一种双基因表达质粒及其用途的制作方法

专利名称：一种双基因表达质粒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种同时独立表达两种外源目的基因的双基因表 达质粒及其用途。
背景技术：
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细 胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌 等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中，质粒常被用做基因的载体，其有多种类 型表达质粒、克隆质粒、穿梭质粒和整合质粒等。人工构建的质粒可以集多种有用的特征 于一体，如含多种单一酶切位点、具有抗生素耐药性等，常被用于基因工程。用基因工程的方法使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称“工程菌”，已 被用于各个方面，如药品生产、污染物降解等。许多情况下，“工程菌”是采用质粒作为外源 基因的载体，当表达外源基因时，根据外源基因上游的不同启动子，需要添加不同的诱导剂 进行诱导表达，如IPTG、半乳糖、阿拉伯糖等。为了满足多功能工程菌的研究需要，Novagen公司开发了 pETDuet和pACYCDuet双 基因表达载体，二者可以在同一大肠埃希氏菌中同时表达两种目的蛋白，也可以共转化，联 合用于复杂蛋白复合物的表达。该系列的质粒采用T7启动子控制外源蛋白表达，在外源蛋 白表达时都需要诱导剂的添加，这增加了工程菌的使用成本和操作步骤，是其应用上的不 足，而且有些诱导剂本身就具有一定的毒性，如IPTG。而在原核表达质粒构建中，尚未见到 利用其他启动子构建的双基因表达质粒。目前，有机磷农药的降解方法主要有光化学降解、化学降解和微生物降解三种形 式。传统的物理和化学方法降解有机磷农药虽然效果不错，但成本太高且容易造成二次污 染，因此只能作为一种辅助手段加以利用。随着生物技术的不断发展，人们对有机磷农药的 降解进行了探索，充分肯定了微生物在降解中的重要作用。微生物具有种类多，变异快和易 于操纵的特点，至今已分离了许多有机磷农药的降解菌，其中一些微生物的有机磷降解酶 的生化性质已得到鉴定，少数有机磷农药降解基因已得到分离、鉴定和改造。用微生物或无 细胞酶制品来消减农药污染的生物修复技术显出广阔的应用前景(邱道骥等，环境中有机 磷农药降解方法的研究进展，化工时刊，2006，20(3) :64-67)。通过重组DNA技术构建具有 农药降解能力的基因工程微生物，即遗传工程微生物(GEMs)是有效去除这些污染的新途 径，目前已经有利用基因工程菌株来降解有机磷农药的研究，但是已构建的基因工程菌株 需要添加诱导剂，增加了有机磷农药降解应用中的使用成本和操作步骤。

发明内容
本发明的目的在于，提供一种能同时独立表达两种外源目的基因的双基因表达质 粒。本发明的另一个目的在于，提供上述双基因表达质粒的用途。
本发明的目的是采用以下技术方案来实现的。一方面，本发明提供了 一种双基因 表达质粒，其能同时表达出两种外源基因，该表达质粒包括两组启动子，分别控制位于 其下游的两种外源基因的表达；优选地，所述是来源于λ噬菌体的受控于温度敏感阻 抑物Clts857的热启动子。优选地，所述质粒还包括抗性基因、复制子及多个酶切位点；更优选地，所述抗性 基因选自氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因，最优选为氨苄 青霉素抗性基因；所述复制子选自PMBl复制子、CoEl复制子、pSClOl复制子和pl5A复制 子，最优选为PMBl复制子；所述酶切位点选自EcoR I.BamH I和Pst I。优选地，在所述外源基因中，至少包括一种报告基因，选自荧光蛋白类基因、β-半 乳糖苷酶基因和荧光素酶基因，更优选选自荧光蛋白类基因，最优选为红色荧光蛋白基因。优选地，其中所述外源基因分别为编码红色荧光蛋白的基因和编码有机磷水解酶 的基因。优选地，所述双基因表达质粒具有图IB所示的质粒图谱。优选地，所述双基因表达质粒具有如SEQ. ID. NO. 1所示的碱基序列。另一方面，本发明提供一种包含上述双基因表达质粒的菌株；优选地，所述菌株为 为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)EC-DGEP-LMT001，于2009年1月19日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路中国科学院 微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC2881。本发明还提供由包含上述双基因表达质粒的菌 株制备的细胞液体培养物和/或全细胞蛋白液。