的根、茎、叶、花和结荚期的根、茎、叶、荚等样品在液氮中研磨后用Promega RNA提取试剂盒进行总RNA的提取，经DNase I消化去除DNA，并经质量体积分数1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和完整性。cDNA合成采用上海皓嘉科技发展有限公司反转录试剂盒操作流程进行。
[0020]1.3基因克隆
利用RT-PCR方法从大豆幼苗根部组织mRNA中扩增全长0RF，所用正向引物序列为 Primer F:5’ ATGACTCGGCGTTGCTCCCACTGC 3’ 和反向引物序列为 Primer R:5’CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3’，以cDNA为模板扩增基因全长DNA序列，扩增体系为:cDNA或DNA稀释样，适量；5XPS Buffer 5 μ?, 2.5 mmol !/1ClNTPs 2 μ?, 10 mmol I/1 上下游引物各 0.5 μ?, 5 U mL^ 1PimerSTAR DNA 聚合酶 0.25 μ?, ddH20 补足至 25 μ?。反应程序为:98°C预变性3 min;98°C变性5 s，55°C复性10 s，72°C延伸5 min，35个循环；暂停PCR程序，加入 IPL 7? DNA 聚合酶，72°C延伸 10 min。PCR 产物连入 pGEM-T Easy Vector T 克隆试剂盒载体中，送交南京金斯瑞生物科技有限公司测序，获得目的序列。
[0021]1.4序列分析
采用BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测；用Clustal X进行氨基酸序列比对及功能结构域查找与相似序列分析；结果表明，该蛋白氨基酸序列与水稻(Oryza saiira)、拟南芥dahii/oAsisthaliana)、玉米{Zea mays)、苜蓿{Medicago truncatula)、梅花(Rrunus mume)、番前(Solanum lycopersicuid)等的MYB家族基因均有较高的相似性，都在氨基酸111-155之间具有一个保守的SANT结构域，如图1，2所示。
[0022]1.5基因表达分析
采用半定量RT-PCR分析法，根据cDNA序列设计引物，以大豆持家基因(Glycinemax actin-l-like) (GmActin登录号:XM_003552652)为内参，正向引物序列为5’ -CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’，反向引物序列为 5’ -GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’，目的基因正向引物:5’ - AAGGAGACTGGCGTGGGATA _3’；反向引物 5’ - TGATTTGAGGGAGAGATTTA -3’(对大豆基因组进行BLAST结果发现没有其他同源基因，表明基因的特异性);利用提取的幼苗根、茎、叶组织和花以及豆荚的cDNA为模板来进行基因的组织表达分析，如图3所示。
[0023]1.6载体构建
利用酶单切载体PCXSN形成T/A克隆位点，然后利用PCR扩增基因全长0RF，所用正向引物序列为Primer F:5’ ATGACTCGGCGTTGCTCCCACTGC 3’和反向引物序列为PrimerR:5’ CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3’，然后T4连接酶把扩增产物连入酶切后的空载体内，然后用35F正向引物5’-ACTCGCCGTAAAGACTGG -3’和基因反向引物扩增获得方向正确的阳性克隆通过冻融法转入发根农杆菌K599和根癌农杆菌EHA105中，以备后续转化所用，如图4所示。
[0024]运用Hairy Root实验体系，包括离体和在体两类，一类是豆瓣体外菌液注射发根验证；另一类是在体注射菌液发根然后再生苗，获得转基因组合植株后，对它们进行抗或耐旱鉴定；植物过表达载体通过冻融法转入发根农杆菌K599，通过注射的方法获得转基因组合植株(根为转基因，其它为非转基因)，结果发现:过表达6^12?似基因可调节抗旱相关基因和说》2的表达，其中/????基因的表达水平略有下降，而说》7基因均表现为上调表达；同时过表达6^2?似基因可调节异黄酮合成途径中重要调节基因4CL、PAL、CHU CHS、CHR、C4IM //?的表达，并且除。織因表达略有上调外，其他各基因均表现为明显上调；在干旱胁迫下，与空对照植株相比，过表达该基因的转基因植株对PEG(20% m/v)溶液的胁迫具有较强的耐受性，表明该基因在调控异黄酮合成及植物的抗旱耐盐胁迫过程中起着重要作用，如图5、6、7所示。
[0025]2.功能初步鉴定:
2.1植物材料植物材料为大豆幼苗，将大豆种子点播于蛭石:沙子(3:1)的基质中，浇水并在光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)中培养，培养条件为25-28?，每日光照12小时，光照强度为20001uX，待苗长至4-5厘米时以备后续注射所用。
[0026]2.2菌液培养与注射
