用抗重组人zp4n和zp4c多抗鉴定的人卵透明带蛋白-4表位最小基序肽的制作方法

专利名称：用抗重组人zp4n和zp4c多抗鉴定的人卵透明带蛋白-4表位最小基序肽的制作方法
技术领域：
本发明 属于生物工程和免疫学技术领域，具体涉及包绕人卵子外一层由四个组成蛋白形成的透明带(zona pellcida,ZP)-4蛋白(ZP4)表位最小基序肽及其扩展短肽和应用。
背景技术：
相比减毒或灭活全病毒/寄生物疫苗和第二代亚单位疫苗，由于化学合成肽疫苗具有抗原易于恒定制备、易于保藏运输和副作用可明显降低(去除了蛋白抗原中可能致病的肽段)等优点，因此从上世纪70年代起就曾寄希望其能成为疫苗发展史上第三个里程碑。但受线性B细胞表位(B cell epitope,也称抗原决定簇antigenic determinant。以下简称表位)鉴定数的限制，至今都未成功研制出能被批准人临床应用的治疗性或预防性的合成肽疫苗。显然，合成肽疫苗的未来发展趋势应该是研制组合靶抗原上尽可能多的表位，包括选用有可能组合多个表位的生物合成肽法替代肽合成长度有限制的化学合成肽法。事实上已有这方面利用昆虫细胞和原核生物表达系统的抗疟原虫和抗肿瘤生物合成月太疫苗石开制实践(Shi YP, Hasnain SE, Sacci JB, et al. Immunogenicity and invitro protective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium falciparumcandidate vaccine. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 1615- 1620; Shi YP, Das P,Holloway B, et al. Development, expression, and murine testing of a multistagePlasmodium falciparum malaria vaccine candidate. Vaccine 2000; 18, 2902-2914;He YP, Xu WX, Hong AZ, et al. Immunogenic comparison for two differentrecombinant chimeric peptides (CPI2 and CP22) containing one or two copies ofthree linear B cell epitopes from β-hCG subunit. J Biotech 2010; 151: 15-21)。无需赘言，今后合成肽疫苗研制能否获得成功，其一突破无疑就是有赖于靶抗原上全部或接近全部表位的鉴定，以便为重组多表位肽疫苗的分子设计和生物制备提供尽可能多的候选表位(抗病毒治疗性疫苗还需同时组合细胞毒性T细胞表位)。另一方面，在转化医学领域建立特异灵敏的疾病和病毒感染诊断方法一直是重要研究方向之一。在一般用18/20聚长表位肽抗原的酶联免疫测定法(ELISA)诊断自身免疫疾病以及诸如流感病毒感染的场合，往往出现30%左右的假阳性率，从而影响临床诊断的准确性和建立诊断方法的广泛采用。造成此种场合高假阳性率的原因很简单，即由于已清楚线性表位由3-8个氨基酸残基组成，18/20聚或更长的合成肽(太短不易作为抗原包被ELISA检测板)中显然有可能存在N个不被知晓的表位，以及由于病毒和细菌自然感染(如流感病毒感染等)和自身免疫疾病等诸多原因导致人体内通常存在成千上万种抗体，因此这两个因素在以上患者血清稀释度不可能高(一般1:20 1:100)的情况下极易产生非特异性交叉反应，产生高假阳性率检测结果。基于一旦发生特定靶蛋白的自身免疫反应或病毒感染，暴露在蛋白表面的表位都会诱导产生它们各自的表位抗体这一免疫学常识，构建重组多表位肽检测特定抗原的多个抗体应该是提高检测灵敏度的一条可行途径。为此，本专利发明人构建了以国外报道的人ZP3表位肽为主的重组人ZP多表位肽抗原(徐万祥，顾少华等.人卵透明带蛋白多表位嵌合肽抗原及其制备方法.专利号ZL2009 I 0196694.X)。其初步的临床应用结果表明由于目标是检测不孕妇女血清中多个ZP抗体，使原本那些低滴度抗体得以富集，因而大大提高了检测的灵敏度(血清稀释度提高至1:2560)。同时也发现在用第一代人ZP多表位肽抗原的ELISA测定中，对照血清低稀释度(I ；20 I : 160)下的吸光OD值高达O. 4-0. 6 (虽然阳性血清OD值接近它的二倍)，在1:640 I :2560稀释度下才显示正常的本底值。