又一方面，本发明提供了上述原核双基因表达质粒在转化不表达温度敏感阻抑物 的菌株中的用途；优选地，所述菌株选自大肠埃希氏菌和假单胞杆菌，更优选为大肠埃希氏 菌。综上所述，本发明提供了一种人工构建的利用λ噬菌体的受控于温度敏感阻抑 物(clts857)的热启动子来控制外源基因表达的双基因表达质粒，可同时表达两种目的外 源蛋白。选择不表达温度敏感阻抑物(clts857)的菌株作为宿主菌，则不需要任何诱导作 用就可以直接表达目的蛋白。在本发明的一个优选实施方案中，该pL-DsRed-pL-OPH质粒上的启动子PkPl序列 (其序列如SEQ. ID. NO 2和SEQ. ID. NO 3所示)、氨苄青霉素抗性基因(其序列如SEQ. ID. NO 6所示)、ρΜΒ1复制子序列(其序列如SEQ. ID. NO 7所示)、rrnBTlT2终止子序列(其序列 如SEQ. ID. N05所示)来源于质粒pBV220,红色荧光蛋白DsRed基因序列(其序列如SEQ. ID. NO 4所示)来源于质粒pDsRed-Nl，有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase, 0ΡΗ) 基因序列opd (其序列如SEQ. ID. NO 8所示)来自质粒pGEM_T Easy-opd。各段序列通过 PCR、酶切等分子生物学手段克隆连接成质粒pL-DsRed-pL-OPH(其碱基序列如SEQ. ID. NOl 所示)。在本发明提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH中，带有一个氨苄青霉素抗性 基因序列提供氨苄青霉素筛选标记，一个PMBl复制子序列用以维持质粒DNA的自主复制， 两组启动子序列用于控制下游目的基因的表达，DsRed基因序列含有目的蛋白红色荧 光蛋白DsRed的编码序列，opd基因序列编码目的蛋白有机磷水解酶(organophosphorus hydrolase, ΟΡΗ)，两个目的蛋白的基因分别位于两组启动子PkPl序列下游。
由此可见，本发明涉及一种质粒载体，其具有两组来源于λ噬菌体的受控于温度 敏感阻抑物(clts857)并控制目的基因表达的热启动子序列P1^以及原核生物的高拷贝复 制子PMB1，该质粒含有两个独立的基因表达单位，可分别插入两种目的基因。将该质粒导 入不表达温度敏感阻抑物(clts857)的大肠埃希氏菌中，该质粒所携带的两个目的基因就 可以进行非诱导性表达，不需添加任何诱导剂。该质粒还可以与其他具有相容性复制子，如 PSClOl和pl5A等复制子的质粒进行共转从而进行多基因表达。表达外源蛋白的质粒能够延缓宿主细胞的生长，大量的证据表明，高拷贝数的质 粒和大量的重组蛋白可严重妨碍转化细胞的生长甚至生存。因此，目前在进行外源蛋白表 达时，几乎所有表达质粒都需要添加诱导剂来调控外源蛋白的表达，通常都是选取在宿主 菌的对数增长期添加诱导剂诱导外源蛋白表达。而本发明首次利用来源于λ噬菌体的热 启动子构建了双基因表达质粒，利用该质粒模式可以同时独立表达两种外源目的基因，选 择合适的表达菌株则可以避免诱导剂的使用，开阔了以质粒为载体用于生物工程菌构建的 应用前景。本发明利用此双基因表达质粒构建了带有红色荧光蛋白基因和有机磷水解酶基 因的生物工程菌，该工程菌能不经药物诱导表达有机磷水解酶和红色荧光蛋白，前者可用 于对环境中有机磷类化学农药的降解，后者则用于生物工程菌释放到环境以后的追踪与检 测，增强了生物工程菌使用的环境安全性。包含本发明提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH的菌株为大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)EC-DGEP-LMT001，于2009年1月19日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心(CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)， 其保藏号 CGMCCNo. 2881。


