专利名称：一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域。
背景技术：
杨树属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.),属下共分白杨派、大叶杨派、青杨派、黑杨派、胡杨派5派。全世界约有杨树百余种，其自然分布主要是在北半球的温带 和寒带。我国有杨树53种，主要分布在西南，西北，东北及华北地区。杨树基因组较小(约为450 550Mbp),仅为拟南芥基因组的4倍,易于农杆菌介导遗传转化,种间可杂交,被认为是林木生物技术的模式树种。杨属白杨派又分两个亚派白杨亚派和山杨亚派。白杨亚派包括新疆杨(P. bo I Ieana)(银白杨变种)、银灰杨(P. canescens)、毛白杨(P. tomentosa)；山杨亚派包括欧洲山杨(P. tremula L)、美洲山杨(P. tremuloides)、中国山杨(P. devidiana)和响叶杨(P. adenopoda);欧美杂种山杨是欧洲山杨和北美山杨的杂交种，具有生长快、树形高大、材性好等特点；另外该树种材色浅，材质较软、细密、树干端直，是造纸、制备胶合板和刨花板等的优质原料。但是杨树属于多年生树种，要在短时间内通过常规育种培育出杨树新品种是很困难的，且通过传统的杨树育种方法己远远不能满足现代育种的要求，所以利用组织培养技术和基因工程方法来培育抗逆杨树新品种对杨树育种具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法。本发明的技术方案概述如下一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤( I)预培养欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22-24°C、80-100rpm 暗培养 l_2d ；(2)农杆菌的培养①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28°C划线暗培养2_3d ；②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB 液体培养基中于 28 °C、150-200rpm 暗培养 24h，至 0D_ 为 0. 6-0. 8 ；③将步骤②获得的菌液在3000-4000rpm离心8_10min，弃去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD6tltl为0. 4-0. 5，于28°C、80_100rpm继续培养0. 5-lh，得到侵染液；
(3)共培养与芽的诱导①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22-24°C、80-100rpm培养O. 5_2h，转移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固体培养基上，于22-24°C黑暗共培养2d ；②将共培养后的外植体用灭菌的300_400mg/L头孢霉素水溶液清洗2_3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固体培养基在22-24°C，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为400-6001uX，16h/d ;在第8天开始，光照强度为1500-20001ux，16h/d,每14d更换一次培养基；(4)芽的伸长将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm ；
(5)根的诱导将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。步骤(I)中所述1/2MS 培养基包括MS 盐 2. 2g/L，蔗糖 25_30g/L，pH=5. 6-5. 8，琼脂 7. 0-7. 2g/L。步骤(I)中所述MS液体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖25_30g/L，生长素NAA1. 86mg/L,细胞分裂素 2ipl. 02mg/L, pH=5. 6-5. 8。步骤(2)中所述YEB固体培养基包括牛肉浸膏5.(^/1，胰蛋白胨5.(^/1，酵母提取物 I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7H200. 5g/L，琼脂 15g/L，pH=7. 0。步骤(2)中所述YEB液体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物 I. Og/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，pH=7. 0。步骤(3)中所述MSI固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生长素 ΙΒΑ0. lmg/L，细胞分裂素 ΒΑΡ0. 2mg/L,细胞分裂素 TDZ0. 001mg/L pH=5. 6-5. 8，琼脂7. 0-7. 2g/L。步骤(4)中所述MS2固体培养基包括MS盐4.4g/L，蔗糖20_30g/L，生长素ΙΒΑ0. lmg/L,细胞分裂素 ΒΑΡ0. 2mg/L，ρΗ=5· 6-5. 8，琼脂 7. 0-7. 2g/L。本发明的方法从外植体选择、遗传转化条件优化等方面建立欧美杂种山杨高效遗传转化体系，本发明的方法遗传转化效率高。通过建立高效的欧美杂种山杨遗传转化体系，可在短时间内培育出杂种山杨抗逆新品种，对杨树抗性改良和抗逆新品种选育具有一定的理论和实际意义。
图I为诱导剂乙酰丁香酮对诱导欧美杂种山杨(T89杨)Knf芽的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明但不用于对本发明作任何限制。实施例I
一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤( I)预培养T89杨(欧美杂种山杨的一种)在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组 培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22°C、90rpm暗培养Id ；(2)农杆菌的培养①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28°C划线暗培养3d ；②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的70mlYEB液体培养基中于28°C、200rpm暗培养24h，至OD6tltl为O. 8 ;③将步骤②获得的菌液在4000rpm离心8min，弃去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD6tltl为O. 4，于28°C、IOOrpm继续培养O. 5h，得到侵染液；(3)共培养与芽的诱导①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22°C、90rpm培养lh，转移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固体培养基上，于22°C黑暗共培养2d;②将共培养后的外植体用灭菌的300mg/L头孢霉素水溶液清洗3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固体培养基在22°C，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为5001ux, 16h/d ;在第8天开始,光照强度为18001ux, 16h/d,每14d更换一次培养基；(4)芽的伸长将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm ；(5)根的诱导将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。