专利名称：转Bt基因抗虫农作物标准质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，及其在定量检测转Bt基因农作物的转基因含量中的应用，以及利用该标准质粒对转Bt基因农作物的转基因含量进行检测的荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶体蛋白基因的简称。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt 二大类。迄今为止，已经报道的 Bt 达至Ij 476 种，其中 Cry 分为 58 群、449 种，Cyt 分为 2 群、27 种(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2. html)。经过密码子优化的 Bt 基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中玉米、棉花、 马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了 24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到2010年的14800万公顷，14年间增长了 87倍。近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、 1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、 特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，解决转基因抗虫农作物检测中标准物质缺乏的难题，提供一种准确、快速、简便、省时省力的转Bt基因农作物检测试剂盒。本发明采用的技术方案是一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，由SEQ ID No. I (长度174bp)所示核苷酸片段两端添加Pst I酶切位点后，所得片段插入常规克隆载体(如pEASY-T3、PMD18-T、 PMD19-T等)制得。具体的，所述的转Bt基因抗虫农作物标准质粒，由SEQ ID No. 2 (长度186bp)所示核苷酸片段插入PEASY-T3载体制得，以下简称186号质粒。所述标准质粒由如下方法构建I.设计PCR特异性引物；2. PCR 扩增；3. Bt目标序列获取，片段长度174bp，通过测序进行验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；4.构建标准质粒；5.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；6.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；7.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果进行分析。本发明还涉及所述转Bt基因抗虫农作物标准质粒在检测转Bt基因农作物的转基因含量中的应用。所述转Bt基因抗虫农作物标准质粒可用于检测下列之一的Bt外源基因(I) CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。所述农作物可为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。本发明还涉及一种转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因抗虫农作物标准质粒，所述特异性引物和探针序列如下Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5，-(FAM)CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3，，其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团；使用以上试剂盒对转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测可按本领域常规方法进行，提取待测样品基因组DNA后，配制PCR缓冲液进行PCR扩增，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断待测农作物是否含有相应外源基因； 同时以标准质粒梯度浓度溶液于相同条件下进行扩增，绘制标准曲线，对照标准曲线，即可获得待测样品中外源基因的拷贝数。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济，解决了转基因抗虫农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便、省时省力的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。
图I为pEASY-T3重组载体结构示意图；图2为Bt基因验证电泳图；M =Marker ;1 4 :Bt扩增图3 为 EcoRI 单酶切(M Marker)结果；图4为EcoRI&Spel双酶切结果；图5为186号质粒测序结果与合成序列比对图；图6为186号质粒的Bt基因荧光定量PCR结果；图7为186号质粒Bt片段第I天荧光定量PCR结果图8为186号质粒Bt片段第3天荧光定量PCR结果图9为186号质粒Bt片段第7天荧光定量PCR结果图10为186号质粒Bt片段第14天荧光定量PCR结果图11为186号质粒Bt片段第21天荧光定量PCR结果图12为186号质粒Bt片段第28天荧光定量PCR结果图13为186号质粒Bt基因均匀性qPCR分析；图14为186号质粒荧光定量LOD结果；图6 图14中，A为荧光定量PCR分析图，其中横坐标为起始拷贝数的对数，纵坐标为Ct值；B为Ct值确定图，其中横坐标为Ct值，纵坐标为起始拷贝数的对数；
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :186标准质粒的构建I.设计PCR特异性引物；Bt-F :5’ -TTCCTTGGACGAAATCCCACC-3’Bt-R :5，-GCCAGAATTGAACACATGAGCGC-3，2. PCR 扩增；利用设计的PCR引物特异性扩增转Bt基因抗虫农作物的特异性序列。3. Bt目标序列获取，并通过测序进行验证；上述2中获得的扩增后特异性序列即为Bt目标序列，其片段为174bp，用美国ABI 公司3730型测序仪对其进行测序验证；并设计荧光定量PCR引物及探针；荧光定量PCR引物及探针如下所示Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5，-(FAM)CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’长度为174bp转Bt基因的特异性片段序列如下CGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGTGTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGT
TAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATGCTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTAC4.构建标准质粒；将4中所选取的174bp的Bt特异片段经过拼接，其间加入常见的酶切位点Pst I 后，获得长度为186bp的基因片段，而后插入PEASY-T3载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，完成标准质粒的组合，标准质粒如附图1(因其插入片段长度为186bp，本发明简称186号质粒)。其重组流程如下a.基因序列的QC :对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列情况设计合成方案；b.根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；c.利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；d.将合成好的基因装入pEASY_T3Cloning载体并转化至感受态细胞DH5a ；e.测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。质粒重组片段序列如下186号质粒插入片段长度为186bp，Bt (174bp)，酶切位点Pst ICTGCAGCGCCTTGACCACAGCTATCCCATTGTTCGCAGTCCAGAACTACCAAGTTCCTCTCTTGTCCGT GTACGTTCAAGCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGGATTCGATG CTGCAACCATCAATAGCCGTTACAACGACCTTACCTGCAG5.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；(I) PCR 验证对所构建的186号质粒用Bt基因引物进行扩增电泳，在目标片段区域获得清晰的单一预期条带，如图2，说明这个片段已经被正确地插入质粒中。(2)酶切验证根据插入片段和pEASY-T3载体TA克隆位点两端特异性较高的酶切位点选择 EcoRI单酶切和EcoRI&Spel双酶切，结果见图3、4。根据载体结构图以及载体和整合片段序列估算，186号质粒经EcoRI单酶切以后除了载体片段，可以看到220bp左右的酶切片段，电泳结果与预期结果一致j^EcoRI&Spel双酶切处理后，同样除了载体片段，清晰可见215bp 左右的酶切片段，与预期结果相符，由此基本肯定质粒片段的正确性。(3)测序验证根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序。并对测序结果与设计序列进行匹配对比，结果完全吻合，验证了质粒序列100%的可靠性，比较结果如图5。6.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；(I)标准质粒的浓度测定和检测重复性质粒突光定量PCR引物与4中相同，探针采用Primer Express2. O和Beacon designer 设计，然后由 TaKaRa 公司负责合成。根据 PicoGreen dsDNAReagent and Kits 所测定母液浓度计算质粒拷贝数，再用灭菌去离子水分别稀释成初始模板拷贝数为107、106、 ΙΟ5、104、IO3,100、10拷贝的标准质粒进行荧光定量PCR绘制标准曲线，从而建立标准质粒的qPCR定量分析体系并用于实际标准分子的定量分析，重复定量分析3次，分析检测灵敏性。表I为荧光定量PCR 25 μ I扩增体系，表2为qPCR扩增程序，荧光定量PCR探针序列如下Bt :5’(FAM)-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse)-3’表I :荧光定量PCR 25 μ I扩增体系
权利要求
1.一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，由SEQ ID No. I所示核苷酸片段两端添加Pst I酶切位点后，所得片段插入克隆载体制得。
2.如权利要求I所述的转Bt基因抗虫农作物标准质粒，由SEQID No. 2所示核苷酸片段插入pEASY-T3载体制得。
3.如权利要求I所述转Bt基因抗虫农作物标准质粒在检测转Bt基因农作物的转基因含量中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转Bt基因抗虫农作物标准质粒用于检测下列之一的 Bt 外源基因(I) CryIA (a), (2) CryIA (b), (3) CryIA (c), (4) Crylab/ac。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述农作物为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.一种转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR 缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因抗虫农作物标准质粒，其特征在于所述特异性引物和探针序列如下Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5’ -(FAM) CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG(Eclipse) -3’，其中 FAM 为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团；所述转Bt基因抗虫农作物标准质粒由SEQ ID No. 2所示核苷酸片段插入pEASY_T3载体制得。
全文摘要
本发明提供了一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒及其应用，所述标准质粒由SEQ ID No.1(长度174bp)所示核苷酸片段两端添加Pst I酶切位点后，所得片段插入克隆载体制得。本发明提供了一种转Bt基因抗虫农作物标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济，解决了转基因抗虫农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便、省时省力的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。
文档编号C12Q1/68GK102586301SQ20121000831
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者付贤树, 俞晓平, 叶子弘, 崔海峰, 赵煦泓, 金荣愉 申请人:中国计量学院