以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中图IA为本发明所提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH的质粒构建图；图IB为本发明所提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH的质粒图谱；图2为本发明所提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH转化E. coliBL21AI 菌 株克隆在荧光显微镜下观察的图片(放大倍数IOx4)，其中A为转化菌株，B为未转化菌株；图3为本发明所提供的双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH转化E. coliBL21AI 菌 株克隆在日光下的直接观察图片，其中A为转化菌株，B为未转化菌株；图4为本发明egfp基因片段的PCR扩增片段电泳图；图5为本发明pGEM-T-EGFP载体的酶切鉴定电泳图，其中酶切位点为EcoR I+BamH I ；图6为本发明pBV-EGFP载体的PCR鉴定电泳图，其中1为egfp基因片段/ pBV-EGFP, 2 为 egfp 基因片段 /pEGFP_N3 ；图7为本发明pL-EGFP的PCR扩增片段电泳图；图8为本发明pL-EGFP载体的酶切鉴定电泳图，其中1为酶切位点EcoR I+BamH I，2为酶切位点EcoR I ；图9为本发明dsred的PCR扩增片段电泳图；图10为本发明pGEM-T-DsRed载体的酶切鉴定电泳图，其中酶切位点为EcoRI+BamH I ；图11为本发明pL-DsRed载体的PCR验证电泳图，其中1为dsred片段/ pDsRed-Nl,2 为 dsred 片段 /pL-DsRed ；图12为本发明pL-DsRed载体的酶切鉴定电泳图，其中1为酶切位点EcoR I+BamH I，2为酶切位点EcoR I ；图13为本发明opd的PCR扩增电泳图；图14为本发明pGEM-T-OPH载体的酶切鉴定电泳图，其中酶切位点为Hindi 11+Xho I ；图15为本发明pL-OPH载体的PCR验证电泳图，其中1为opd基因片段/ pGEM-T-opd, 2 为 opd 基因片段 /pL-OPH ；图16为本发明pL-OPH载体的酶切鉴定电泳图，其中1为酶切位点BamH 1，2为酶 切位点 Pst I+BamH I ；图17为本发明pL-DsRed片段的PCR扩增电泳图；图18为本发明Promoter-OPH-terminator片段的PCR扩增电泳图；图19为本发明pL-DsRed-pL-ΟΡΗ载体的PCR验证电泳图，其中1为dsred和 opd 基因片段 /pL-DsRed-pL-0PH, 2 为 opd 基因片段 /pGEM-T-opd，3 为 dsred 基因片段 / pDsRed-Nl ；图20为本发明pL-DsRed-pL-OPH载体的酶切鉴定电泳图，其中1为酶切位点Nco I，2为酶切位点Sac I ；图21为本发明中对硝基苯酚的标准曲线。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明，而不用于限定本发明的范围。以下实施例中所使用的技术，包括PCR、酶切等分子生物学手段，以及菌株培养、转 化、检测技术等，除非特别说明，均为本领域的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设 备、试剂、菌株等，除非是本说明书特别说明，均为本领域的研究和技术人员可以通过公共 途径获得的。以下各实施例中所涉及的具体实验操作方法在此说明如下1、50 μ LPCR扩增体系的配制如下总体积50 μ L，含0. 1 IOng质粒，1 XPCR缓冲液(含Mg2+)，上下游引物各 0. 8 μ mol/L, 0. 2mmol/LdNTP, 2. 5UDNA 聚合酶。2、琼脂糖凝胶电泳，具体方法参照《分子克隆》(第三版)Sambr00kJ，Russell Dff(2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York，采用TAE电泳缓冲液，溴化乙锭染色标记，溴酚蓝为 指示剂。3、DNA凝胶纯化回收采用DNA凝胶纯化回收试剂盒(购自北京鼎国生物技术有限 公司)，具体操作如下1)将无石蜡油的PCR反应液或酶切反应液在的普通琼脂糖凝胶上电泳，切下所需的DNA条带装入1. 5mL离心管中，加入溶液A (胶重/溶液体积=1/3)。2) 50°C保温10分钟，每2分钟颠倒混勻1次，使琼脂糖凝胶完全融化。待溶化后 置室温加入15 μ L溶液B，充分混勻。3)将混和液转移入离心柱，静置2分钟，12000r/分钟离心30秒，倒掉收集管中的废液。4)加入500 μ L溶液C于离心柱中，12000r/分钟离心30秒，倒掉收集管中的废液。5)重复步骤4) 一次。6) 12000r/分钟离心1分钟，甩干剩余液体以除去残余酒精。7)将离心纯化柱套入干净的1. 5mL离心管中，开盖放置5 10分钟，使乙醇充分 挥发干净。8)加入20 30 μ L溶液D (或灭菌去离子水)，静置2分钟后，12000r/分钟离心 30秒。离心管中的液体即是纯化的DNA片段，取4μ L电泳(0. 8%琼脂糖，120V, 10分钟) 检测并目测定量。-20°C保存备用。