专利名称：跳虫热激蛋白基因hsp70在土壤环境质量监测中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种环境生物标志物用于进行土壤污染监测的方法。具体而言，本发明涉及利用定量跳虫(Folsomia Candida)的hsp70基因表达量与土壤污染水平之间的剂量-效应关系表征污染土壤的毒性，适应于土壤环境污染的诊断、环境预警和生态风险评估。
背景技术：
土壤污染是个日趋严重的环境问题，直接威胁人类食品健康的安全和土壤生态功能的可持续发展。关于污染土壤的毒性和和风险评价已经引起广泛的关注，但是只有结合化学和生物学的方法才可以有效地检测土壤污染物与生物体之间的相互作用。跳虫F.Candida作为一种重要的模式生物，常被用作于污染物的生态毒性测试。由于它的生长、发育和繁殖对环境污染比较敏感，这些指标可以作为诊断终点用于土壤污染诊断和生态风险评价。许多生态毒理测试结果表明，生物体在分子和个体水平上对污染胁迫都一定程度的响应。但是，相比而言，分子水平的响应要先于个体水平。跳虫F.Candida hsp70基因是hsp家族中最保守的蛋白，它可以在低剂量污染物胁迫下短时间内就显著表达。研究发现土壤无脊椎动物纟丘蝴L.terrestris和E.fenia在金属暴露下hsp70基因表达水平显著上调。然而，尚不清楚跳虫F.Candida hsp70基因的表达能否作为分子标志物来监测土壤环境的变化。因此，本领域需要一种与现有的个体水平响应相比更加及时、准确的分子水平的生物标记物和土壤环境质量监测方法。
发明内容
本发明克服了现有环境监测手段中的不足。发明人提供的数据证明以跳虫F.Candida hsp70基因表达为生物标志物，可以为检测污染土壤毒性提供可靠的方法。从而为土壤污染诊断和生态风险评价提数据支持，满足我国现行土壤管理需要，维护土壤安全与可持续利用。因此，本发明一方面提供一种用于土壤环境质量监测的方法，该方法包括以下步骤:a)将跳虫(Folsomia Candida)暴露于待测土壤中；b)检测暴露后的跳虫中hsp70基因的表达水平。基因的表达水平检测可通过本领域公知的各种方法进行。在本发明的一个实施方案中，hsp70基因的表达水平通过荧光定量PCR进行检测。在本发明的一个实施方案中，跳虫暴露于待测土壤中最快48小时后进行所述检测。在本发明的一个 实施方案中，进一步包括将步骤b)中检测的跳虫hsp70基因的表达水平与标准曲线进行比较，由此确定待测土壤的污染水平。在本发明公开的基础上，本领域技术人员可知本发明的方法适用于多种土壤污染物的监测。在本发明的一个实施方案中，待测土壤包含金属污染物，例如Hg。在本发明的一个实施方案中，可检测的金属污染物(例如Hg)的最低浓度可达0.25m/kg。在此类方法中，半数效应浓度EC50值可以为0.42mg/kg。在本发明的一个实施方案中，待测土壤包含有机磷农药，例如丙溴磷。在此类方法中，半数效应浓度EC50值可以为0.42mg/kg。本发明还涉及一种用于土壤环境质量监测的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测跳虫中hsp70基因的表达水平的试剂。用于检测基因表达水平的试剂可以根据本领域公知的技术制备，例如所述试剂可以包括扩增目的基因的引物，聚合酶等。优选地，所述试剂盒中还包括检测对照基因，例如P-actin的试剂。本发明还涉及跳虫hsp70基因在土壤环境质量监测中的应用。在一个实施方案中，所述应用包括跳虫hsp70基因在制备用于土壤环境质量监测的试剂盒中的应用。与现有技术相比，本发明具有下列特点和有益效果:(I)本发明比个体水平更加敏感，准确，适合污染土壤的早期诊断与预警；(2)本发明属于急性毒性实验，耗时短。
图1是本发明得出的土壤Hg浓度与跳虫hsp70基因表达的关系图；图2是本发明得出的土壤丙溴磷(PFF)浓度与跳虫hsp70基因表达的关系图。
具体实施例方式下面给出的实施例拟以对本发明作进一步说明，但不能理解为是对本发明保护范围的。本发明使用跳虫F.Candida hsp70基因的表达进行土壤环境质量监测，主要是包括以下几个步骤:1、跳虫可以容易地获得(例如，可从http://www.collembase.0rg网站购买)并在实验室饲养、繁殖(参见高艳，卜云，栾云霞，尹文英，2006.白符虫兆胚胎发育的形态观察(弹尾纲:等结虫兆科).动物学研究，27 =519-524)。跳虫的暴露:将虫龄为28-30天的跳虫将暴露于不同程度的污染土壤中，暴露时间为48小时。2、跳虫总RNA的提取:利用Trizol试剂提取跳虫总RNA。实验中所有用具都经过DEPC水处理后高压灭菌。具体步骤如下:(1)在1.5ml离心管内用封口的移液枪枪头捣碎跳虫，或者反复冻融捣碎；(2)加入Iml Trizol试剂，室温静置5分钟；(3)加入200ml氯仿，剧烈振荡15s混匀后，室温静置3分钟；(4)将离心管4°C下12000r/min离心10分钟后，RNA分布于水相中；(5)将上层无色水相转移到另一 1.5ml离心管中，加入500 V-1异丙醇,室温静置10分钟；
