专利名称：转Bt基因棉花标准质粒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种转Bt基因棉花标准质粒，及其在定性检测转Bt基因农作物及定量检测转Bt基因棉花转基因含量上的应用，以及利用该标准质粒对转Bt基因农作物的转基因含量进行检测的荧光定量PCR检测试剂盒。
背景技术：
Bt基因是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶体蛋白基因的简称。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一个编码Bt杀虫晶体蛋白基因，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。Bt基因中分为Cry和Cyt 二大类。迄今为止，已经报道的 Bt 达至Ij 476 种，其中 Cry 分为 58 群、449 种，Cyt 分为 2 群、27 种(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2. html)。经过密码子优化的 Bt 基因已被成功地导入烟草、玉米、棉花等多种植物，获得一大批具良好抗虫性的转基因植物品种和种质资源，Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛、最具潜力和应用前景的抗虫基因。目前全世界总共已获得了50多种转Bt杀虫晶体蛋白基因植物，其中水稻、玉米、 棉花、马铃薯、油菜、杨树、烟草等已商品化，我国农业部于2009年批准转基因抗虫水稻的生物安全证书。自1996年首例转基因农作物产业化应用以来，全球转基因技术研究与应用产业快速发展。截至2010年底，已有25个国家批准了 24种转基因作物的商业化应用。以转基因大豆、棉花、玉米、油菜为代表的转基因作物种植面积由1996年的170万公顷发展到 2010年的14800万公顷，14年间增长了 87倍。ACP基因是棉花内源基因，用于定量检测的棉花ACP基因片段长度为116bp的DNA 片段；其核苷酸序列不仅具备种内一致性，即所有棉花品种中含有ACP基因；还具备种间特异性，即在除棉花外其它物种里没有该基因DNA片段。近年来，关于转基因植物的安全性事件报道不断，如1996年巴西豆过敏事件、 1998年Pusztai事件、1999年美国大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星联Bt玉米事件、2007年印度转基因抗虫棉事件、加拿大超级杂草事件和中国抗虫棉事件等，这些事件促使国际组织和国家纷纷制定相应的安全管理法规，加强遗传改良作物的规范管理，并对遗传改良植物及其产品实施标识制度。为了应对遗传改良作物管理相关的法律法规和制度，有必要建立一套高效、快速、 特异的检测技术。聚合酶链反应(PCR)无疑是最佳选择。在实际检测中，标准物质十分关键。质粒标准分子的概念由日本科学家Kuribara等于2002年提出，它是指一种含有检测目的基因特异性片段的线性化重组质粒分子。经实验验证，不管是由单一特异性外源序列还是多段目标序列构建的质粒标准分子，都能很好的达到转基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。质粒标准分子由于生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济等优点愈来愈受全世界转基因检测专家和研究者们重视，在转基因生物鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物，应用于转基因品系以及其加工品的定量PCR检测。标准质粒分子在转基因作物和附属产品检测鉴定中的应用将会发挥越来越重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转Bt基因棉花标准质粒，解决转基因Bt农作物尤其是转Bt基因棉花检测中标准物质缺乏的难题，提供一种准确、快速、简便的转基因Bt农作物尤其是转基因棉花检测方法。本发明采用的技术方案是一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No. I (174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No. 2 (116bp)所示核苷酸片段经过拼接后，加入常见的酶切位点，插入常规克隆载体(如 PEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T 等)制得。具体的，所述的转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No. 3插入pEASY_T3载体制的， 以下简称308号质粒。所述SEQ ID No. 3由SEQ ID No. I (174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No. 2 (116bp)所示核苷酸片段经过拼接，加入酶切位点Pst I、Nde I及Sal I (该酶切位点位于两片段间)得到。所述308号质粒由如下方法构建
I.设计PCR特异性引物；
2.PCR扩增；
3.Bt目标序列获取，片段长度174bp，通过测序进行验证;:并设计荧光定量PCR引物及探针；
4.ACP目标序列获取，片段长度116bp，通过测序进行验证;并设计荧光定量PCR引物及探针；
5.构建标准质粒；
6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒；
7.对标准质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测；
8.对标准质粒特异性、稳定性及均匀性结果进行分析。
本发明转Bt基因棉花标准质粒分子既含有Bt外源基因又包括ACP棉花内源基
