藜麦est-ssr分子标记及其开发方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子标记技术领域，具体涉及藜麦EST-SSR分子标记及其开发方法与 应用。
【背景技术】
[0002] SSR(simplesequencerepeat)又称为微卫星DNA，由2个~6个喊基的单元序 列串联重复而成，具有多态性高、共显性、数量丰富等特点，广泛用于遗传图谱构建、遗传多 样性分析等。早期发展SSR标记的方法通常采用构建文库的方式进行，包括基因组文库和 cDNA文库。通常基于EST(expressedsequencetag)发展的SSR称为EST-SSR，与通过基 因组序列发展的基因组SSR相比，EST-SSR因其两端侧翼序列的保守性较强，在不同物种间 具有良好的通用性。近年来，利用公共数据库中丰富的基因组序列以及表达序列信息发展 分子标记成为分子标记开发的重要途径。
[0003] 藜麦（ChenopodiumquinoaWilld.)，原产于南美安第斯地区，是一种一年生藜科 双子叶草本产种植物，具有出色的耐干旱、耐盐碱的特性，是唯一一种被联合国粮农组织认 可的单体即可满足人体基本营养需求的植物。据报道，藜麦基因组大小约为967M，为异源四 倍体物种（2n= 4x= 36)，基因组序列组装困难，至今尚无基因组测序相关报道，因此，很 难大规模开发分子标记。RAPD(randomamplifiedpolymorphicDNA)是首先报道的基于 藜麦DNA的分子标记。此类分子标记可用于藜麦种间杂交种的鉴定以及藜麦和其它藜科物 种的遗传变异分析。随后，通过对富含微卫星基元的克隆进行测序，Masonetal.开发并 验证了 208个在藜麦种间具有较高多态性的共显性SSR分子标记。研究表明，相比于二核 苷酸重复的SSR分子标记，三核苷酸重复的SSR(>20bp)具有更高的多态性。借助富含 GA，CAA和AAT重复的文库以及BES(bacterialartificialchromosome-endsequence)， Jarvisetal.开发了 216 个新型多态性SSR以及 6 个BES-SSR，多态性PIC(polymorphism informationcontent)介于0. 12~0. 90之间，并构建了藜麦首个基于SSR标记的遗传连 锁图谱。该遗传连锁图谱包含200个SSR，由38个连锁群组成，覆盖了藜麦913cM的遗传距 离。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是针对目前藜麦分子标记数量较少的不足，利用公共数据库中藜麦 表达序列数据，通过生物信息学手段大规模挖掘藜麦EST-SSR，对部分藜麦EST-SSR进行了 验证及多态性分析，并利用开发的EST-SSR对藜科种质的遗传多样性进行了评价。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一组藜麦EST-SSR分子标记，其特 征在于：包括有如下66个位点所对应的正向和反向引物：
[0006]
[0010] 本发明所述的藜麦EST-SSR分子标记的开发方法，包括以下步骤：
[0011] 1)从NCBI数据库获取RNA-seq及EST序列；
[0012] 2)利用生物信息学软件对序列进行处理、组装、拼接成unigene，并对unigene进 行SSR位点搜索从而获取EST-SSR;
[0013] 3)设计EST-SSR引物扩增藜麦基因组DNA，并对EST-SSR进行验证；
[0014] 进一步的，在所述步骤3)中，EST-SSR引物设计采用如下参数设置：Tm为 58°C±3°C，引物长度为20bp±3bp，产物预期长度为IOObp~450bp。
[0015] 进一步的，所述步骤3)中PCR扩增程序为94°C3min;94°C30s，58°C35s， 72°C50s，38 个循环；72°C3min。
[0016] 进一步的，所述步骤3)中PCR扩增体系为25y1，含有2mmol/LMgCl2,100ymol/ LdNTP，0. 2ymol/L引物，IUTaq酶及 50ngDNA。
[0017] 本发明所述的藜麦EST-SSR分子标记在藜科种质遗传多样性分析中的应用。