为了分析产生这一高OD值的原因，特用各组合的单表位肽(融合蛋白)和二例正常男女对照血清进行了蛋白印迹试验，结果其中5个大于8个残基的单表位肽可被对照血清识别，而改用它们的含最小基序8肽后不再被识别，从而解释了对照血清产生高OD值现象是由体内非特异抗体的交叉反应性所致，并提示构建高特异性高灵敏度多表位肽检测抗原最好选用基于各组合表位的最小基序肽[徐 万祥等.ZP多表位肽抗原在不孕妇女ZP自身免疫疾病诊断中的初步应用.中国动物学会生殖生物学分会第十三次学术交流会(2011年11月16-20日，福建武夷山)-论文摘要集，p. 110 ;徐万祥等.重组人卵透明带多表位肽抗原的构建和表达.同上论文摘要集，P. 111]。背景三，动物模型研究证实抗人卵透明带蛋白疫苗可有效抑制精卵结合，进而达到抗生育效果。但其研制一直受到ZP免疫往往导致卵巢功能障碍这一主要副作用的困扰。作为一个突破，美国NIH的Dean实验室首先用一单克隆抗体(以下简称单抗)鉴定出小鼠精子受体ZP3蛋白羧基端的一个线性B细胞表位，并制备了其可导致不育的长表位化学合成月太疫苗(Millar SE, et al. Vaccination with a synthetic zona pellucida peptideproduces long-term contraception in female mice. Science 1989; 246: 935-938)。随后的研究证明此小鼠ZP3表位肽在一些免疫的近交系小鼠中仍存在由其表位肽上套叠的一个ZP特异T细胞表位诱发的卵巢炎，替换了此T细胞表位的一个关键残基，免疫不同近交系小鼠则可无卵巢炎地产生不完全的抗生育效果(Lou YH, et al. A zona pellucida3 peptide vaccine induces antibodies and reversible infertility without ovarianpathology. J Immunol 1995; 155: 2715-2720)。鉴于这些进展和观察,为达到抗生育效果完全(至少达到95%以上)且无卵巢炎发生的目标，当前研制人用ZP避孕疫苗一个值得探索的方向显然就是研制重组ZP多表位肽抗原。而要具体予以实施，就有必要对新近被证明是人精子第二受体的人ZP4蛋白(先前被命名为ZPB或ZPl。Chiu PC, et al. Effectsof native human zona pellucida glycoprotein-3 and _4 on acrosome reaction andzona pellucida binding of human spermatozoa. Biol Reprod 2008; 79: 869-877)开展表位扫描作图和精细基序鉴定，因为其意义在于可提供更多基于最小基序(可排除可能套叠存在的ZP特异致病性T细胞表位，因为T细胞表位残基数在9个残基以上)的重组多表位肽疫苗原的候选表位，特别是每一精细表位基序或扩展8肽序列，也是研制检测不孕妇女自身免疫ZP抗体的重组多表位肽检测抗原的候选表位，或单独(与GST188融合表达)作为检测ZP抗体的表位标志物。需要指出的是，因为ZP4在精卵受精过程中的重要作用，国外也曾经用兔和狒狒抗天然猪ZP蛋白多抗和用生物素标记相互部分重叠的94个系列15聚化学合成肽，开展过人ZP4蛋白线性表位扫描作图研究[Skinner SM, Schwoebel ES, Prasad SV, OgunaM, Dunbar BS. Mapping of dominant B- cell epitope of a human zona pellucida(ZPl). Biol Reprod 1999; 61: 1373-1380]，尽管他们的论文讨论部分提及了精细表位鉴定在ZP疫苗研制中的重要性，但受所用表位鉴定方法的限制难以对各反应性15聚肽开展表位最小基序鉴定，最终仅根据兔和狒狒抗血清识别编号54和55的15聚肽之间相互重叠共有序列确定了一个9肽残基表位肽。由于此序列9肽在猪和人ZP中是100%保守的，在兔和小鼠对应ZP蛋白中也是高度保守的，为此论文通讯作者Dunbar BS在美国1998年申请并2002年获得授权的免疫原性肽发明专利(Name: Immunogenic epitopes of thehuman zona pellucida protein (ZPl) ; Patent No. : US 6, 455, 041 BI),涉及权利要求的4 个肽序列是SEQ I (GPLXXXLXI)、SEQ 2 (GPLTLELQI)、SEQ 97 (GPLTVVLQI)和 SEQ 98(GPLRLELRI)。