因，Bt外源基因既可用于定性待测农产制品是否含有转Bt基因，棉花ACP内源基因可定性检测农产制品中是否含有棉花；同时，Bt外源基因和棉花ACP内源基因可以定量检测棉花类农产制品中的转Bt基因棉花的含量。本发明还涉及所述转Bt基因棉花标准质粒在检测棉花类农产制品中转Bt基因棉花含量中的应用。所述转Bt基因棉花标准质粒可用于检测下列之一的转Bt外源基因农作物(I) CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。所述转Bt基因农作物可为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜，优选为棉花。所述转Bt基因棉花标准质粒含有棉花ACP内源基因，可在转Bt基因棉花转基因含量检测中的定性定量应用。本发明还涉及一种转Bt基因棉花的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因棉花标准质粒，所述特异性引物和探针序列如下用于检测Bt外源基因的引物和探针Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’用于检测棉花ACP内源基因的引物和探针ACP-F-Primer :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’ACP-R-Pnmer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3 ACP-Probe :5， -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3’，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。所述的转Bt基因棉花标准质粒由SEQ ID No. 3所述核苷酸片段插入pEASY_T3载体制的。使用以上试剂盒对转Bt基因农作物的荧光定量PCR检测可按本领域常规方法进行，提取待测样品基因组DNA后，配制PCR缓冲液进行PCR扩增，取PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果是否出现Bt基因的特异性条带(174bp)，判断待测农作物是否含有相应外源基因，若电泳结果同时出现ACP基因特异性条带(I 16bp)，则待测农作物为转Bt 基因棉花；同时以标准质粒梯度浓度溶液于相同条件下进行扩增，绘制标准曲线，对照标准曲线，即可获得待测样品中外源基因和内源基因的拷贝数，即可获知待测样品的外源基因含量。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种转Bt基因棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、高效经济，解决了转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的进行转Bt基因农作物的定量分析检测。
(四)
因； 4 :308
图I为pEASY-T3重组载体结构
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质粒
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2为Bt和ACP基因验证电泳图；Marker DL2000 ;1、2为Bt基因；3、4为ACP基 3 为 EcoRI 单酶切；M DL2000 ；1 Sal I 酶切；2 EcoR I 酶切；3 Pst I 酶切；
4为308号质粒测序结果与合成序列比对5为308号质粒的Bt基因荧光定量PCR结果(标准曲线)；
6为308号质粒的ACP基因荧光定量PCR结果(标准曲线)；
7为308号质粒4°C下Bt片段第I天荧光定量PCR结果；
8为308号质粒4°C下Bt片段第14天荧光定量PCR结果；
9为308号质粒4°C下Bt片段第28天荧光定量PCR结果；
10为308号质粒4°C ACP片段第I天荧光定量PCR结果；
11为308号质粒4°C ACP片段第14天荧光定量PCR结果；
12为308号质粒4°C ACP片段第28天荧光定量PCR结果；
图13为308号质粒Bt基因均匀性qPCR分析；图14为308号质粒ACP基因均匀性qPCR分析；图15为308号质粒荧光定量检测极限分析。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :308号质粒的构建本发明所述一种转基因棉花标准质粒包含外源Bt基因和ACP棉花内源基因，其构建方法包括如下步骤I.设计PCR特异性引物Bt-F :5，-TTCCTTGGACGAAATCCCACC-3’Bt-R :5，-GCCAGAATTGAACACATGAGCGC-3，2. PCR 扩增利用设计的PCR引物特异性扩增转Bt基因农作物的特异性序列。3. Bt目标序列获取，并通过测序进行验证步骤2获得的扩增后特异性序列即为Bt目标序列，其片段为174bp，用美国ABI公司3730型测序仪对其进行测序验证；并设计荧光定量PCR引物及探针，荧光定量PCR引物及探针如下所示Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’4.采用与步骤4相同方法选择ACP目标序列，选取长度为116bp的序列作为质粒的内源基因特异性片段，并设计荧光定量PCR引物及探针。荧光定量PCR引物及探针如下所示ACP-F-Primer :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’ACP-R-Primer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3 ACP-Probe :5， -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团。5.构建标准质粒将步骤4中所选取的174bp的Bt特异片段与步骤5中选取的116bp的ACP内源特异性片段经过拼接，两端添加Pst I、Nde I酶切位点，两片段间添加酶切位点Sal I后， 所得片段插入PEASY-T3克隆载体(购自北京全式金生物技术有限公司)，完成标准质粒的组合，标准质粒分子如附图I (因其插入片段长度为308bp，本发明简称308号质粒)。其重组流程如下a.基因序列的QC :对所需合成的基因全序列进行分析，检查基因内部是否含有复杂二级结构和重复序列。根据序列情况设计合成方案；b.根据基因序列分析的结果，进行单链oligo的设计及合成；c.利用PCR将合成的oligo拼接成完整的基因；