[0018] 进一步的，所述藜科种质是指包括藜麦在内的藜科植物。
[0019] 本发明的有益效果：
[0020] 1、本发明基于公共数据库开发的EST-SSR分子标记具有高效性。本发明根据获取 的14.OG藜麦RNA-Seq数据以及EST数据拼接得到19, 571条unigene。其中，16, 854条 序列含有20, 338SSR位点，包含1，862个非单核苷酸重复SSR(二、三、四、五、六核苷酸重 复）。
[0021] 2、本发明开发的EST-SSR成功率高、多态性丰富。随机选取119对EST-SSR引物 对藜麦DNA以及其它藜科种质DNA中进行扩增。结果显示，共有66对能够在藜麦DNA扩增 中获得清晰的扩增条带，成功率55. 9%。66对引物中，58对引物在10%的聚丙烯酰胺凝胶 上能够扩增出两种以上类型的条带，其中5对引物能够扩增出最多的4种类型条带，平均每 对引物能扩增出2. 2种条带。通过PIC计算，61个为多态性EST-SSR(PIC彡0. 10)，占总数 的 92. 4% 〇
[0022] 3、本发明开发的EST-SSR通用性较强。本发明收集了 8份来源不同的藜科种质，包 括4份藜麦，2份苍白茎藜，1份台湾藜和1份杖藜，分别来自于四个大洲的5个国家地区。 66对EST-SSR引物在8份藜科种质DNA中均能扩增出多种类型的条带，显示了良好的通用 性。
【附图说明】
[0023] 图1为基于相似性系数构建的8份藜科种质的UPGMA树状图。
【具体实施方式】
[0024] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0025] 1)藜麦表达序列数据的获取及unigene的拼接。从NCBI的SRA数据库（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)共获取 11. 9GIlluminaHiSeq2000 的RNA-Seq数据（登录 号：SRX257003 和SRX256971)以及 2.IGRoche454 的EST数据（登录号：SRX084791)。经 过对原始数据进行转换、清理、过滤，利用Trinity软件拼接得到19, 571条unigene，总碱基 数为80, 448, 006bp，平均每条unigene长约4kb。其中16, 854条序列含有SSR位点。
[0026] 2)藜麦EST-SSR位点的鉴定。通过MISA软件（http://pgrc.ipk-gatersleben. de/misa/)对unigene序列进行SSR位点识别，SSR位点的识别条件为：单核苷酸重复不低 于10次，二核苷酸重复不低于8次，三核苷酸重复不低于7次，四核苷酸重复不低于5次， 五核苷酸及六核苷酸重复不低于4次；复合SSR的识别条件是2个SSR之间的距离不超过 50bp。结果发现藜麦EST-SSR重复类型丰富，从单核苷酸重复到六核苷酸重复均有出现。 非单核苷酸重复有1，862个。其中，二核苷酸重复SSR最多，占非单核苷酸重复SSR总数的 38. 3% (713个），其次为三核苷酸重复，占非单核苷酸重复SSR总数的22. 7% (423个），最 少的为六核苷酸重复，占非单核苷酸重复SSR总数的11. 7% (217个）。
[0027] 3)藜麦EST-SSR的引物设计。利用Primer3. 0软件对侧翼序列大于200bp且重 复长度大于16bp的非单核苷酸重复SSR位点进行引物设计，引物设计采用如下参数设置： Tm为58°C±3°C，引物长度为20bp±3bp，产物预期长度为IOObp~450bp，其它参数设为默 认。共有119个EST-SSR设计了引物对。
[0028] 4)藜麦EST-SSR的验证及多态性分析。利用KarrotenDNA提取试剂盒对试验材 料的幼苗进行DNA提取。经过1%琼脂糖凝胶检测的DNA用于PCR扩增。PCR反应总体系 为25以1，含有2臟〇1/1]\%(：12，10(^111〇1/1(1犯1 3,0.2 4111〇1/1引物，11]139酶及501^0熟。 ?〇?反应程序为：94￡€31^11;94 1€308,581€358,721€508,38个循环；721€3111111。？〇?扩增 产物在10 %聚丙烯酰胺凝胶上以IOOV电压电泳120min，EB染色后在紫外透射仪上观察结