此外，随后也在人ZP4蛋白上使用单抗鉴定出一个保守性12聚表位肽(残基136-147)[Govind CK, Hasegawa A, Koyama K, Gupta SK. Delineation of a conservedB cell epitope on bonnet monkey iMacaca radiata) and human zona pellucidaglycoprotein-B by monoclonal antibodies demonstrating inhibition of sperm—eggbinding Biol Reprod 2000; 62: 67-75]，但同样未对其进行精细表位鉴定(实际此肽段 存在两个套叠表位，见SEQ No. 2和3)。以上研究从一个侧面反映靶蛋白表位扫描作图和最小基序鉴定并非易事的同时，也证实本专利11个人ZP4表位精细鉴定(发明)确是实际应用的需求，能体现创造性。背景四也是最重要的，即在线性抗原表位鉴定方法方面，本专利发明人已建立了专门用于表位鉴定的8/18肽融合蛋白(以下简称8肽或18肽)的原核表达质粒，其具有表达方便经济，特别是插入片段(克隆)外送测序前确定阳性克隆方法简便等优点(Xu WX, etal. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucida protein-4using a peptide biosynthesis strategy. J Reprod Tmmunol 2009; 81:9-16),最重要的是适合用抗重组蛋白抗血清进行表位扫描作图，产生的蛋白印迹ECL显色结果清晰可靠，经得起重复验证(Xu WX, et al. Mapping of minimal motifs of B-cellepitopes on human zona pellucida glycoprotein-3. Clin Dev Tmmunol doi: 10:1155/2012/831010)。换言之，实现用抗重组蛋白多抗鉴定出一靶蛋白上全部或接近全部的表位，乃至每一表位最小基序在方法学上已具备基础。

发明内容
本发明的目的在于提供用兔抗人卵透明带蛋白_4 (ZP4)重组人ZP4N和ZP4C蛋白抗血清鉴定的表位最小基序肽，以及这些表位最小基序肽的扩展短肽(8肽)或长于该短肽(8 肽)的抗原；还提供所述最小基序肽、最小基序肽的扩展短肽(8肽)或长于该短肽(8肽)的抗原的应用。本发明提供的人卵透明带蛋白-4 (huZP4)的最小表位基序肽，用兔抗人卵透明带蛋白-4 (ZP4)重组人ZP4N和ZP4C蛋白抗血清鉴定，共有11个表位，其氨基酸序列分别为SEQ. ID No. I、SEQ. ID No. 2、SEQ. ID No. 3、SEQ. ID No. 4、SEQ. ID No. 5、SEQ. ID No. 6、SEQ. ID No. 7、SEQ. ID No. 8、SEQ. ID No. 9、SEQ. ID No. 10、SEQ. ID No. 11 所示，依次记为
huZP4lQ2-105、huZP4137-H2、huZP4^-U6 ^ 匕泣时旧83、huZP42 , huZPf、huZPf7、
huZP4393-398、huZP4398,、huZP440“10、huZP446CH463。本发明还提供上述最小表位基序肽的扩展短肽，其氨基酸序列分别为SEQ. ID No. 12 SEQ. ID No. 22所示，在化学合成或融合表达8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代。本发明还提供所述的表位最小基序肽在制备人用ZP多表位肽避孕疫苗中的应用。本发明还提供所述的表位最小基序肽的扩展短肽单独扩展短肽单独(与GST188蛋白融合表达)或组合(构建多表位肽)制备作为临床诊断由ZP自身免疫导致妇女不孕病
因的血清识别表位标志物的应用。本发明的内容进一步具体描述如下
1，人ZP4蛋白(曾被命名为ZPB和ZPl)编码基因克隆[Harrist JD，et al. Cloningand characterization of zona pellucida genes and cDNAs from a variety ofmammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families. DNA Seq 1994; 4:361-393; Skinner SM, et al. Mapping of dominant B cell epitopes of a human zonapellucida protein (ZPl) · Biol Reprod 1999; 61: 1373-1380]由美国国立卫生院细胞和发育生物学实验室Jurrien Dean提供(有市售)。