤其是不含或者少含抑制后继实验中酶活力的物质(土壤中的这类物质很多)回收的DNA中尽可能的包含土壤中所 有微生物的遗传信息。针对这个现状，本研究根据实际操作经验使用的是载体是BAC，回收的土壤大片段是不同连作年限的棉田30-150kb左右大小的片段，宿主菌是大肠杆菌。本发明成功的构建了不同连作年限的棉田土壤宏基因组BAC文库，同时指出每个构建关键步骤操作中的注意事项和该文库的使用范围等供大家根据自己的实际需要参考。本发明提供了一个完整的包含10万克隆以上的不同连作年限的棉田土壤宏基因组BAC文库。本发明提供了土壤宏基因组文库构建的每个关键步骤的注意事项和原理，可以根据需要片段大小选择不同类型的载体和构建步骤。本发明提供了可根据实际需要更改操作步骤的原理和方法。具体地，提供了该文库从大片段土壤DNA到文库克隆的整个过程。本发明首先将来自于不同连作年限的不同大小片段的土壤DNA样品脱磷处理后，然后片段大小不同的各样品再调整成不同浓度的DNA溶液，分别与BAC载体连接后转化大肠杆菌感受态细胞，最后用相应的筛选标记筛选出携带有大片段DNA的克隆子。由于在构建立文库的过程中我们做了多个连接反应，并且分别使用了从30-150kb不同长度的大片段DNA，因此整个文库的构成由30-150kb的所有大小的DNA组成。在后继的研究中可以根据实际需要从不同大小的克隆子中筛选所需的文库信息。本发明提供了每个关键环节的详细步骤和原理，并提出了可以调整方案的建议和方法。首先指出了不同大小片段的DNA分子分别和载体连接是成功构建的第一个关键环节，并提供了较为详细的方法和步骤。其次指出了连接过程中的注意事项，指明了载体分子和外源片段分子浓度之间的关系影响到连接和构建的效率。转化和筛选的过程也是关键环节，指出了转化和筛选过程的注意事项和切实可行的方法。本发明提供的文库可以用于工业用酶基因的筛选、新抗生素的发现、农业用有毒有害物质的降解基因、微生物基因的调控信息等的研究工作，也可以满足一些相关的后继工作需要。具体地，本发明提供了文库的构建立方法和获得的很有开发应用研究价值的文库，具体的方法如下:1.本发明阐述了该 文库的构建方法步骤:根据实际的操作并结合已经公开的方法实践出了切实可行的一个构建方法，并获得了一个容量超过10万克隆以上的一个土壤宏基因组文库。2.不同大小片段的DNA分子和载体的连接:调整获得的不同大小片段土壤微生物DNA分子浓度分别与BAC载体连接，其目的是获得较高的连接效率。3.连接产物的转化:将连接有不同大小片段DNA的BAC载体转化到大肠杆菌中，并利用筛选标记获得合格的克隆子。依据本发明提供的原理和通过实施本发明的具体方法并结合需要调整操作步骤，可以达到以下预期效果:1.提供了一个不同连作年限的土壤宏基因组文库，获得的该文库可以用于各种功能基因的筛选、微生物次级代谢产物的分离以及各种后继分子生物学等的科学研究工作。2.本发明提供了获得的土壤宏基因组文库的构建方法，与常规方法相比具有详细、可操作性强、操作步骤依据需要可调等特点。
图1:克隆子酶切鉴定图，其中1-8和10-16为随机挑选的平均插入片段约为85kb的克隆子，9为分子量MARK (从小到大依次为:48.5,97,145.5kb)。图2:克隆子酶切鉴定图，其中1-17和19-27为随机挑选的平均插入片段约为IlOkb的克隆子，I和18为分子量MARK (从小到大依次为:48.5,97,145.5kb)。
具体实施例方式下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。实施例一:限制性内切酶测试消化插入片段的大小尽可能控制在30kb-150kb范围内。1.将10个1.5mL的离心管置于一个离心管架上，标记1-10，每管加入250 μ I的HindIII 酶的 Buffer ；
2.在一个1.5ml的离心管中加入10 μ I HindIII (20单位/ μ I)、80 μ I的高纯度水和10 μ I IOXHindIII缓冲液，混匀得到2.0单位/μ I的HindIII溶液(稀释液I)。取10 μ I加入80 μ I的高纯度水和10 μ I IOXHindIII缓冲液中以得到0.2单位/ μ I的HindIII溶液(稀释液2)。依次类推，按照下表，以未稀释的Hindlll、稀释液I和2、特定量的HindIII加入这10个管子中。
权利要求
1.一个构建的包含有未耕作土壤在内的不同连作年限棉田土壤宏基因组文库。首先分离获得各种不同连作年限的棉田土壤微生物细胞，然后利用低熔点琼脂糖包埋法经脉冲电泳分离各种大小的DNA片段，最后将回收到的30-150kb大小的DNA片段与BAC载体连接并克隆到大肠杆菌宿主菌中，超过10万个这样的克隆构建成一个土壤宏基因组文库。
2.一种根据权利要求1的包含该宏基因组文库的所有原核生物基因组相关信息。其特征在于该文库中含有大量非培养土壤原核微生物基因组信息，其中各克隆中可能含有交叉重叠的原核基因生物信息。
3.一种根据权利要求1的包含该宏基因组文库的所有真核生物基因组相关信息。其特征在于该文库中含有大量非培养土壤真核微生物基因组信息，其中各克隆中可能含有交叉重叠的真核基因生物信息。
4.一种根据 权利要求1的包含与该宏基因组文库中的基因以及基因族调控信息等。
全文摘要
本发明涉及土壤微生物、生物化学及分子生物学等领域，特别是从新疆不同连作年限棉田土壤中分离纯化出土壤微生物30kb-150kb大片段DNA，并连接到适合的载体中构建成宏基因组文库，该文库中包含有不同连作年限棉田土壤中原核和真核微生物各种染色体内部基因信息。本发明针对新疆连作棉田中孕育的大量生物基因资源，利用现代分子生物技术手段从不同连作年限棉田土壤中分离微生物大片段DNA并连接到宏基因组载体当中，在未培养的情况下直接获得了各种连作年限棉田土壤生态环境中各种微生物基因资源。该文库可用于筛选各种不同连作年限棉田微生物资源基因和研究生物基因调控原理等。
文档编号C12R1/19GK103205816SQ20121000811
公开日2013年7月17日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者张伟 申请人:新疆师范大学