4、T/A克隆方法如下PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒回收后，进行加A反应，10 μ L体系中含6 μ LPCR 回收片段，1\ 0 缓冲液，0.8讓01/1 dNTP，0.5U TaqDNA聚合酶，在PCR仪上72°C运行20 分钟，然后直接取反应液与T载体进行连接。连接体系10 μ L，包括5 μ L2 X缓冲液，IuL T 载体DNA(SOng)JyL加A片段，IyL T4DNA连接酶，4°C连接过夜。取5μ L连接产物加入 到100 μ L感受态细菌TOP 10中，冰浴30分钟，42°C热击90秒，立即冰上放置3分钟，加入 950 μ L液体LB培养基，37°C振荡培养Ih后，5000g离心1分钟，弃上面培养液，保留150 μ L 培养液悬浮菌体，均勻涂布在含IPTG/X- β -gal/氨苄青霉素的LB平板上，倒置平板于37°C 培养16 20小时后，将平板于4°C放置1 2小时，使蓝色显现清楚，挑取白色菌落摇菌鉴 定。5、大肠埃希氏菌感受态细胞的制备(氯化钙法)及转化方法参照《分子克隆》(第 H Hjx ) Sambrook J, Russell Dff (2001)Molecular cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, New York,具体操作如下1)从37°C培养16 20小时的新鲜平板中挑取一个单菌落(直径2 3mm)，转到 含有IOOmL LB培养基的IL烧瓶中。于37°C剧烈振摇培养约3小时。为得到有效转化，活 细胞数不应超过IO8个/mL，可每隔20 30分钟测量0D600值来监测培养物的生长情况， 待菌液0D600达到0. 35时开始收获细菌培养物。2)在无菌条件下将细菌转移到用冰预冷的50mL无菌聚丙烯管中，在冰上放置10 分钟，使培养物冷却至0°c。3)于40Cffl Sorval 1GS3转头(或与其相当的转头)以4100r/分钟离心10分钟， 以回收细胞。4)倒出培养液，将管倒置1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。5)每50mL初始培养物用30mL预冷的0. lmol/L CaCl2-MgCl2溶液重悬。6)于4°C以4100r/分钟离心10分钟，回收细胞。7)倒出上清，将管倒置1分钟以使最后残留的液体流尽。8)每50mL初始培养物用2mL预冷的0. lmol/LCaCl2悬浮。
9)用冷却的无菌吸头从感受态细胞悬液中取200 μ L转移到无菌微量离心管中， 加入DNA(体积小于10μ L，DNA含量小于50ng)，轻轻旋转以混勻内容物，在冰中放置30分钟。10)将管放到预加温到42°C的循环水浴中放置90秒(其间不要摇动)。11)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1 2分钟。12)向管中加入800 μ L LB培养基，然后将管转移到37°C摇床上温和摇动(转速 不超过225r/分钟)，温育45分钟使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。13)离心浓缩细胞，然后用适量LB轻轻重悬细胞，将适当体积(每个90mm平板可 达200 μ L)已转化的感受态细胞转移到含相应抗生素的LB琼脂培养基上。14)将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于37°C培养，12 16小时后可 出现菌落。6、质粒的小量提取(SDS碱裂解法)方法参照《分子克隆》(第三版)Sambrook J, Russell Dff(2001)Molecular cloning :A LaboratoryManual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork,具体操作如下1)挑转化后的单克隆菌落于3mL含抗生素的LB培养基(50 μ g/L抗生素)中于 37°C剧烈振摇培养过夜。2)将1. 5mL培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4°C以12000g离心30秒，
弃上清，使细菌沉淀尽可能干燥。3)将所得细菌沉淀重悬于100 μ L预冷的溶液I (溶液成分为25mmol/ LTris-HCl (pH8. 0)，10mmol/L EDTA，50mmol/L葡萄糖)中，剧烈振荡，使细菌沉淀在溶液I