可识别重组人ZP4N和ZP4C蛋白的单抗 MA-1671 和 MA-1662 (Bukovsky A, Gupta SK, et al. Production of monoclonalantibodies against recombinant human zona pellucida glycoproteins: utility inimmunolocalization of respective zona proteins in ovarian follicles. J ReprodImmunol 2008; 78: 102-114)，由印度国立免疫学研究所Satish K. Gupta提供(有市售)。用常规PCR方法从人ZP4 cDNA克隆中扩增出编码ZP4成熟蛋白N端大片段(去除N端信号肽的氨基酸残基58-234，简称为人ZP4N58—234)和C端大片段(去除C端跨膜区的残基227-463，简称为ZP4C227—463)的cDNAs，然后分别重组插入pSY621表达质粒[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体PSY621的构建·复旦学报{自然科学版)2000 ；39 (3) : 313 - 317]，分别转化大肠杆菌后进行热诱导表达，在用MA-1662和MA-1671单抗的蛋白印迹鉴定后，纯化表达的重组人ZP4N和ZP4C蛋白，主动免疫并二次加强免疫各3只新西兰白兔，最后获得兔抗重组人ZP4N和ZP4C蛋白抗血清。2，先前发明人已构建了专门用于抗原表位扫描作图的8/18肽生物合成的pXXGST-1 融合表达载体(Xu WX,et al. Minimal motif mapping of a known epitope onhuman zona pellucida protein-4 using a peptide biosynthesis strategy. J ReprodImmunol, 81: 9-16，2009)。因此，在进行二个表达蛋白的表位扫描作图之前，首先分别构建二组分别跨越人ZP4N和ZP4C全长度相互重叠10个残基的49个系列18肽(以GST188蛋白为融合表达载体。具体操作步骤外送合成所设计的系列18肽并含两端BamH I和SalI粘性末端的编码DNA正负链片段；DNA正负链片段配对退火后重组插入表达质粒；转化大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌；挑选重组克隆测序验证插入片段DNA序列；以及热诱导表达目的GST188-18肽融合蛋白)。进而实施两个兔抗血清的第一轮识别18肽的蛋白印迹鉴定，即将含人ZP4N的21个18肽(编号Pl P21)和ZP4C的28个18肽(编号P22 P49)融合蛋白的各诱导菌总蛋白进行SDS-PAGE，继而电转移到硝酸纤维素膜上，最后用抗人ZP4N和ZP4C抗血清完成印迹鉴定。结果抗人ZP4N多抗识别P5、P6、P10-11和P15-16共6个反应性18肽(融合蛋白)，而抗人ZP4N多抗识别P24-P25、P32-34、P39-40、P42-43和P49共9个反应性18肽(图未显示)。3，按前述系列18肽融合蛋白构建表达步骤，进一步表达GST188为载体跨越上述6个ZP4N和9个人ZP4C蛋白各反应性18肽长度相互重叠7个残基的系列8肽融合蛋白(编号P50 P175)，继而实施第二轮抗人ZP4N和ZP4C抗血清识别8肽的精细表位免疫印迹鉴定(步骤同第一轮18肽鉴定)。结果抗ZP4N抗血清识别的最小基序分别依据免疫反应性8肽中共有序列确定为下列5个表位肽HYIM (本申请中表位编号为ZP4-1)、APDTDff(ZP4-2)、WCDSI (ZP4-3)、SIPARDR 和 YYGN (ZP4-4);抗 ZP4N 抗血清识别的最小基序同样依据各反应性8肽共有序列确定为下列7个表位肽RAVYEN、LVAT (ZP4-5)、PLTLELQ (与用抗天然ZP多抗鉴定的精细表位基序相比多I个C端残基Q)、YYGVGDYP (ZP4-6)、TDPLS(ZP4-7)、DNYQTQ (ZP4-8)、QLIPV (ZP4-9)、LDLPF (ZP4-10)和 PDLS (ZP4-11)。上述未实施表位编号的三个表位肽不纳入此次表位鉴定专利申请。ZP4-1 ZP4-11即依次为SEQ.ID No. I SEQ. ID No. 11。以上用抗人ZP4N和ZP4C两种抗血清的人ZP4蛋白上免疫原性表位的最小基序鉴定，为今后设计研制无ZP特异性T细胞表位(导致ZP免疫卵巢功能障碍的关键病因)人用ZP多表位肽疫苗提供了 11个重要候选表位。另外，这些精细表位和/或扩展8/10肽的化学合成肽或与GST188融合表达，也可用作开发诊断妇女ZP自身免疫不孕病因用多表位肽检测抗原的候选表位或表位肽，或单独和/或组合用作诊断ZP自身免疫疾病的表位标志物。


