专利名称：用于多重连接扩增技术的探针制备方法
技术领域：
本发明涉及寡核苷酸探针制备，具体为可用于多重连接扩增技术(MLPA)的长探针的制备方法。
背景技术：
多重连接扩增技术(multiplex Ii gat ion-dependent probe amplification， MLPA)是一种高通量的基因检测方法，该技术利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应管内对多达45种不同的核苷酸序列进行检测和定量分析。至今MLPA技术已应用于多种领域的研究及基因诊断，并且不断的有新的技术改进，尤其是在探针设计上，有采用M13单链噬菌体插入到衍生的序列两端涉及了限制性内切酶识别位点，以便获得采用双酶切获得长探针；
在申请号为200910108977. 4，名称为“可用于多重连接扩增技术的长探针的制备方法”，文件中公开了一种采用PCR方法结合亲和素磁殊法制备可用于多重连接扩增技术的长探针，该公开的技术方法主要包括针对目标核苷酸序列和用于制备长探针的与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列设计一对PCR扩增引物，分别为通用引物和检测引物；通用引物的5’端标记生物素；以所述与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列为模板进行PCR扩增，获得生物素标记的双链核苷酸序列；将生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素标记的亲和素磁珠混合，使生物素标记的双链核苷酸序列与亲和素磁蛛相互吸附；使生物素标记的的双链核苷酸序列变性，解链形成单链；离心取上清，获得非生物素标记的单链核苷酸序列。该方法虽然操作简单，但是需要磁珠分离系统，成本较高，并且在磁珠分离过程中有磁珠结合不完全造成dsDNA残留，探针得率不高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种低成本、高得率的可用于多重连接扩增技术的探针制备方法。用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤
1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GPl和GP2，用于最后的PCR扩增检测，所述的GPl为5’端带荧光基团修饰，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针RP0-N，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；
2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LP0-N’，其中GPL是由GPl的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO-N'由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；
3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列；
4)纯化回收PCR产物；5)采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA ；
6)采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。所述PCR扩增得到的5’磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行 Lambda外切酶消化。步骤5)所述的Lambda外切酶消化过程中，1 μ g双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。本发明所述MLPA探针制备方法与采用M13噬菌体制备MLPA相比，具有以下优点 1) PCR扩增引物简单，只需考虑引物Tm值和长度等一般性问题，通过结合目标核苷酸
序列，针对模版设计一对引物即可。2)利用简单的PCR和Lambda外切酶消化即可获得长探针，无需M13噬菌体培养， 可一天内完成探针制备工作，大大降低了 MLPA技术门槛。3)无需进行克隆制备，无需特异性内切酶酶切，操作简单。4)探针制备灵活性更强，可针对基因组DNA、质粒、人工基因序列等进行制备所需探针。5)探针所需的填充序列来源方便，可使不同探针填充序列保持一致，也可根据需要选择不同模版扩增所需填充序列，降低杂交时的非特异性杂交，提高检测成功率。本发明所述MLPA探针制备方法与采用链亲和素磁珠法制备MLPA相比，具有以下优点
1)成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，无需添置单独的磁珠分离系统，且每μ gDNA探针制备成本不到磁珠法1/10。2)酶消化后使用专门的ssDNA回收试剂盒进行回收，排除了没有消化完全的 dsDNA和核苷酸，保证得到的为所需单链探针，避免了磁珠分离过程中磁珠结合不完全造成的dsDNA残留，提高MLPA实验时的杂交效率。3)探针得率高，通过充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的将dsDNA变为 ssDNA,避免了磁珠法中因为磁珠结合后DNA变性不完全造成的ssDNA得率下降，从而提高了探针制备效率。
图1本发明的方法流程图2本发明实施例中的琼脂糖凝胶电泳分析结果图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实例说明本发明的制备方法，具体为用多重连接扩增技术检测人基因组CECRl基因的长探针的制备及其检测，包括以下步骤
1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GPl (5’端带荧光基团修饰)和GP2，用于最后的PCR扩增检测；同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针CN 102534004 A
R-CECRl，由CECRl右探针序列与GP2的反向互补序列组成；
2)与待检测靶片段无关的模板核苷酸序列(S)的选择，并根据S和目标核苷酸序列设计引物；
3)人工合成引物GPL(由GPl的序列和S序列的前18nt组成)和L-CECRl'(由S序列下游23nt的反向互补序列+CECRl左探针序列的反向互补序列CECR1，组成)，且在L-CECRl， 的5’末端带上磷酸化修饰；