个等位基因的频率，k为等位基因的数量。PIC彡0. 10为多态性SSR，PIC彡0. 70为高多 态性SSR。共有119对EST-SSR引物对8份藜科种质DNA进行扩增（见表1)，66对引物在 10%的聚丙烯酰胺凝胶上能够获得清晰的扩增条带，成功率55. 9% (见表2)。其中，六核 苷酸重复SSR的成功率最高，为74. 3%，五核苷酸重复SSR的成功率最低，为31. 8%。66对 引物共扩增出145种条带，平均每对引物能扩增出2.2种条带。通过PIC计算，61个为多态 性EST-SSR(PIC彡 0? 10)，占总数的 92. 4%。
[0029] 表1 8份供试材料
[0035] 5)藜麦EST-SSR分子标记在藜科种质遗传多样性分析中的应用66个EST-SSR 分子标记用于8份藜科种质的基因型分析。聚类分析采用NTSYSpc2.1软件，该分析基于 UPGMA法（unweightedpairgroupmethodanalysis)计算遗传相似性。选取根据UPGMA聚类结果，来自南美的四份藜科种质被聚成一类，包括三份藜麦和一份苍白茎藜；来自北美 的杖藜、欧洲的藜麦以及中国的台湾藜被明显的分开，各自分成三类；来自南美的另一份苍 白茎藜并没有与南美的其它四份藜科种质分成一类，提示该份苍白茎藜与其它来自同一区 域的四份藜科种质亲缘关系较远（见图1)。该结果表明EST-SSR能够将藜科种质按照区域 分开，展示了藜麦EST-SSR在不同藜科物种间良好的通用性。
【主权项】
1. 一组藜麦EST-SSR分子标记，其特征在于：包括有如下66个位点所对应的正向和反 向引物：2. 根据权利要求1所述藜麦EST-SSR分子标记的开发方法，其特征在于：该方法包括 以下步骤： 1) 从NCBI数据库获取RNA-seq及EST序列； 2)利用生物信息学软件对序列进行处理、组装、拼接成unigene，并对unigene进行SSR 位点搜索从而获取EST-SSR ; 3) 设计EST-SSR引物对藜麦基因组DNA进行PCR扩增，并对EST-SSR进行验证。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述步骤3)中，EST-SSR引物设计采用 如下参数设置：Tm为58°C±3°C，引物长度为20bp±3bp，产物预期长度为lOObp~450bp。4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR扩增程序为 94°C3min;94°C30s, 58°C35s, 72°C50s, 38 个循环；72°C3min。5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中PCR扩增体系为25y1，含 有 2mmol/LMgCl2，100ymol/LdNTP，0.2ymol/L引物，1UTaq酶及 50ngDNA。6. 权利要求1所述藜麦EST-SSR分子标记在藜科种质遗传多样性分析中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述藜科种质是指包括藜麦在内的藜科 植物。
【专利摘要】本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及藜麦EST-SSR分子标记及其开发方法与应用。一组藜麦EST-SSR分子标记包括66个位点所对应的正向和反向引物，其开发方法包括步骤：1)从NCBI数据库获得RNA-seq及EST序列；2)利用生物信息学软件对序列进行处理、组装、拼接成unigene，并对unigene进行SSR位点搜索获取EST-SSR；3)设计EST-SSR引物扩增藜麦基因组DNA对EST-SSR进行验证，利用验证的EST-SSR分子标记在藜科种质中进行遗传多样性分析的应用。本发明基于公共数据库开发的EST-SSR分子标记具有高效性,成功率高、多态性丰富,且通用性较强。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105087574
【申请号】CN201510595296
【发明人】张体付, 赵涵, 戚维聪
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月17日