中完全分散。4)加200 μ L新配制的溶液II (溶液成分为:200mmol/L NaOH, 1 % SDS)，盖紧管 口，快速颠倒离心管5次，将离心管放置于冰上。5)力Π 150 μ L预冷的溶液III (溶液成分为3mol/L醋酸钾(KAc)缓冲液，pH 4.8)， 盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均勻，之后 将管置于冰上3 5分钟。6)用微量离心机于4°C，12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。7)加入2倍体积的无水乙醇，振荡混合，于-20°C放置30分钟。用微量离心机于 4°C以12000g离心10分钟。8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管 壁的液滴除尽。9)用ImL 70%乙醇洗涤沉淀，按步骤8)所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀 干燥8分钟。10)加入40 μ L含20 μ g/mL RNaseA的灭菌去离子水溶解沉淀，37°C保温30分钟 后放入_20°C保存备用。7、酶切反应单酶切反应体系总体积20 μ L，质粒或DNA片段约500ng，内切酶1 μ L，10Χ缓冲 液2 μ L，用灭菌去离子水补足体积至20 μ L0 37°C保温4小时，取5 μ L酶切产物进行电泳 鉴定，继续酶切反应直至酶切完全。
双酶切反应体系总体积20yL，质粒或DNA片段约500 μ g，两种内切酶各 0.8yL,10X缓冲液2 μ L，用灭菌去离子水补足体积至20 μ L。37°C保温4h，取5 μ L酶切 产物进行电泳鉴定，继续酶切反应直至酶切完全。
实施例1 载体pL-EGFP的构建本实施例为载体pL-EGFP的构建，包括先进行EGFP基因片段的PCR扩增及克隆、 然后构建出载体pBV-EGFP，扩增出其中的pL-EGFP片段后，最终构建出载体pL_EGFP，具体 的操作步骤详述如下(1) EGFP基因片段的PCR扩增及T/A克隆①egfp基因片段的PCR扩增以pEGFP_N3 (Clotech公司)为模板，扩增egfp基因 片段，717bp。采用pfuDNA聚合酶(Promega公司)，扩增体系50 μ L，上游引物序列为5，_G GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT (EcoR I)，下游引物序列为 5，-TTGGATCCCTTGTACAGCTC GTCCATGCCGAG(BamH I)，PCR 扩增参数设置为94°C预变性 3 分钟；94°C，30 秒 /68°C 80 秒 (25个循环)；72°C 10分钟。扩增片段的进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示；②egfp基因片段的纯化回收采用琼脂糖凝胶电泳纯化并回收egfp基因片段；③构建质粒pGEM-T-EGFP 将回收的egfp基因片段进行加A反应后，与 pGEM-TEasy载体(Promega公司)连接构建质粒pGEM_T_EGFP (加A反应及连接的具体操作 见Promega公司的使用说明书)；④酶切鉴定采用EcoR I和BamH I双酶切质粒pGEM_T_EGFP可以得到egfp片 段，酶切鉴定电泳结果如图5所示。(2)载体 pBV-EGFP 的构建①酶切处理质粒pBV 220 (中国预防医学科学院病毒研究所)和pGEM_T_EGFP的 纯化产物分别经EcoR I和BamH I双酶切处理，凝胶电泳回收纯化目的条带；②构建质粒pBV-EGFP:连接体系25 μ L，包括2. 5 μ LlOX T4 DNA连接酶缓冲液， IOOng酶切pBV 220载体后的回收片段，IOOng酶切pGEM-T-EGFP后的回收片段，IyL T4 DNA连接酶，16°C连接20小时。③转化质粒PBV-EGFP 用连接产物转化E. coli DH 5 α (购自北京天根公司)，涂 布在含氨苄青霉素(50yg/mL，下同)的LB琼脂板上，37°C过夜培养。挑单克隆菌落于含氨 苄青霉素的液体LB中(体积5mL，下同)，在37°C下200 250r/分钟过夜培养。④鉴定取1. 5mL菌液进行质粒小量提取，25倍稀释原质粒作为PCR模板，通 过PCR验证可以扩增出egfp基因片段，电泳结果如图6所示，其中1为pBV-EGFP，2为 PEGFP-N3。电泳结果证明所得质粒为目的质粒pBVEGFP。(3)载体 pL-EGFP 的构建①pL-EGFP片段的PCR扩增以pBV-EGFP为模板，采用PCR扩增pL-EGFP片段， 3624bp。采用pfuDNA聚合酶，扩增体系50 μ L，上游引物序列为5' -TTCGAGCTCCGTGCGTGTT GACTATTTTACCT (Sac I)，下游引物序列为 5，-GCTCTAGATCGGCAAGGTGTTCTGGTC(Xba I)，PCR 扩增参数设置为94°C预变性3分钟；94°C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分钟10秒(25个循 环)；72°C，10分钟。扩增片段的电泳结果如图7所示；②pL-EGFP片段的纯化回收利用 DNA凝胶回收试剂盒回收纯化PCR扩增的pL-EGFP片段；③pL-EGFP片段的磷酸化，连接及转化