1/2MS 培养基包括MS 盐 2. 2g/L，蔗糖 25g/L，pH=5. 6，琼脂 7. Og/L。MS液体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖25g/L，生长素NAA1. 86mg/L,细胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 6。YEB固体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，琼脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液体培养基包括牛肉浸膏5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖20g/L，生长素IBA0. lmg/L,细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L,细胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 6，琼脂 · 0g/L。MS2固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖20g/L，生长素ΙΒΑ0. lmg/L,细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, ρΗ=5· 6，琼脂 7. 0g/L。实施例2一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤
(I)预培养T89杨(欧美杂种山杨的一种)在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于24°C、80rpm暗培养2d ；(2)农杆菌的培养①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB 固体培养基上于28°C划线暗培养2d ；②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60mlYEB液体培养基中于28 °C、150rpm暗培养24h，至OD6tltl为O. 6 ;③将步骤②获得的菌液在3000rpm离心lOmin，弃去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD6tltl为O. 5，于28°C、80rpm继续培养lh，得到侵染液；(3)共培养与芽的诱导①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于24°C、80rpm培养2h，转移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固体培养基上，于24°C黑暗共培养2d;②将共培养后的外植体用灭菌的350mg/L头孢霉素水溶液清洗2次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固体培养基在24°C，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为6001ux, 16h/d ;在第8天开始,光照强度为15001ux, 16h/d,每14d更换一次培养基；(4)芽的伸长将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm ；(5)根的诱导将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。1/2MS 培养基包括MS 盐 2. 2g/L，蔗糖 28g/L，pH=5. 7，琼脂 7. lg/L。MS液体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖28g/L，生长素NAA1. 86mg/L,细胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 7。YEB固体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，琼脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液体培养基包括牛肉浸膏5. 0g/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固体培养基包括MS盐4.4g/L，蔗糖25g/L，生长素ΙΒΑ0. lmg/L，细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L，细胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 7，琼脂 7. lg/L。MS2固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖25g/L，生长素ΙΒΑ0. lmg/L,细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, pH=5. 7，琼脂 7. lg/L。实施例3一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤(I)预培养T89杨(欧美杂种山杨的一种)在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于24°C、IOOrpm暗培养2d ；(2)农杆菌的培养①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28°C划线暗培养3d ；②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的75mlYEB液体培养基中于28°C、180rpm暗培养24h，至OD6tltl为O. 7 ;③将步骤②获得的菌液在3500rpm离心9min，弃去上清液，用含有100 μ M乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至0D_为O. 5，于28°C、90rpm继续培养lh，得到侵染液；(3)共培养与芽的诱导 ①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于24°C、IOOrpm培养O. 5h，转移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固体培养基上，于24°C黑暗共培养2d;②将共培养后的外植体用灭菌的400mg/L头孢霉素水溶液清洗2次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固体培养基在24°C，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为4001ux, 16h/d ;在第8天开始,光照强度为20001ux, 16h/d,每14d更换一次培养基；(4)芽的伸长将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm ；(5)根的诱导将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。1/2MS 培养基包括MS 盐 2. 2g/L，蔗糖 30g/L，pH=5. 8，琼脂 7. 2g/L。MS液体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖30g/L，生长素NAA1. 