d.将合成好的基因装入PEASY-T3 Cloning载体并转化至感受态细胞DH5 α ；e.测序验证重组克隆中基因序列是否与要求相符。质粒重组片段序列如下308号质粒插入片段长度为308bp，包括Bt(174bp)、ACP(116bp)、连接两个片段的酶切位点Sal I和插入片段两端的酶切位点Pst I、Nde I。。6.通过PCR、酶切、测序等验证标准质粒(I) PCR 验证对所构建的308号质粒用Bt基因及ACP基因的前述引物进行扩增电泳，在目标片段区域获得清晰的单一预期条带，如图2，说明这二个片段已经被正确地插入质粒中。(2)酶切验证根据插入片段和pEASY-T3载体TA克隆位点两端特异性较高的酶切位点选择Sal I> EcoR I、Pst I分别单酶切308质粒，结果见图3，分别可以看到预期大小的酶切片段，由此基本肯定质粒片段的正确性。(3)测序验证根据插入片段(含两端酶切位点)设计引物，进行PCR扩增，将扩增结果进行测序。并对测序结果与设计序列进行匹配对比，结果完全吻合，验证了质粒序列100%的可靠性，比较结果如图4。7.对308号质粒进行特异性、稳定性及均匀性检测(1)308号质粒的浓度测定和检测重复性质粒突光定量PCR引物与步骤4、5中相同,探针采用Primer Express2. O和Beacon designer 设计，然后由 TaKaRa 公司负责合成。根据 PicoGreen dsDNA Reagent and Kits 所测定母液浓度计算质粒拷贝数，再用灭菌去离子水分别稀释成初始模板拷贝数为107，IO6, IO5, IO4, IO3,100，10拷贝的标准质粒进行荧光定量PCR绘制标准曲线，从而建立标准质粒的qPCR定量分析体系并用于实际标准分子的定量分析，重复定量分析3次，分析检测灵敏性。表I为荧光定量PCR 25 μ L扩增体系，表2为qPCR扩增程序，荧光定量PCR探针序列如下Bt :5’ -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’ACP :5，-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，表I :荧光定量PCR 25uL扩增体系
权利要求
1.一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No. I所示核苷酸片段与SEQ ID No. 2所示核苷酸片段经过拼接后，插入克隆载体制得。
2.如权利要求I所述的转Bt基因棉花标准质粒，由SEQID No. 3所示核苷酸片段插入 PEASY-T3载体制得。
3.如权利要求I所述的转Bt基因棉花标准质粒在检测转Bt基因农作物的转基因含量中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转Bt基因棉花标准质粒用于检测下列之一的 Bt 外源基因(I)CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的农作物为下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的农作物为棉花。
7.一种转Bt基因棉花的荧光定量PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针、PCR 缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和转Bt基因棉花标准质粒，其特征在于所述特异性引物和探针序列如下Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’其中FAM为荧光报告基团，Eclipse为荧光淬灭基团；ACP-F-Primer :5’ -CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R-Primer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-Probe :5’ -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，其中FAM为荧光报告基团，TAMRA为荧光淬灭基团；所述转Bt基因棉花标准质粒由SEQ ID No. 3所示核苷酸片段插入pEASY-T3载体制得。
全文摘要
本发明提供了一种转Bt基因棉花标准质粒及其应用，一种转Bt基因棉花标准质粒，由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段与SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段经过拼接后，加入常见的酶切位点，插入常规卡隆载体制得。本发明提供的转Bt基因棉花标准质粒，生产方便、易扩增、操作简便、稳定性好、纯度较高、高效经济，解决了转Bt基因棉花和转Bt基因农作物检测中标准物质缺乏的难题，并且提供了一种准确、快速、简便、省时省力的转Bt基因农作物检测试剂盒，能够很好的达到转Bt基因作物定量分析检测，特别是定量PCR检测的目的。
文档编号C12N15/63GK102586302SQ20121000832
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月12日 优先权日2012年1月12日
发明者付贤树, 俞晓平, 叶子弘, 崔海峰, 赵煦泓, 金荣愉 申请人:中国计量学院