图I.人ZP4N系列18肽融合蛋白表达的SDS-PAGE分析(A)和用兔抗人ZP4N抗血清的免疫印迹鉴定(B)。注印迹膜上泳道1-21代表电泳样品P1-P21融合蛋白。图B中箭头分别指示印迹反应性 18 肽(P5-P6、PlO-Pll 和 P15-P16)。图2.用人ZP4N抗血清的ZP4-1表位系列8肽免疫印迹鉴定(A)和列表共有序列分析(B)。注印迹膜上泳道1-11代表反应性P5-P6的电泳样品P50-P60八肽融合蛋白。图A注箭头分别指示反应性8肽(P53-P57)。图B黄色阴影蛋白指示反应性8肽中共有氨基酸。图3.用人ZP4C抗血清的ZP4-11表位系列8肽免疫印迹鉴定(A)和列表共有序列分析(B)。注印迹膜上泳道1-13代表反应性P49的电泳样品P163-P175八肽融合蛋白。(A)注箭头分别指示反应性8肽(P170-P174)。(B)黄色阴影蛋白指示反应性8肽中共有氨基酸。
具体实施例方式本发明可进一步通过下列实例描述。列举实例并不意味限制本发明所涉及的范围，该范围在之前的描述中已被充分陈述阐明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件以及[美]J.萨姆布鲁克和D.W.拉塞尔编著黄培堂等翻译的第三版“分、子克隆实验室手册”(科学出版社，2002)和[美]E.哈洛和D.莱恩编著沈关心等翻译的“抗体技术实验指南”(科学出版社，2002)中所述的步骤，或按照生产销售商建议的条件进行。实施例I :用兔抗人ZP4N抗血清的ZP4-1表位的最小基序鉴定 材料和方法
I.人ZP4基因克隆由美国国立卫生院细胞和发育生物学实验室Jurrien Dean提供。热诱导表达质粒PSY621和pXXGST-1由本专利申请发明人构建[沈芸，应康，徐万祥，谢毅大肠杆菌高效表达载体PSY621的构建 复旦学报{自然科学版)2000 ；39(3) :313-317；Xu WXj et al. Minimal motif mapping of a known epitope on human zona pellucidaprotein-4 using a peptide biosynthesis strategy. J Reprod Immunol 2009;81:9-16]。大肠杆菌BL21 (DE3)菌株由复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏。2.鼠抗 huZP4 单抗 MA-1662 和 MA-1671 由发明人制备(Bukovsky A, Gupta SK, et al. Production of monoclonal antibodies against recombinant human zonapellucida glycoproteins: utility in immunolocalization of respective zonaproteins in ovarian follicles. J Reprod Immunol 2008; 78: 102-114)。3.限制性内切酶EcoR I,BamH I,Sal I、Taq酶和T4 DNA连接酶购自日本TaKaRaBiotechnology公司，预染蛋白分子量标准、辣根过氧化酶标记的羊抗鼠二抗(IgG /HRP)、二氨基联苯胺(DAB)和0.2 Mffl硝酸纤维素膜购自上海生工生物技术服务公司。免疫印迹化学发光ECL检测试剂盒购自GE公司。QIAprep spin miniprep Kit质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR产物纯化试剂盒和quick凝胶回收试剂盒购自德国QIAGEN公司。4.新西兰白兔购自上海BK实验动物有限公司。5.两端分别为BamH I和Sal I粘性末端，中间为各8_18肽编码DNA序列加TAA终止密码子的正负链DNA片段由上海捷瑞生物工程有限公司合成。6.系列8/18肽编码DNA序列依据人ZP4蛋白编码基因和蛋白质氨基酸序列公开信息(Harris JD, et al. Cloning and characterization of zona pellucida genes andcDNAs from a variety of mammalian species: the ZPA, ZPB and ZPC gene families.DNA Seq 1994; 4: 361-393)。