(6)4°C下 13000r/min 离心 15 分钟；(7)弃去上清液，用Iml 75%酒精洗涤RNA沉淀物，4°C下7500r/min离心5分钟；(8)弃去上清液，再7500r/min离心I分钟，用枪头吸干液体，将离心管开口室温干燥15分钟；(9)向干燥的沉淀物中加入40 U I DEPC水，溶解沉淀物，于_80°C保存。检测:1.5 %琼脂糖电泳检测RNA的完整性；RNA水溶液用DEPC水稀释10倍，微量核酸蛋白分析仪 Nanodrop Technologies 测定 RNA 的 0D260、0D280 值(0D260/0D280 均>
1.8，为 1.8-2.0)。经no-RT PCR检验无基因组污染后RNA用于cDNA的合成。以RNA为模板，M-MLV法反转录。其中MMLV酶、oligo (dt)、Rnase抑制剂均购自Promega公司。具体步骤如下:(I)在一个 200iil PCR 管内加入以下组分:总 RNA(400ng/iil)2iil，oligo (dt) I U 1，无 RNase H2O 2 U I ；(2)离 心，使得试剂集中于管底；(3)将以上混合物70°C保温10分钟，迅速在冰上冷却2分钟； (4)将PCR管内再加入以下组分:M_MLV缓冲液4 iU，IOM dNTP 2u I, RNase抑制剂 I ii 1，M-MLV Rase I U 1，无 RNase H2O 7u I ；(5)将混合物42°C延伸Ih ；(6) 700C保温15分钟，冰上冷却，-20°C保存。3、多聚酶链式(PCR)反应及产物回收及克隆、测序:hsp70、^ -actin基因PCR反应的引物见表I。50iil体系包括以下成分:5iil的10XPCR缓冲液，4iil 2.5mM dNTPs,0.5 ill Taq聚合酶(5U/ yl)，引物各I yl (终浓度为0.3 y M)，和2 yl的cDNA模板(浓度约为1-1Ong),剩下的用无菌水补足。PCR的反应程序如下:94°C预变性5min ；35个循环的常规PCR即94°C变性45s，58°C退火45s，72°C延伸2min ;72°C延伸lOmin。PCR的纯度和产量用I %的琼脂糖电泳检测。表I跳虫PCR引物
权利要求
1.一种用于土壤环境质量监测的方法，该方法包括以下步骤: a)将跳虫(FolsomiaCandida)暴露于待测土壤中； b)检测暴露后的跳虫中hsp70基因的表达水平。
2.权利要求1所述的方法，其中所述hsp70基因的表达水平通过荧光定量PCR进行检测。
3.权利要求1或2所述的方法，其中在跳虫暴露于待测土壤中最快48小时后进行所述检测。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将步骤b)中检测的跳虫hsp70基因的表达水平与标准曲线进行比较，由此确定待测土壤的污染水平。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中待测土壤包含金属污染物，所述金属污染物优选为Hg，其中所述金属污染物优选为Hg的最低效应浓度为0.25m/kg。
6.权利要求5所述的方法，其中半数效应浓度EC50值为0.42mg/kg。
7.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中待测土壤包含有机磷农药，所述有机磷农药优选为丙溴磷。
8.权利要求7所述的方法，其中半数效应浓度EC50值为0.23mg/kg。
9.一种用于土壤环境质量监测的试剂盒，所述试剂盒包含用于检测跳虫中hsp70基因的表达水平的试剂。
10.跳虫hsp70基因在土壤环境质量监测中的应用。
全文摘要
本发明涉及跳虫热激蛋白基因hsp70在土壤环境质量监测中的应用。发明人发现跳虫F.candida hsp70基因可以用于土壤环境质量监测。因此，本发明提供一种用于土壤环境质量监测的方法，该方法包括以下步骤a)将跳虫(Folsomia candida)暴露于待测土壤中；b)检测暴露后的跳虫中hsp70基因的表达水平。本方法以人工养殖的土壤动物跳虫F.candida为实验动物，在最快48小时内利用跳虫的hsp70基因表达量为监测土壤质量的指标，来快速监测诊断土壤质量。本发明的方法可应用于污染土壤的早期诊断与预警、土壤质量的评估，与传统的毒性测试方法相比，它灵敏、快速。
文档编号C12Q1/68GK103215343SQ201210016609
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者贺纪正, 刘玉荣, 郑袁明 申请人:中国科学院生态环境研究中心