1)磷酸化利用T4多核苷酸激酶(购自大连宝生物工程公司)磷酸化PCR产物 pL-EGFP片段末端，按如下体系配置反应管PCR产物片段约25pmol/L，5yL10XT4多核 苷酸激酶缓冲液，1 μ L 10mmol/LATP, 1 μ LT4多核苷酸激酶，用灭菌去离子水补充体积至 50 μ L0 37°C，反应30分钟。然后65°C，20分钟灭活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次；2)连接进行自身环化连接，体系如下磷酸化的PCR产物lOOng，1 μ L10XT4DNA 连接酶缓冲液，0. 5 μ L Τ4 DNA连接酶(购自大连宝生物工程公司)，1. 5 μ L30% PEG8000, 用水补足体积至10 μ L0 16°C，反应20小时；3)转化及鉴定取8 μ L连接产物转化Ε. coli DH5 α，涂布在含氨苄青霉素的LB 琼脂板，28°C过夜培养。挑取单克隆入含氨苄青霉素的液体LB培养基中，于28°C过夜培 养。次日，取菌液ImL离心沉淀菌体，菌体颜色呈现明显绿色的即为所要克隆的菌体，提取 质粒，并用EcoR I和BamH I进行酶切鉴定，所得条带大小与预期一致，电泳结果如图8所 示，其中1为酶切位点EcoR I+BamH I，2为酶切位点EcoR I，说明pL_EGFP质粒构建成功。实施例2 双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH的构建本实施例为双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH的构建，包括先分别构建并扩增出 质粒pL-DsRed和质粒pL-OPH后，连接构建出双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH，其质粒构 建图如图IA所示，相应的质粒图谱如图IB所示，具体的操作步骤详述如下(1)质粒 PL-DsRed 的构建①DsRed基因片段的PCR扩增及T/A克隆以pDsRed-Nl (购自Clontech公司) 为模板，扩增DsRed基因片段，其碱基序列如SEQ. ID. N04所示，690bp。采用pfuDNA聚合酶， 扩增体系50 μ L，PCR扩增参数设置为94°C预变性3分钟-MV，30秒/57°C，30秒/72°C， 90秒(25个循环)；72°C，10分钟。扩增片段的电泳结果，如图9所示；上游引物序列为5’ -GGAATTCATGGTGCGCTCCTCCAAGA (EcoR I)，下游引物序列为 5’-CGGGATCCCTCATTACTACAGGAA CAGGTGGTGGC(BamH I)；②DsRed基因片段的纯化回收电泳纯化回收PCR电泳扩增的DsRed基因片段；③质粒pGEM-T-DsRed的构建进行加A反应后与pGEM_TEasy载体连接构建质粒 pGEM-T-DsRed；④酶切鉴定利用EcoR I和BamH I双酶切构建的质粒pGEM-T-DsRed，酶切鉴定 电泳结果如图10所示。⑤质粒PL-DsRed的构建1)酶切处理采用EcoR I和BamH I双酶切处理pGEM-T-DsRed和pL_EGFP ；2)纯化回收凝胶电泳纯化回收目的条带；3)构建pL-DsRed载体进行连接；4)验证利用PCR扩增DsRed基因进行验证，电泳结果如图11所示，其中1为 pDsRed-Nl，2为pL-DsRed ；同时利用EcoR I和BamH I进行双酶切鉴定，可见双酶切可切出 DsRed基因片段(690bp)，EcoR I单酶切所得线性化条带也与预期一致(3615bp)，电泳结果 如图12所示，其中1为酶切位点EcoR I+BamH I，2为酶切位点EcoR I。(2)质粒pL-OPH的构建①OPH基因片段的PCR扩增及T/A克隆以质粒pGEM-T-opd (中科院动物研究所) 为模板扩增OPH的基因opd，其碱基序列如SEQ. ID. NO 8所示，1098bp。采用pfuDNA聚合酶，扩增体系50 u L，PCR扩增参数设置为94°C预变性3分钟；94°C，30秒/57°C，35秒/72°C， 2分钟(25个循环)；72°C，10分钟。扩增片段的电泳结果如图13所示；②opd基因片段的纯化回收电泳纯化回收PCR电泳扩增的opd基因片段；③质粒pGEM-T-OPH的构建进行加A反应后与pGEM-TEasy载体连接构建质粒 pGEM-T-OPH ；④酶切鉴定利用BamH I和Pst I双酶切构建的质粒pGEM-T-OPH，酶切鉴定电泳 结果如图14所示。