制备过程摘要如下从huZP4基因克隆质粒中通过PCR扩增出去除信号肽和跨膜区的两端为EcoR I和Sal I限制酶位点的人ZP4N(氨基酸残基58-234)和ZP4C(残基227-463)两个编码基因片段；双酶切后重组插入pSY621热诱导质粒，重组质粒经DNA测序验证后转化大肠杆菌宿主菌；最后热诱导8/18肽融合蛋白工程菌，收集细菌总蛋白储存于_20°C冰箱备用。7.诱导表达并用MA-1662和MA-1671单抗鉴定人ZP4N和ZP4C蛋白；用纯化的重组人ZP4N和ZP4C蛋白分别免疫新西兰白兔，加强免疫二次后抽取血清，冷冻储存于_20°C冰箱，直至用于第一轮人ZP4蛋白的系列18肽扫描作图和第二轮各反应性18肽的系列8肽精细表位鉴定。用兔抗重组人ZP4N抗血清完成精细ZP4-1表位鉴定的具体步骤如下
I.依据人ZP4基因序列公开信息，PCR扩增出人ZP4N和ZP4C两个大片段蛋白编码基因，重组插入PSY621热诱导原核表达质粒，诱导表达后进行SDS-PAGE分析和用MA-1662和MA-1671单抗完成免疫印迹鉴定，确定两个单抗可分别识别人ZP4N和ZP4C区段；2.设计跨越可被兔抗重组ZP4N蛋白抗血清识别的人ZP4N全长度序列相互重叠10个氨基酸残基的系列18肽(编号P1-P21)编码DNA正负链片段(正链5’-端加5’-gatcc，3’-端加taag-3’ ;负链5’ -端加5，_tcgactta,3，-端加g_3’),外送DNA化学合成；
3.将I或2个OD的互补正负链片段用ddH20溶解成20u mol/U I储存液(根据DNA合成报告单数据)；各取10 U I储存液和20 ddH20于I. 5 ml Eppendorf管中，94°C水浴加热5 min,自然降至室温后,在15 y I反应体积中吸入2 y I退火片段、I y I约200 ng/y I经BamH I和Sal I双酶切的pXXGST-1质粒、I u I T4 DNA连接酶和其I. 5 缓冲液，连接过夜；连接液转化感受态BL21 (DE3)宿主菌，涂布含Amp的LB平板上，于37 °C培养过夜；第二天挑取氨苄LB平板上长出的单克隆转接3 ml LB培养液诱导表达，以由pXXGST_2表达的GST188蛋白为对照，经15% SDS-PAGE分析确认各表达的GST188-18肽(P1-P21)融合蛋白(与对照蛋白电泳迁移率相差约2个kDa)，挑取各重组克隆外送进行DNA测序验证；
4.将插入片段测序结果正确的克隆接种加入Amp的3ml LB培养液中，于30°C振荡 培养过夜，翌日晨按1/50比例转接新鲜含Amp的LB培养液中，30°C振荡培养2 3 h至菌体浓度达到OD值0.6 0.8后，调高温度至42°C热诱导4 h，离心收集菌体，加上样裂解液煮沸5 min备用；
5.将诱导的细菌总蛋白样品同时走15%SDS-PAGE,电泳结束后，一块凝胶用考马斯亮蓝染色(图1A)，二块凝胶进行硝酸纤维素膜电转移(100 mA)2 h，用丽春红染色转印迹膜2 min，在目的短肽融合蛋白条带处用针头打孔标记，用水冲洗掉丽春红染色；
6.印迹膜用PBS缓冲液反复洗涤四次，用5%脱脂奶粉封闭过夜，PBS缓冲液洗涤四次，分别在8 10 ml反应液中加入Iyl—抗兔抗人ZP4N抗血清，室温反应2 h，PBS缓冲液洗涤后加入5 u I 二抗羊抗兔IgG /HRP (I: 2000稀释)，室温反应I h，用PBS缓冲液洗涤后进行ECL化学发光显色，依据免疫印迹结果确认P5-P6、PlO-Pll和P15-P16为反应性18肽融合蛋白(图IB)；
7.设计覆盖可被抗人ZP4N抗血清识别的P5和P6两个18肽残基序列总长度相互重叠7个氨基酸残基的系列8肽(11个，编号P50-P60)编码DNA正负链片段(正链5’ -端加5，-gatcc, 3，-端加 taag-3’ ；负链 5，-端加 5，-tcgactta, 3，-端加 g_3，),外送 DNA 化学合成；
8.如前述3-5操作步骤，完成11个系列8肽融合蛋白的构建表达及其表位最小基序免疫印迹鉴定，确认被兔抗人ZP4N抗血清识别的P53-P57共五个反应性8肽(图2A)；