86mg/L,细胞分裂素2ipl. 02mg/L, pH=5. 8。YEB固体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7Η200· 5g/L，琼脂 15g/L，pH=7. 0。YEB液体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. 0g/L，酵母提取物I. 0g/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H200. 5g/L, pH=7. 0。MSI固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖30g/L，生长素IBA0. lmg/L,细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L,细胞分裂素 TDZ0. 00lmg/L pH=5. 8，琼脂 · 2g/L。MS2固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖30g/L，生长素ΙΒΑ0. lmg/L,细胞分裂素ΒΑΡ0. 2mg/L, ρΗ=5· 8，琼脂 7. 2g/L。注本发明采用的双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58卿C58/pMP90/pBI121),C58具有利福平抗性，辅助Ti质粒pMP90具有庆大霉素抗性；表达载体pBI121上的卡那霉素抗性基因可作为转基因杨树的筛选基因，编码蛋白具有卡那霉素抗性。实施例4 :不同受体材料对诱导T89杨Knf芽的影响转化受体是一个重要的影响因素，建立一个好的受体系统是基因转化的先决条件。转化受体通常来自于植物的原生质体和外植体组织。外植体组织包括子叶、子叶柄、下胚轴、茎段。杨树的遗传转化中大多选用子叶、茎段。大量的杨树转基因研究表明，杨树叶片是最好的受体材料。但是，也有一些研究发现，茎段的诱导率高于叶片。因此，植物转化中最适的受体材料随着植物的种类不同而不同。本实验采用T89杨带有叶片的叶柄、叶片、茎段三种不同的受体材料，各自的诱导效率如下表表I不同受体材料对诱导T89杨Knf芽的影响
权利要求
1.一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征是包括如下步骤 (1)预培养 欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22-24°C、80-100rpm 暗培养 l_2d ； (2)农杆菌的培养 ①携带双元载体PMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28°C划线暗培养2_3d ； ②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB 液体培养基中于 28 °C、150-200rpm 暗培养 24h，至 0D_ 为 O. 6-0. 8 ； ③将步骤②获得的菌液在3000-4000rpm离心8_10min，弃去上清液，用含有100μ M乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD6tltl为O. 4-0. 5，于28°C、80-100rpm继续培养O.5-lh，得到侵染液； (3)共培养与芽的诱导 ①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22-24°C、80-100rpm培养O.5_2h，转移至含有100 μ M乙酰丁香酮的MSl固体培养基上，于22-24°C黑暗共培养2d ； ②将共培养后的外植体用灭菌的300-400mg/L头孢霉素水溶液清洗2_3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MSl固体培养基在22_24°C，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为400-6001ux，16h/d ;在第8天开始，光照强度为1500_20001ux，16h/d,每14d更换一次培养基； (4)芽的伸长 将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm ； (5)根的诱导 将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。
2.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(I)中所述 1/2MS 培养基包括=MS 盐 2. 2g/L，蔗糖 25_30g/L，pH=5. 6-5. 8，琼脂 7. 0-7. 2g/L0
3.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(I)中所述MS液体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖25-30g/L，生长素NAA1. 86mg/L，细胞分裂素 2ip I. 02mg/L，ρΗ=5· 6-5. 8。
4.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(2)中所述YEB固体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物l.Og/L，蔗糖 5. Og/L, MgSO4. 7H20 O. 5g/L，琼脂 15g/L，pH=7. 0。
5.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(2)中所述YEB液体培养基包括牛肉浸膏5. Og/L，胰蛋白胨5. Og/L，酵母提取物I. Og/L，蔗糖 5. 0g/L, MgSO4. 7H20 0. 5g/L, pH=7. 0。
6.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(3)中所述MSl固体培养基包括:MS盐4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生长素IBA O. lmg/L，细胞分裂素 BAP O. 2mg/L,细胞分裂素 TDZ O. OOlmg/L pH=5. 6-5. 8，琼脂 7. 0-7. 2g/L。
7.根据权利要求I所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤(4)中所述MS2固体培养基包括MS盐4. 4g/L，蔗糖20_30g/L，生长素IBA O. lmg/L，细胞分裂素 BAP O. 2mg/L, pH=5. 6-5. 8，琼脂 7. 0-7. 2g/L。
全文摘要
本发明公开了一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤(1)预培养欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将外植体暗培养；(2)农杆菌的培养携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58培养得到侵染液；(3)共培养与芽的诱导将预培养后的外植体浸于侵染液中培养。本发明的方法从外植体选择、遗传转化条件优化等方面建立欧美杂种山杨高效遗传转化体系，本发明的方法遗传转化效率高。通过建立高效的欧美杂种山杨遗传转化体系，可在短时间内培育出杂种山杨抗逆新品种，对杨树抗性改良和抗逆新品种选育具有一定的理论和实际意义。
文档编号A01H5/00GK102796761SQ201210292958
公开日2012年11月28日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者王洁华, 籍燕, 昝艳君, 杨少辉, 宋英今 申请人:天津大学