从平板上挑取单菌落K599 (含GsSIP基因表达载体)置于加有Iml液体LB (附加Kan50mg/L)的15ml管中，28°C摇床上200rpm摇l-2d，然后吸取2ml离心，沉淀用1m M硫酸镁溶液重旋，再离心一次，然后用硫酸镁稀释至0D600约0.8-1.0 ;用0.025ml量程微型注射器吸取菌液，在大豆子叶节部位注射，注射大约3-4个孔，然后放置在加有水的小烧杯内，用塑料膜封口，在光照培养箱中(12h光照/12h黑暗)28°C培养。
[0027]2.3组合苗生长管理
大致培养5-7天时，注射的孔部长出根之后，随后揭掉塑料膜，剪掉原有的根系，在Hoagland营养液中培养至根部足够健壮时为后续研宄所用。
[0028]2.4组合苗阳性植株鉴定
DNA采用CTAB法提取，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。PCR反应总体积为20μ?，模板 DNA(20ng/^L) ?μ?，正反向引物(ΙΟμΜ)各 0.4μ1，1xPCR Buffer 2μ1, MgCl2(25mM)1.6μ1，dNTP(1mM) 1.6μ1，rTaq(5U/^L) 0.2μ1，ddH20 12.8μ1。反应程序 94°C预变性4min，35个循环:94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，72终延伸1min0所用引物为35S 正向引物 5’-ACTCGCCGTAAAGACTGG-3’ ；基因反向引物 5’ CAAGCTCAGACAGCTTGAATT 3’组合扩增来进行验证。结果表明上述植株与对应转基因载体互相对应，即转基因植株可以成功扩增出目的条带且目的基因过量表达，而阴性对照则没有，如图7所示。
[0029]对该基因通过农杆菌介导的方法转入栽培大豆，然后对异黄酮的合成及耐旱关键标志基因的表达进行测定，同时研宄其耐旱的分子机理，创造新的抗或耐旱种质资源，为育种提供桥梁亲本。
[0030]综上所述，本发明人提供的6^2?似基因是首次大豆中分离的新基因，其功能参与了大豆的异黄酮合成及抗、耐旱逆境胁迫的应答。本发明的《/招似基因来自栽培大豆，具有适合于双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物水稻、玉米、小麦外，更加适合于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等。
【主权项】
1.基因或其编码蛋白在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，其特征在于， 所述基因GmMYB62_ SEQ ID NO:1的DNA序列； 所述《TA似的编码蛋白具有SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列，或者具有将SEQ IDNO:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加成为具有转录激活功能的提高植物抗逆性的氨基酸残基序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于:将所述基因6^2?似导入植物组织或细胞，调节异黄酮的合成，提高植物的抗逆性。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:所述的基因通过含有GwMYB6跑植物表达载体导入外植体。5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于:将所述基因似导入植物组织或细胞，调节异黄酮的合成，提高植物的抗逆性。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述的调节异黄酮合成为调节异黄酮合成途径中相关基因的表达；所述的抗逆性为耐干旱性。7.含有权利要求1所述编码基因的表达载体。8.根据权利要求6所述的编码基因的表达载体，其特征在于，用于构建所述植物表达载体的出发载体为任意一种双元农杆菌载体或用于植物微弹轰击的载体。9.含有权利要求1所述编码基因的细胞系。10.含有权利要求1所述编码基因的宿主菌。
【专利摘要】本发明涉及植物的一个GmMYB62基因或其编码蛋白在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，所述的GmMYB62的编码基因来自野生大豆，多重序列比对发现和其他植物的MYB类基因具有较高的保守性。在转基因组合植株中，实时荧光定量 PCR检测结果表明过表达GmMYB62基因能够调节抗旱相关基因的表达，同时调节异黄酮合成相关基因的表达；在干旱胁迫处理下，与对照相比较，转GmMYB62基因的过表达组合植株抗旱性明显提高，表明该基因GmMYB62可作为目的基因导入植物（包括单子叶和双子叶植物），提高植物抗逆性，具有较高的实际应用价值。
【IPC分类】A01H5/00, C07K14/415, C12N5/10, C12N1/21, C12N15/29, C12N15/82
【公开号】CN104946665
【申请号】CN201510364802
【发明人】许玲, 张大勇, 邵宏波, 张玲, 徐照龙, 何晓兰, 黄益洪, 卫陪陪, 郭士伟
【申请人】江苏省农业科学院, 吉林省农业科学院
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年6月26日