⑤质粒pL-0PH的构建1)酶切处理采用BamH I和Pst I双酶切处理pGEM-T-OPH和载体pBV 220 ；2)纯化回收凝胶电泳纯化回收目的条带opd ；3)构建pBV-OPH载体进行连接；4)构建pL-0PH载体用EcoR I和Pst I双酶切处理pBV-OPH切出opd基因，与 用EcoR I和Pst I双酶切的载体pL-EGFP进行连接构建pL_0PH载体；5)验证利用PCR扩增opd基因进行验证，电泳结果如图15所示，其中1为 pGEM-T-opd，2为pL-0PH ；同时利用EcoR I和Pst I进行双酶切鉴定，电泳结果如图16所 示，其中1为酶切位点BamH I，2为酶切位点Pst I+BamH I。(3)双基因表达质粒pL-DsRed-pL-0PH的构建①pL-DsRed 片段和 Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 扩增1) pL-DsRed片段的PCR扩增以pL-DsRed为模板采用PCR扩增pL-DsRed片段， 3615bp。采用pfuDNA聚合酶，扩增体系50 u L，PCR扩增参数设置为94°C预变性3分钟； 94°C，40秒/56°C，35秒/72°C，6分钟10秒(25个循环)；72°C，10分钟。电泳结果如图17 所示。2)Promoter-OPH-terminator 片段的 PCR 扩增以 pL-OPH 为模板采用 PCR 扩增 Promoter-OPH-terminator 片段，2002bp。采用 pfuDNA 聚合酶，扩增体系 50 u L, PCR 扩增 参数设置为94°C预变性3分钟；94°C，40秒/53°C，35秒/72°C，4分钟30秒(25个循环)； 72°C，10分钟。电泳结果如图18所示。②双基因表达质粒pL-DsRed-pL-0PH的构建1)纯化回收利用DNA凝胶回收试剂盒回收纯化pL-DsRed和 Promoter-OPH-terminatorPCR 扩增片段；2)磷酸化利用T4多核苷酸激酶磷酸化Promoter-OPH-terminator片段末端。 按如下体系配置反应管PCR产物片段约25pmol/L，5uL10X T4多核苷酸激酶缓冲液，1 U L 10mmol/LATP, 1 u L T4多核苷酸激酶，用灭菌去离子水补充体积至50 u L。37°C，反应30分 钟。然后65°C，20分钟灭活多核苷酸激酶。酚-氯仿抽提2次。3)连接进行连接的体系如下pL-DSRed片段纯化产物lOOng，磷酸化 Promoter-OPH-terminator 片段 100ng, 1 u L 10 X T4DNA 连接酶缓冲液，0. 5 u L T4 DNA 连 接酶，1.5iiL 30% PEG8000，用水补足体积至10ii L。16°C，反应20h。4)转化及鉴定取8 ii L连接产物转化E. coli DH 5 a ,涂布在含氨苄青霉素的 LB琼脂板，28°C过夜培养。挑单克隆菌落于3mL含氨苄青霉素的液体LB中28 V 200 250r/分钟过夜培养。取1. 5mL菌液进行质粒小量提取，25倍稀释原质粒作为PCR模板，同时扩增DsRed基因片段和opd基因片段，进行PCR验证，电泳结果如图19所示，其中1为 pL-DsRed-pL-OPH, 2 为 pGEM-T_opd，3 为 pDsRed-Nl ；分别利用 Sac I 和 Nco I 进行单酶切 验证，电泳结果如图20所示，其中1为酶切位点Nco I，2为酶切位点Sac I。实施例3 双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH转化菌株本实施例将双基因表达质粒pL-DsRed-pL-OPH转化到菌株中，并对转化菌株进行 了功能鉴定。1、制备质粒转化的菌株采用氯化钙法制备E. coli BL21AI 菌株(Invitrogen公司)感受态细胞，将质粒 pL-DsRed-pL-OPH转入该感受态细胞中，将已转化的感受态细胞转移到含氨苄青霉素抗生 素的LB琼脂培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平皿，于30°C培养，12 16 小时后可出现菌落。所得菌落克隆即为质粒pL-DsRed-pL-OPH转化菌株。2、转化菌株的荧光特性观察将LB培养基琼脂平板上质粒pL-DsRed-pL-OPH转化菌株的克隆持续在30°C培养 约2天后，将平板上的克隆置于荧光显微镜下观察，可见强烈红色荧光，如图2所示，其中其 中A为转化菌株，B为未转化菌株，放大倍数为10X4。继续培养约5天后，在日光下直接观 察就可见克隆呈现红色，如图3所示，其中A为转化菌株，B为未转化菌株。