4)PCR扩增；
5)PCR产物纯化回收；
6)Lamda核酸外切酶对PCR纯化回收产物进行消化；
7)用ssDNA纯化回收试剂盒对Lamda核酸外切酶消化的PCR产物进行回收，即得到用于多重连接扩增技术左端的长探针，由GPl的序列、S序列和CECRl的左探针序列组成。8)用上述得到的CECRl基因的左端长探针与合成的5’端磷酸化的右端短探针一起跟基因组DNA进行杂交反应，连接后PCR扩增，行琼脂糖凝胶电泳分析。实施步骤1引物的设计合成。设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的易于进行PCR扩增的检测引物，分别为GPl (5’端带荧光基团修饰)和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针R-CECR1，由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成。选择质粒pET_14b (购自Novagen)中一部分序列为与待检测靶片段无关的模板序列(S)，并根据CECRl基因的左探针序列和S序列设计并人工合成左端长探针制备专用的通用引物GPL (由GPl的序列和S序列的前18nt组成)和制备CECRl基因左端长探针用的下游引物L-CECR1’(由S序列下游23nt的反向互补序列+CECRl左探针序列的反向互补序列 CECRl'组成)。上述引物的具体核苷酸序列为
GPl 5' GGGTTCCCTAAGGGTTGGA3' 19nt 5，端FAM修饰(用于最后毛细管电泳检测)； GP2 5' GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA 3'
GPL 5' GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGTCGCTTGCGGTATTC 3，(下划线部分为 GPl 的序列，剩余部分为S序列的前18nt) L-CECRl，
5'ATTTTGAGCGTCATGAGCCTCTCATTGGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATC3' 51nt (下划线部分为CECRl左探针序列的反向互补序列，剩余部分为S序列下游23nt的反向互补序列) R-CECRl
5' CGCTGAGATGAAGGAGGCCATGAGGACCCTGATATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC3' 57nt 5' 端磷酸化修饰(下划线部分为CECRl右探针序列，剩余部分为GP2的反向互补序列GP2') 最终PCR扩增得到的左端长探针片段具体序列为 GGGTTCCCTAAGGGTTGGA (GPl 序列)
CTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGT TTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCG AGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGT CCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCA (S 序列) CCAATGAGAGGCTCATGACGCTCAAAAT (CECRl 左探针序列) 实施步骤2 PCR扩增及其产物的纯化回收。以质粒pET_14b为模板，用引物GPL和L-CECR1’进行PCR扩增。1)PCR反应体系
权利要求
1.用于多重连接扩增技术的探针制备方法，包括以下步骤.1)设计一对与待测靶片段及长探针核苷酸序列无关的检测引物，分别为GPl(5’端带荧光基团修饰)和GP2，用于最后的PCR扩增检测，同时合成5’端带磷酸化修饰的右探针 RP0-N,由目的右探针序列与GP2的反向互补序列组成；.2)确定一段与探针及通用引物无关的核苷酸序列S，并用于设计一对扩增左端长探针的引物，分别为GPL和LP0-N’，其中GPL是由GPl的序列与S序列的前18bp左右的序列组成，LPO-N'由目的左探针序列的反向互补序列与S序列中的18bp左右反向互补的序列组成，并且其5’端要带上磷酸化修饰；.3)用GPL和LPN以所述的一段与探针及通用引物无关的核酸序列为模板进行PCR扩增，获得互补链5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列；.4)纯化回收PCR产物；.5)采用核酸Lamda外切酶对以上双链核苷酸序列进行消化，去除5’磷酸化标记的那条单链DNA ；.6)采用ssDNA纯化回收试剂盒对消化产物进行回收，便得到左端长探针。
2.根据权利要求1所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤.2)所述的用于扩增左端探针的引物由两段核苷酸序列组成，一段根据探针检测目标的核苷酸序列设计，另一段根据与待检测靶片段无关的模版核苷酸序列设计。
3.根据权利要求1所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤.3)所述PCR扩增得到的5’端磷酸化修饰的双链核苷酸序列需先经过纯化再进行Lambda外切酶消化。
4.根据权利要求1所述的用于多重连接扩增技术的探针制备方法，其特征在于，步骤 5)所述的Lambda外切酶消化过程中，1 μ g双链DNA用1个单位Lambda外切酶消化。
全文摘要
本发明公开了可用于多重连接扩增技术(MLPA)的长探针的制备方法，包括以下步骤1)选择与待测目标序列无关的载体作为模板，并根据目标核苷酸序列和目标探针长度设计引物；2)人工合成引物；3)PCR扩增；4)PCR产物纯化回收；5)使用Lambda外切酶对PCR产物进行消化；6)回收单链DNA。本发明所述MLPA探针制备方法成本低廉，只需要PCR仪即可完成扩增、酶切等全部操作，酶消化后使用专门的ssDNA回收试剂盒进行回收，排除了没有消化完全的dsDNA和核苷酸，提高MLPA实验时的杂交效率，通过充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的将dsDNA变为ssDNA，从而提高了探针制备效率。
文档编号C12Q1/68GK102534004SQ20121000824
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者黄劭 申请人:武汉缉熙生物科技有限公司