9.依据上述五个反应性8肽中黄色阴影指示的共有氨基酸残基数(图2B)，最终确定兔抗人ZP4N抗血清识别的编号ZP4-1表位的最小基序为HYIM，其四肽残基序列位于18肽P5和P6的10个残基重叠区内。另外，其余10个表位及其最小基序的鉴定以人ZP4蛋白C端的ZP4-11表位为例，简述如下采用上述2-9同样的步骤和方法，首先设计跨越可被兔抗人ZP4C抗血清识别的ZP4C全长度序列相互重叠10个氨基酸残基的系列18肽(编号P22-P49)编码DNA正负链片段，重组表达系列18肽融合蛋白；用兔抗人ZP4C抗血清进行第一轮反应性18肽扫描作图鉴定；继而构建表达覆盖P49反应性18肽序列相互重叠7个残基的系列8肽(P163-P175，包括了以残基A替代的8聚肽，见图3)融合蛋白，进行第二轮精细表位鉴定(图3A)，最终依据兔抗人ZP4C抗血清识别P170-P174五个短肽中的共有残基(图3B)，确定ZP4-11表位的最小基序为F1DLS。尽管本发明描述了人卵透明带蛋白-4可被兔抗人ZP4N或ZP4C抗血清识别的11个线性抗原表位最小基序和它们扩展的8/10肽，它们既可以单独和/或组合用作研制安全、有效且可逆的人用ZP重组多表位疫苗候选表位，也能通过化学合成或融合表达或单独或组合用作由ZP自身免疫导致妇女不孕病因诊断的候选表位抗原或表位标志物(检测患者血清多个或单一人ZP抗体)，但有一点对于相关领域研究技术人员来说是显而易见的，SP在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明的最小表位肽和其扩展的8肽或8肽 融合蛋白作各种变化改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种人卵透明带蛋白-4的最小表位基序肽，其特征在于氨基酸序列为SEQ. IDNo. I所示,记为huZP4102-105;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 2所示,记为huZP4137-142;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 3所示，记为huZP4142_146;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 4所示，记为huZP418°-183;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 5所示，记为huZP4259_262;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 6所示，记为huZP433°7;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 7所示，记为huZP43737;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 8所示，记为huZP4393_398;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 9所示，记为huZP4398_4°2;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 10所示，记为huZP44°6_41°;或者氨基酸序列为SEQ. ID No. 11所示，记为huZP446帽。
2.一种含如权利要求I所述的最小表位基序肽的扩展短肽，其特征在于具有SEQ. IDNo. 12 SEQ. ID No. 22所示氨基酸序列，在化学合成或融合表达8肽融合蛋白的场合，扩展的残基部分可增删或用其他残基替代。
3.如权利要求I所述的表位最小基序肽在制备人用ZP多表位肽避孕疫苗中的应用。
4.如权利要求2所述的表位最小基序肽的扩展短肽单独或组合制备作为临床诊断由ZP自身免疫导致妇女不孕病因的血清识别表位标志物的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药与生物检测技术领域，具体为一种人卵透明带蛋白-4上能被兔抗重组人ZP4N和ZP4C蛋白抗血清识别的线性抗原表位最小基序肽及其扩展8肽和应用。本发明提供的11个线性抗原表位最小基序肽可用作研制人类免疫生育调控重组多表位肽疫苗原的候选表位肽，其氨基酸序列为SEQ.IDNo.1--SEQ.IDNo.11所示，依次记为huZP4102-105、huZP4137-142、huZP4142-146、huZP4180-183、huZP4259-262、huZP4330-337、huZP4373-377、huZP4393-398、huZP4398-402、huZP4406-410、huZP4460-463。还提供用作研制诊断ZP自身免疫不育妇女血清ZP抗体的新型高特异性高灵敏度重组多表位肽检测抗原的候选表位，其氨基酸序列为SEQIDNo.12~SEQIDNo.22所示。
文档编号A61K39/00GK102659925SQ201210161060
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月23日 优先权日2012年5月23日
发明者唐海平, 季朝能, 徐万祥, 王健, 谢毅, 赛提旭·古普塔, 顾少华 申请人:上海市计划生育科学研究所, 复旦大学