3、制备转化菌株的细胞液体培养物挑取pL-DsRed-pL-OPH转化的E. coli BL21AI 单克隆入含氨苄青霉素的液体LB 中，于30°C振摇培养过夜。次日，以2%比例接种于新的含氨苄青霉素的液体LB培养基中， 继续在30°C培养14h后获得转化菌株的细胞液体培养物。4、制备转化菌株的全细胞蛋白取pL-DsRed-pL-OPH转化的E. coli BL21AI 菌株培养液1. 5mL倒入微量离心管 中，用微量离心机于4°C以12000g离心30秒，弃上清。用IX磷酸盐缓冲液(PBS) (pH 7. 4)洗涤沉淀两遍。加入300 ii L的1 XPBS悬浮沉淀，1/100体积的50mg/mL的溶菌酶，1/100体积的 10% TritonX-100o 30°C温浴 15 分钟。将离心管放置冰上，超声破碎(40Hz，2 3分钟)。所得液体即为全细胞蛋白液。5、转化菌株的全细胞蛋白液的有机磷水解酶活性测定1)蛋白质浓度的测定蛋白质浓度采用Bradford(1976)的方法测定。2)对硝基苯酚标准曲线的制作用50mmol/LTriS-HCl缓冲液(pH 7. 8)将对硝基苯酚稀释成6个浓度梯度(0、30、 60、90、120、150mmol/L)，分别测定400nm的吸光度值，然后以0D-值为纵坐标，对硝基苯酚 浓度为横坐标，绘制标准曲线(见图21)。3)转化菌的0PH活性测定①取30°C培养14小时和放置第4天、第8天的菌样制备全细胞蛋白。②反应体系总体积lmL，50mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7. 8)中含10 y g全细胞蛋 白，3 ii L 50mmol/L的对硫磷，混勻。③30°C反应1. 5小时后用分光光度计测定0D4(1(1值。
根据标准曲线，计算出全细胞蛋白裂解液(TCP，totalcellprotein)的有机磷水 解酶活性，结果如表1所示。表1转化菌株对有机磷农药的降解
权利要求
一种双基因表达质粒，其能同时表达出两种外源基因，该表达质粒包括两组PRPL启动子，分别控制位于其下游的两种外源基因的表达；优选地，所述PRPL是来源于λ噬菌体的受控于温度敏感阻抑物cIts857的热启动子。
2.根据权利要求1所述的双基因表达质粒，其特征在于，所述质粒还包括抗性基因、 复制子及多个酶切位点；优选地，所述抗性基因选自氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性 基因和卡那霉素抗性基因，更优选为氨苄青霉素抗性基因；所述复制子选自PMBl复制子、 CoEl复制子、pSClOl复制子和pl5A复制子，更优选为pMBl复制子；酶切位点选自EcoR I、 BamH I 和 Pst I。
3.根据权利要求1或2所述的双基因表达质粒，其特征在于，在所述外源基因中，至少 包括一种报告基因，优选选自荧光蛋白类基因、半乳糖苷酶基因和荧光素酶基因，更优 选选自荧光蛋白类基因，最优选为红色荧光蛋白基因。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的双基因表达质粒，其特征在于，其中所述外源基 因分别为编码红色荧光蛋白的基因和编码有机磷水解酶的基因。
5.根据权利要求4所述的双基因表达质粒，其特征在于，其具有图IB所示的质粒图谱。
6.根据权利要求4或5所述的双基因表达质粒，其特征在于，其具有如SEQ.ID. NO 1所 示的碱基序列。
7.包含权利要求1至6中任一项所述双基因表达质粒的菌株；优选地，所述菌株的保 藏编号为CGMCC2881。
8.由权利要求7所述菌株制备的细胞液体培养物。
9.由权利要求7所述菌株制备的全细胞蛋白液。
10.权利要求1至6中任一项所述的原核双基因表达质粒在转化不表达温度敏感阻抑 物的菌株中的用途，优选地，所述菌株选自大肠埃希氏菌和假单胞杆菌，更优选为大肠埃希 氏菌。
全文摘要
本发明提供一种双基因表达质粒及其用途。本发明所提供的质粒能够同时表达出两种外源基因，其包括两组来源于λ噬菌体的受控于温度敏感阻抑物cIts857的热启动子PRPL启动子，分别控制位于其下游的两种外源基因的表达。本发明所提供的原核双基因表达质粒，所表达的外源基因分别为编码红色荧光蛋白的基因和编码有机磷水解酶的基因。本发明还利用该质粒构建出生物工程菌，其能不经诱导就表达出目的基因。本发明利用来源于λ噬菌体的热启动子构建了双基因表达质粒，利用该质粒模式可以同时独立表达两种外源目的基因，选择合适的表达菌株则可以避免诱导剂的使用，开阔了以质粒为载体用于生物工程菌构建的应用前景。
文档编号C12N15/63GK101993884SQ20091009128
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月17日 优先权日2009年8月17日
发明者伍一军, 李琴, 李薇 申请人:中国科学院动物研究所